易 佳，王登宇，2，3，滕 琰，雷 丹，朱勇娟，向雄滋，劉 過(guò)

（1.懷化學(xué)院生物與食品工程學(xué)院，湖南懷化 418000；2.民族藥用植物資源研究與利用湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南懷化 418000；3.湘西藥用植物與民族植物學(xué)湖南省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南懷化 418000）

皂莢系豆科蘇木亞科的多年生木本植物[1]，其用途非常廣泛，全身都可以加以利用，具有很高的經(jīng)濟(jì)、藥用等方面的價(jià)值[2]。皂莢刺為皂莢樹(shù)的棘刺，又名皂刺、皂角針、天丁等[3]，以極高的藥用價(jià)值被制藥行業(yè)廣泛應(yīng)用，具有消腫排膿、祛風(fēng)殺蟲(chóng)，用于癰疽瘡毒初起或膿成不潰之癥，以及皮癬、麻風(fēng)等[4-5]，具有較高的醫(yī)療保健作用，藥理活性突出[6-8]，是我國(guó)傳統(tǒng)的中藥材。大量研究表明，皂角刺中含有多種化學(xué)成分，主要包括黃酮類(lèi)、酚酸、三萜等結(jié)構(gòu)類(lèi)型[9-11]，具有良好的抗腫瘤、抗菌、免疫調(diào)節(jié)等作用[12-13]，其資源豐富、使用方便、療效確切，日益受到人們的重視。隨著對(duì)皂莢刺研究和應(yīng)用的不斷擴(kuò)大，這一天然植物資源被越來(lái)越多的人所認(rèn)可和接受，開(kāi)發(fā)和利用皂莢刺勢(shì)在必行。

黃酮類(lèi)化合物通常富含在蕓香科、菊科、玄參科等科屬植物的種子、根、莖、葉和漿果中[14]，是藥用植物中的主要活性成分之一。該類(lèi)化合物在人體不能直接合成，只能從食品中獲得，主要作為食品添加劑或直接應(yīng)用于食品中增加其保健作用[15-17]。因此，著重從應(yīng)用角度來(lái)研究食品添加劑對(duì)皂莢刺黃酮穩(wěn)定性的影響，使其作為一種天然可利用資源在食品工業(yè)中發(fā)揮更大作用，并提供一定的理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

皂莢刺，采摘于湖南省懷化市新晃侗族自治縣；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司提供；無(wú)水乙醇、氫氧化鈉、硝酸鋁、亞硝酸鈉、硫酸鎂、硫酸鈣、硫酸鋅、硫酸亞鐵、硫酸銅，均為分析純，湖南匯虹試劑有限公司提供；甜味劑、酸味劑、鮮味劑、防腐劑、食鹽，食品級(jí)。

1.2 儀器與設(shè)備

L5型紫外分光光度計(jì)，上海精科實(shí)業(yè)有限公司產(chǎn)品；KQ-250DA型超聲儀，昆山舒美超聲儀器有限公司產(chǎn)品；高速萬(wàn)能粉碎機(jī)，天津市泰斯特儀器有限公司產(chǎn)品；RE-52A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海亞榮生化儀器有限公司產(chǎn)品；DHG-9015A型電熱鼓風(fēng)干燥箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 皂莢刺黃酮的提取工藝

皂莢刺，除雜清洗，自然晾干后于烘箱中60～65℃條件下烘干至水分含量6%，粉碎過(guò)40目篩，皂莢刺粉末置于干燥器中備用。取2 g皂莢刺粉末于錐形瓶，加入一定料液比的蒸餾水；浸濕皂莢刺粉末，超聲輔助處理一定時(shí)間[18-19]，在一定溫度、時(shí)間下回流，抽濾，濾渣在相同條件下二次回流；再抽濾，合并2次濾液，離心，即得黃酮樣液。

1.3.2 皂莢刺黃酮提取單因素試驗(yàn)

（1） 料液比的選擇。取2.0 g皂莢刺粉末，按照1∶30，1∶40，1∶50，1∶60，1∶70的料液比浸濕，在室溫條件下以250 W的超聲功率處理10 min，然后于70℃下水浴回流40 min。

（2） 提取時(shí)間的選擇。取2.0 g皂莢刺粉末，按照1∶60的料液比浸濕，在室溫條件下以250 W的超聲功率處理10 min，然后分別于70℃下水浴回流20，40，60，80，100 min。

（3） 提取溫度的選擇。取2.0 g皂莢刺粉末，按照1∶60的料液比浸濕，在室溫條件下以250 W的超聲功率處理10 min，然后分別于60，70，80，90，100℃下回流60 min。

（4） 超聲時(shí)間的選擇。取2.0 g皂莢刺粉末，按照1∶60的料液比浸濕，在室溫250 W的超聲條件下處理5，10，15，20，25 min，然后于90℃下回流60 min。

1.3.3 皂莢刺黃酮提取正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，對(duì)料液比、提取時(shí)間、提取溫度和超聲時(shí)間4個(gè)因素進(jìn)行四因素三水平的正交試驗(yàn)。

正交試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

表1 正交試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)

1.3.4 黃酮含量的測(cè)定

（1）蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。精確稱(chēng)取干燥至恒質(zhì)量的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品20.0 mg于100 mL容量瓶中，用70%的乙醇溶解、定容，制成質(zhì)量濃度為200μg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別取質(zhì)量濃度為0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2 mL 200μg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液于10 mL容量瓶中。依次滴加體積分?jǐn)?shù)70%乙醇1 mL，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%亞硝酸鈉溶液0.4 mL，搖勻，放置6 min；加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%硝酸鋁溶液0.4 mL，搖勻，放置6 min；再加入4%氫氧化鈉2 mL，加水至刻度，搖勻，放置15 min。于波長(zhǎng)510 nm處測(cè)定吸光度，以蘆丁對(duì)照品溶液質(zhì)量濃度（C）為橫坐標(biāo)，吸光度（A）為縱坐標(biāo)，繪制蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線[20-21]。

（2）黃酮含量的測(cè)定。準(zhǔn)確吸取樣品黃酮溶液1 mL于10 mL容量瓶中，采用Al(NO3)3-NaNO2-NaOH系統(tǒng)顯色法于波長(zhǎng)510 nm處測(cè)定吸光度，帶入回歸方程并計(jì)算黃酮提取率（%，以蘆丁計(jì)）。

式中：C——測(cè)得的吸光值由標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算而來(lái)的濃度，μg/mL；

n——樣品稀釋倍數(shù)；

V——浸提液的總體積，mL；

m——提取所用的皂莢刺粉末的質(zhì)量，g。

1.3.5 食品添加劑對(duì)皂莢刺黃酮溶液穩(wěn)定性的影響

（1）甜味劑對(duì)皂莢刺黃酮穩(wěn)定性的影響。將提取液分別配制成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.0%，2.5%，5.0%，7.5%，10.0%的葡萄糖、蔗糖、果葡糖漿、甜蜜素和糖精鈉溶液，搖勻，靜置后于波長(zhǎng)510 nm處測(cè)定吸光度。

（2） 酸味劑對(duì)皂莢刺黃酮溶液穩(wěn)定性的影響。將提取液分別配制成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.10%，0.25%，0.50%，0.75%，1.00%的檸檬酸、乳酸、蘋(píng)果酸、酒石酸和富馬酸溶液，搖勻，靜置后于波長(zhǎng)510 nm處測(cè)定吸光度。

（3） 鮮味劑對(duì)皂莢刺黃酮溶液穩(wěn)定性的影響。將提取液分別配制成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.10%，0.15%，0.20%，0.25%，0.50%的谷氨酸鈉、琥珀酸二鈉、5'-鳥(niǎo)苷酸二鈉、5'-肌苷酸二鈉溶液，搖勻，靜置后于波長(zhǎng)510 nm處測(cè)定吸光度。

（4）防腐劑對(duì)皂莢刺黃酮溶液穩(wěn)定性的影響。將提取液分別配制成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%，0.2%，0.3%，0.4%，0.5%的苯甲酸鈉、山梨酸鉀、丙酸鈉、雙乙酸鈉溶液，搖勻，靜置后于波長(zhǎng)510 nm處測(cè)定吸光度。

（5）食鹽對(duì)皂莢刺黃酮溶液穩(wěn)定性的影響。將提取液配制成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.0%，2.5%，5.0%，7.5%，10.0%的食鹽溶液，搖勻，靜置后于波長(zhǎng)510 nm處測(cè)定吸光度。

（6）金屬離子對(duì)皂莢刺黃酮穩(wěn)定性的影響。取樣液9.0 mL，分別加入1.0 mL濃度為0.1～2.0 mol/L的 MgSO4、CaSO4、ZnSO4、FeSO4、CuSO4溶液，一份加入1.0 mL蒸餾水作為對(duì)照，觀察提取液顏色變化及有無(wú)沉淀產(chǎn)生。

2 結(jié)果與分析

2.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線

以蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液質(zhì)量濃度（X）為橫坐標(biāo)，吸光度（Y）為縱坐標(biāo)，獲得蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為：Y=0.009 9X-0.003（R2=0.999 3），式中Y為吸光值，X為溶液質(zhì)量濃度，R2為相關(guān)系數(shù)，蘆丁在0～24μg/mL內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)圖1。

2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.2.1 料液比對(duì)黃酮提取率的影響

料液比對(duì)黃酮提取率的影響見(jiàn)圖2。

由圖2可知，當(dāng)料液比達(dá)到 1∶60（g∶mL）時(shí)，皂莢刺黃酮的提取率最高，隨著提取液增加，總黃酮提取率反而降低，隨后總黃酮提取率的變化不大。這是因?yàn)槿軇┯昧窟m當(dāng)?shù)卦黾?，可加速黃酮的擴(kuò)散運(yùn)動(dòng)，從而使黃酮提取率變大，但是當(dāng)提取溶液的用量過(guò)高時(shí)，很多溶于該提取液的其他成分也大量溶出，阻礙了黃酮的溶出[22]。因此，選擇料液比 1∶60 （g∶mL） 為宜。

2.2.2 提取時(shí)間對(duì)黃酮提取率的影響

提取時(shí)間對(duì)黃酮提取率的影響見(jiàn)圖3。

由圖3可知，當(dāng)提取時(shí)間達(dá)到60 min時(shí)，皂莢刺總黃酮的提取率最高，當(dāng)提取時(shí)間超過(guò)60 min時(shí)，皂莢刺黃酮的提取率逐漸降低。隨著提取時(shí)間的增加，被提取出來(lái)的黃酮類(lèi)化合物可能因不穩(wěn)定而分解導(dǎo)致提取率降低[22]。因此，選擇提取時(shí)間60 min為宜。

2.2.3 提取溫度對(duì)黃酮提取率的影響

提取溫度對(duì)黃酮提取率的影響見(jiàn)圖4。

由圖4可知，皂莢刺黃酮的提取率隨著溫度的升高而增加，而當(dāng)溫度超過(guò)90℃時(shí)，總黃酮的提取率開(kāi)始下降。這是由于溫度升高加速了黃酮類(lèi)化合物的溶出，使得其提取率逐漸增加，但當(dāng)超過(guò)90℃，溫度過(guò)高加速了溶劑的揮發(fā)進(jìn)而影響了該植物中黃酮類(lèi)化合物的提取效果，或者提取過(guò)程中提取溫度過(guò)高可能會(huì)破壞分子結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致提取率降低[22-23]。因此，選擇提取溫度90℃為宜。

2.2.4 超聲時(shí)間對(duì)黃酮提取率的影響

超聲時(shí)間對(duì)黃酮提取率的影響見(jiàn)圖5。

由圖5可知，皂莢刺黃酮的提取率在超聲時(shí)間為10 min時(shí)，黃酮提取率最高，超過(guò)10 min，黃酮含量下降。由于超聲能產(chǎn)生強(qiáng)烈振動(dòng)、高的加速度、強(qiáng)烈的空化效應(yīng)和攪拌作用，加速了有效成分溶出，當(dāng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)時(shí)，黃酮可能遭到破壞[24-25]。因此，選擇超聲時(shí)間為10 min為宜。

2.3 正交試驗(yàn)結(jié)果與分析

正交試驗(yàn)見(jiàn)表2。

表2 正交試驗(yàn)

由表2可知，影響皂莢刺黃酮提取率的因素主次順序?yàn)樘崛囟龋–） ＞提取時(shí)間（B） ＞超聲時(shí)間（D） ＞料液比（A）；試驗(yàn)的最優(yōu)組合為A2B3C1D3，即皂莢刺黃酮提取率的最優(yōu)提取工藝為料液比1∶60，超聲時(shí)間15 min，于80℃下水浴回流80 min，按照優(yōu)化工藝進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，皂莢刺中黃酮提取率為4.57%，說(shuō)明優(yōu)選的提取工藝穩(wěn)定可行。

2.4 食品添加劑對(duì)皂莢刺黃酮溶液穩(wěn)定性的影響

2.4.1 甜味劑對(duì)皂莢刺黃酮溶液穩(wěn)定性的影響

甜味劑對(duì)黃酮溶液穩(wěn)定性的影響見(jiàn)圖6。

由圖6可知，甜味劑質(zhì)量分?jǐn)?shù)從1%到10%時(shí)，對(duì)皂莢刺黃酮溶液的穩(wěn)定性影響結(jié)果為葡萄糖、糖精鈉對(duì)皂莢刺黃酮的穩(wěn)定性影響?。徽崽?、果葡糖漿和甜蜜素對(duì)皂莢刺黃酮的穩(wěn)定性影響大，當(dāng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞1%時(shí)，穩(wěn)定性影響明顯增大。

2.4.2 酸味劑對(duì)皂莢刺黃酮溶液穩(wěn)定性的影響

酸味劑對(duì)黃酮溶液穩(wěn)定性的影響見(jiàn)圖7。

由圖7可知，酸味劑中檸檬酸、蘋(píng)果酸和酒石酸對(duì)皂莢刺黃酮溶液的穩(wěn)定性影響不大；乳酸和富馬酸對(duì)皂莢刺黃酮溶液的穩(wěn)定性影響很大；當(dāng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于0.25%時(shí)，不穩(wěn)定現(xiàn)象越來(lái)越明顯，尤其富馬酸影響最大，富馬酸黃酮溶液有明顯渾濁、白色沉淀現(xiàn)象。

2.4.3 鮮味劑對(duì)皂莢刺黃酮溶液穩(wěn)定性的影響

鮮味劑對(duì)皂莢刺黃酮溶液穩(wěn)定性的影響見(jiàn)圖8。

由圖8可知，谷氨酸鈉、琥珀酸二鈉對(duì)皂莢刺黃酮溶液的穩(wěn)定性良好；5'-鳥(niǎo)苷酸二鈉和5'-肌苷酸二鈉隨著質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，對(duì)皂莢刺黃酮溶液穩(wěn)定性有較大影響。

2.4.4 防腐劑對(duì)皂莢刺黃酮溶液穩(wěn)定性的影響

防腐劑對(duì)皂莢刺黃酮溶液穩(wěn)定性的影響見(jiàn)圖9。由圖9可知，山梨酸鉀、苯甲酸鈉、丙酸鈉和雙乙酸鈉4種防腐劑對(duì)皂莢刺黃酮溶液的穩(wěn)定性影響不大，從低質(zhì)量分?jǐn)?shù)到高質(zhì)量分?jǐn)?shù)黃酮溶液較穩(wěn)定。

2.4.5 食鹽對(duì)皂莢刺黃酮溶液穩(wěn)定性的影響

食鹽對(duì)皂莢刺黃酮溶液穩(wěn)定性的影響見(jiàn)圖10。

由圖10可知，食鹽對(duì)皂莢刺黃酮溶液的穩(wěn)定性影響較小。在質(zhì)量分?jǐn)?shù)＜1%時(shí)，溶液吸光值基本無(wú)變化；在質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞1%時(shí)，溶液穩(wěn)定性稍稍變差，但不顯著。

2.4.6 金屬離子對(duì)皂莢刺黃酮溶液穩(wěn)定性的影響

金屬離子對(duì)黃酮穩(wěn)定性的影響見(jiàn)表3。

由表3可知，皂莢刺黃酮溶液對(duì)Zn2+是穩(wěn)定的，對(duì) Fe2+、Ca2+、Cu2+不穩(wěn)定。

3 結(jié)論

水浴回流提取皂莢刺黃酮，優(yōu)化得出最佳提取工藝為料液比1∶60（g∶mL），超聲時(shí)間15 min，提取溫度80℃，提取時(shí)間80 min，此條件下皂莢刺黃酮提取率為4.57%。穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果表明，葡萄糖、糖精鈉、檸檬酸、蘋(píng)果酸、酒石酸、谷氨酸鈉、琥珀酸二鈉、山梨酸鉀、苯甲酸鈉、丙酸鈉、雙乙酸鈉、食鹽、Zn2+對(duì)皂莢刺黃酮溶液的穩(wěn)定性影響小；而蔗糖、果葡糖漿、甜蜜素、乳酸、富馬酸、5'-鳥(niǎo)苷酸二鈉、5'-肌苷酸二鈉、Fe2+、Ca2+、Cu2+對(duì)皂莢刺黃酮溶液的穩(wěn)定性影響較大。

皂莢刺水浴提取成本低、操作方便，研究其穩(wěn)定性，為今后黃酮應(yīng)用于食品加工與開(kāi)發(fā)中，減少食品添加劑對(duì)黃酮的破壞，保留其在食品中的功效，具有積極意義。

表3 金屬離子對(duì)黃酮穩(wěn)定性的影響