田甜，張雅琳，潘攀，孫勁松，王新惠*，劉洋

1. 成都農(nóng)業(yè)科技職業(yè)學(xué)院（成都 611130）；2. 成都大學(xué)肉類加工四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（成都 610106）

香腸具有悠久的歷史，中國傳統(tǒng)的香腸依靠的是自然環(huán)境中的微生物進(jìn)行發(fā)酵，而在德國、意大利等國家制作的香腸是有添加微生物發(fā)酵劑，并且發(fā)酵香腸較傳統(tǒng)香腸具有較高質(zhì)量。近幾年，香腸作為消費(fèi)者喜愛的發(fā)酵食品，其食用安全性受到關(guān)注，因?yàn)樵谧匀话l(fā)酵環(huán)境中會有某些有害微生物會產(chǎn)生有害物質(zhì)，從而對人體健康造成傷害，如組胺會導(dǎo)致人體產(chǎn)生暈厥、嘔吐等急性中毒癥狀，殘留的亞硝酸鹽可以和胺類物質(zhì)生成亞硝胺，從而誘發(fā)胃部等發(fā)生癌變。研究學(xué)者發(fā)現(xiàn)通過添加微生物發(fā)酵劑，不僅可以改善香腸的品質(zhì)，還可以提高香腸的安全性，李婧等[1]在香腸中接種清酒乳桿菌（Lactobacillus sakei），發(fā)現(xiàn)香腸的感官性提高，并且有害物質(zhì)減少；Corral等[2]發(fā)現(xiàn)接種漢遜德巴利酵母（Debaryomyces hansenii）可以彌補(bǔ)因?yàn)榈望}低脂給香腸帶來的感官上的缺點(diǎn)。Cavicchioli等[3]和孫燕菲等[4]發(fā)現(xiàn)戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus）在發(fā)酵食品中能抑制金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）和單核細(xì)胞李斯特菌（Listeria monocytogenes）等有害微生物的生長。

試驗(yàn)加入復(fù)合發(fā)酵劑，由清酒乳酸桿菌（Lactobacillus sakei）、戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus）、木糖葡萄球菌（Staphylococcus xylosus）、漢遜德巴利酵母（Debaryomyces hansenii）、肉葡萄球菌（Staphylococcus carnosus）制成，并且由自然發(fā)酵的香腸作為對照組進(jìn)行對比，研究復(fù)合發(fā)酵劑對香腸的理化指標(biāo)和安全性指標(biāo)的影響，旨在為提高傳統(tǒng)香腸的食用安全性提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 原輔料

衛(wèi)生檢疫合格的新鮮豬肉、腸衣、食用級食鹽、味精、蔗糖等均購于成都龍泉驛區(qū)成都大學(xué)十陵鑫大百貨超市。

1.2 復(fù)合發(fā)酵劑

清酒乳酸桿菌（Lactobacillus sakei）、戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus）、木糖葡萄球菌（Staphylococcus xylosus）、漢遜德巴利酵母（Debaryomyces hansenii）和肉葡萄球菌（Staphylococcus carnosus）均由肉類加工四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室從自然發(fā)酵的香腸中分離獲得，5種菌以1∶1∶1∶1∶1比例制作成凍干粉。

1.3 主要試劑

磷酸組胺標(biāo)準(zhǔn)品和衍生劑丹磺酰氯（Sigma公司）；乙腈（Bessldorf公司）；正丁醇、甲醇、三氯甲烷、乙酸、乙酸銨、丙酮、三氯乙酸、氫氧化鈉、乙醚、氯化鈉、鹽酸、亞硝酸鈉、谷氨酸鈉、亞鐵氰化鉀、氫氧化鉀、酚酞、乙醇、乙酸鋅、對氨基苯磺酸等（均為國產(chǎn)分析純，成都市科隆化學(xué)品有限公司）。

1.4 主要儀器與設(shè)備

Testo 205肉類專用pH計(jì)（德國儀表國際貿(mào)易（上海）有限公司）；JA3103N電子天平（上海民橋精密科學(xué)儀器有限公司）；RC-III-20L超純水機(jī)（成都瑞昌儀器制造有限公司）；HD-3A型智能水分活度儀（無錫市華科儀器儀表有限公司）；DZKW-4電子恒溫水浴鍋（北京中興偉業(yè)儀器有限公司）；721可見分光光度計(jì)（上海菁華科技儀器有限公司）；LD-5離心機(jī)（江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司）。

1.5 香腸制作

1.5.1 香腸配方

瘦肉與肥肉比例為3∶1，其他輔料比重按照肉的質(zhì)量為蔗糖0.3%、鹽2.6%、水5%、葡萄糖0.4%、NaNO2150 mg/kg、抗壞血酸（維生素C）0.06%、添加復(fù)合發(fā)酵劑0.04%，不添加其他香辛料。

1.5.2 工藝流程

原料肉→修整→腌制→絞碎→拌料→灌腸→發(fā)酵→成熟

1.5.3 操作要點(diǎn)

將豬肉切成1.5～2.0 mm左右同樣大小的肉丁，將切好的肉丁在冰箱冷藏室（3～7 ℃）冷藏24 h，加入調(diào)料，混合均勻后在低溫下腌制24 h；直投入凍干復(fù)合發(fā)酵劑，接種量0.04%，采用手工灌腸，每節(jié)香腸約10 cm，用針扎香腸中氣泡；灌好的香腸掛放在恒溫恒濕發(fā)酵箱中，控制發(fā)酵溫度在20～25 ℃之間，相對濕度在91%～96%之間，進(jìn)行發(fā)酵3 d，控制溫度在16～18 ℃之間，相對濕度在75%～80%之間，直到香腸成熟，以自然發(fā)酵為對照。

1.6 試驗(yàn)方法

1.6.1 pH的測定

采用德國Testo 205 pH計(jì)肉類專用穿刺電極插入香腸前、中、后部，重復(fù)測定3次，取平均值。

1.6.2AW值的測定

取香腸前、中、后3部分的肉進(jìn)行切碎，并且混勻，每次稱取5 g肉平鋪在水分活度儀測定盒的底部，稱定3次，取平均值。

1.6.3 酸價(jià)的測定

參照GB/T 5009.37《食用植物油衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)的分析方法》[5]測定香腸中的酸價(jià)。

1.6.4 亞硝酸鹽的測定

依據(jù)GB/T 5009.33—2011[6]的方法測定香腸中亞硝酸鹽含量。

1.6.5 組胺的測定

參考王新惠等[7]的方法測定香腸中的組胺含量。

1.7 數(shù)據(jù)分析

每個(gè)樣品做3次平行檢測。數(shù)據(jù)分析采用Matlabver.2006b和Microsoft Excel。所有數(shù)據(jù)由平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差組成。

2 結(jié)果與分析

2.1 復(fù)合發(fā)酵劑對香腸pH的影響

自然發(fā)酵香腸和接種復(fù)合發(fā)酵劑香腸的pH隨著時(shí)間變化如圖1所示。結(jié)果表明，自然發(fā)酵香腸和接種復(fù)合發(fā)酵劑香腸的pH隨著時(shí)間先降低后升高，最后再降低。在發(fā)酵初期，接種復(fù)合發(fā)酵劑香腸的pH下降的速度和時(shí)間比對照組快，是因?yàn)閺?fù)合發(fā)酵劑中有戊糖片球菌和清酒乳酸桿菌，可以利用碳水化合物產(chǎn)生大量乳酸[8]，發(fā)酵環(huán)境中的微生物發(fā)酵劑在前期快速增長，所以導(dǎo)致發(fā)酵環(huán)境的pH迅速下降。在發(fā)酵后期，自然發(fā)酵香腸和接種復(fù)合發(fā)酵劑香腸的pH均有所上升，可能的原因是低pH發(fā)酵環(huán)境雖然會抑制有害微生物增長，但是也會影響乳酸菌代謝，并且發(fā)酵環(huán)境中的蛋白質(zhì)分解生成的堿性物質(zhì)對發(fā)酵環(huán)境的酸有一定緩沖作用，所以發(fā)酵環(huán)境中的pH有短暫上升趨勢。

從圖1可知，在第18天時(shí)，自然發(fā)酵香腸的pH 5.34，而接種復(fù)合發(fā)酵劑香腸的pH 5.14，接種復(fù)合發(fā)酵劑香腸的pH比自然發(fā)酵香腸的pH低3.75%。pH是屬于防止食品腐敗的柵欄因子，在傳統(tǒng)香腸中檢測出有發(fā)光桿菌屬（Photobacteriumspp.）、環(huán)絲菌屬（Brochothrixspp.）和假單胞菌屬（Pseudomonasspp.）等幾種腐敗菌屬[9]，所以降低香腸的pH不僅可以抑制腐敗菌生長，也可以降低發(fā)酵環(huán)境中酶活性，有利于提高香腸的食用安全性、增長其貯藏期。

圖1 復(fù)合發(fā)酵劑對香腸pH的影響

2.2 復(fù)合發(fā)酵劑對香腸AW的影響

自然發(fā)酵香腸和接種復(fù)合發(fā)酵劑香腸的AW值隨著發(fā)酵時(shí)間變化如圖2所示。自然發(fā)酵香腸和接種復(fù)合發(fā)酵劑香腸的AW值均隨著時(shí)間而降低，在發(fā)酵后期，接種復(fù)合發(fā)酵劑香腸的AW值比自然發(fā)酵香腸降得更低，Nie等[10]和Aro等[11]發(fā)現(xiàn)戊糖片球菌、清酒乳桿菌和肉葡萄球菌可以加強(qiáng)蛋白酶活性，從而加強(qiáng)蛋白質(zhì)的水解，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)被破壞，導(dǎo)致蛋白質(zhì)的保水性降低，所以接種復(fù)合發(fā)酵劑香腸的AW值低于自然發(fā)酵香腸的AW值。

從圖2可以看出，在第18天時(shí)，自然發(fā)酵香腸的AW值是0.828，而接種復(fù)合發(fā)酵劑香腸的AW值是0.806，接種復(fù)合發(fā)酵劑香腸的AW值比自然發(fā)酵香腸低2.66%，發(fā)酵環(huán)境中的AW值的降低不僅會影響許多腐敗菌的生長[12]，并且還可以影響許多需要水參與的生化反應(yīng)。生活中的面粉、奶粉等產(chǎn)品就是依靠降低AW值而增加貯藏期和抑制有害微生物生長，從而提高食用安全性，可見AW值對食品保藏和食品安全的重要性。結(jié)果表明，對香腸添加復(fù)合發(fā)酵劑會提高香腸的微生物安全性。

圖2 復(fù)合發(fā)酵劑對香腸AW的影響

2.3 復(fù)合發(fā)酵劑對香腸酸價(jià)的影響

自然發(fā)酵香腸和接種復(fù)合發(fā)酵劑香腸的酸價(jià)隨著發(fā)酵時(shí)間變化如圖3所示。結(jié)果表明，試驗(yàn)組和對照組的酸價(jià)均隨著時(shí)間而增加，但是接種復(fù)合發(fā)酵劑的香腸酸價(jià)始終低于自然發(fā)酵的香腸。脂肪的氧化分為2步，第1步是脂肪的水解過程，脂肪水解成游離的脂肪酸，第2步是脂肪酸被氧化成醛、酮等小分子物質(zhì)，而香腸的風(fēng)味主要來源于這些酯、酮分子。在復(fù)合發(fā)酵中的漢遜德巴利酵母能加強(qiáng)香腸的風(fēng)味，可以產(chǎn)生酯、醇和酮類等風(fēng)味物質(zhì)，并且研究發(fā)現(xiàn)，漢遜德巴利酵母也可以抑制香腸的氧化和酸敗[13]。復(fù)合發(fā)酵劑中的肉葡萄球菌和木糖葡萄球菌能幫助香腸產(chǎn)生良好風(fēng)味[14]。香腸適度的脂肪氧化能帶來風(fēng)味，但是氧化過度，不僅會影響香腸感官，也會造成食物浪費(fèi)。

從圖3可以看出，自然發(fā)酵香腸在發(fā)酵結(jié)束時(shí)酸價(jià)是1.41 mg/kg，而接種復(fù)合發(fā)酵劑香腸在發(fā)酵結(jié)束時(shí)酸價(jià)是1.34 mg/kg，接種復(fù)合發(fā)酵劑香腸酸價(jià)比自然發(fā)酵香腸的酸價(jià)低4.96%。因此，添加復(fù)合發(fā)酵劑可以降低香腸的過度氧化情況出現(xiàn)，并且可以賦予香腸良好風(fēng)味。

圖3 復(fù)合發(fā)酵劑對香腸酸價(jià)的影響

2.4 復(fù)合發(fā)酵劑對香腸亞硝酸鹽殘留量的影響

自然發(fā)酵香腸和接種復(fù)合發(fā)酵劑香腸中的亞硝酸鹽殘留量隨著發(fā)酵時(shí)間變化如圖4所示。結(jié)果表明，2種香腸的亞硝酸鹽殘留量均先升高后再降低。在第8天時(shí)，2種香腸的亞硝酸鹽殘留量達(dá)到最大值，剛開始亞硝酸鹽的殘留升高的原因可能是整個(gè)發(fā)酵環(huán)境都是在開放環(huán)境，在起始的發(fā)酵環(huán)境中由于菌群結(jié)構(gòu)復(fù)雜，雜菌也會很多，所以發(fā)酵環(huán)境中的雜菌將硝酸鹽轉(zhuǎn)化成亞硝酸鹽，香腸中亞硝酸鹽的殘留量是呈增加的趨勢。在后期，亞硝酸鹽的殘留量降低的原因可能是環(huán)境中pH下降，抑制雜菌代謝，并且亞硝酸鹽在酸性條件下可以生成亞硝酸，從而與肌紅蛋白反應(yīng)，最后發(fā)酵環(huán)境中的亞硝酸鹽的殘留量降低。復(fù)合發(fā)酵劑中的清酒乳酸桿菌可以降低亞硝酸鹽的殘留[15]，有研究學(xué)者發(fā)現(xiàn)木糖葡萄球菌的過氧化氫酶能將亞硝酸鹽分解成為氨[16]。所以在發(fā)酵后期，香腸中的亞硝酸鹽殘留量降低，并且添加復(fù)合發(fā)酵劑香腸的亞硝酸鹽殘留量低于自然發(fā)酵香腸。

從圖4可知，自然發(fā)酵香腸最后的亞硝酸鹽殘留量是1.56 mg/kg，而接種復(fù)合發(fā)酵劑香腸亞硝酸鹽殘留量是1.08 mg/kg，接種復(fù)合發(fā)酵劑香腸亞硝酸鹽殘留量比自然發(fā)酵香腸低30.77%。亞硝酸鹽因?yàn)榫哂幸志?、抗氧化和著色等功能被廣泛使用，但是亞硝酸鹽能和次級胺生成亞硝胺，亞硝胺會誘發(fā)癌癥，尤其是在胃部[17]?？梢钥闯?，添加復(fù)合發(fā)酵劑可以降低亞硝酸鹽在香腸中的殘留量，有利于提高香腸的食用安全性。

2.5 復(fù)合發(fā)酵劑對香腸組胺含量的影響

自然發(fā)酵香腸和接種復(fù)合發(fā)酵劑香腸的組胺含量隨發(fā)酵時(shí)間變化如圖5所示。結(jié)果表明，自然發(fā)酵和接種復(fù)合發(fā)酵劑香腸的組胺含量均為先升高后降低。組胺的形成必須要有前體物質(zhì)，游離的組氨基酸，還必須要有能產(chǎn)生氨基酸脫羧酶的微生物，研究學(xué)者在香腸、調(diào)味品以及魚肉等產(chǎn)品中均發(fā)現(xiàn)組胺的存在[18-19]。初始階段，香腸內(nèi)組胺含量升高，可能是因?yàn)榘l(fā)酵環(huán)境中菌群較復(fù)雜，再加上香腸富含蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)分解產(chǎn)生游離的組氨基酸，發(fā)酵環(huán)境中的雜菌產(chǎn)生組氨基酸脫羧酶作用于組氨基酸，所以前期的組胺含量快速增長。但在后期，因?yàn)槿樗峋鲩L，導(dǎo)致發(fā)酵環(huán)境pH下降，影響氨基酸脫羧酶的活性和雜菌的生長代謝，所以組胺增長得到抑制，并且香腸中有許多微生物可以產(chǎn)生組胺降解酶而減少組胺含量。復(fù)合發(fā)酵中的清酒乳酸桿菌和木糖葡萄糖球菌可以降低香腸中的組胺[20]，所以在后期，添加復(fù)合發(fā)酵劑香腸中的組胺含量會低于自然發(fā)酵香腸。

從圖5可知，自然發(fā)酵香腸在發(fā)酵結(jié)束時(shí)組胺含量為1.72 mg/kg，接種復(fù)合發(fā)酵劑香腸在發(fā)酵結(jié)束時(shí)組胺含量是1.43 mg/kg，接種香腸比自然發(fā)酵香腸的組胺含量低16.86%。組胺是生物胺中危害性較強(qiáng)的，并且在發(fā)酵食品中組胺是常見生物胺，結(jié)果表明，在香腸中添加復(fù)合發(fā)酵劑可以減少組胺生成，提高香腸的食用安全性。

圖4 復(fù)合發(fā)酵劑對香腸亞硝酸鹽含量的影響

圖5 復(fù)合發(fā)酵劑對香腸組胺含量的影響

3 結(jié)論

近幾年，頻發(fā)的食品問題將食品安全推向風(fēng)口浪尖，香腸作為中國傳統(tǒng)的發(fā)酵食品，深受消費(fèi)者喜愛，試驗(yàn)在制作香腸過程中，添加由清酒乳酸桿菌（Lactobacillus sakei）、戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus）、木糖葡萄球菌（Staphylococcus xylosus）、漢遜德巴利酵母（Debaryomyces hansenii）、肉葡萄球菌（Staphylococcus carnosus）制成的復(fù)合發(fā)酵劑，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，添加復(fù)合發(fā)酵劑的香腸在pH和AW比自然發(fā)酵的香腸低3.75%和2.66%；減少香腸中有害物質(zhì)組胺和亞硝酸鹽含量，在發(fā)酵結(jié)束時(shí)，復(fù)合發(fā)酵香腸的組胺和亞硝酸鹽含量分別是1.43和1.08 mg/kg，比自然發(fā)酵香腸低16.86%和30.77%；并且能增強(qiáng)香腸風(fēng)味，延緩香腸氧化，復(fù)合發(fā)酵香腸的酸價(jià)是1.34 mg/kg，比自然發(fā)酵香腸的酸價(jià)低4.96%。

有研究學(xué)者通過在傳統(tǒng)香腸中接種單一的發(fā)酵劑來提高香腸的食用安全性，但無法彌補(bǔ)因?yàn)樘岣甙踩远鴰淼娘L(fēng)味和感官上的缺失。試驗(yàn)采用復(fù)合發(fā)酵劑，能保證香腸品質(zhì)且提高食用安全性，試驗(yàn)旨在改善香腸傳統(tǒng)工藝，為廣大消費(fèi)者提供風(fēng)味獨(dú)特及安全的發(fā)酵食品。