張巧 ，柯博芳，唐小閑 ，段振華 *

1. 賀州學(xué)院食品與生物工程學(xué)院（賀州 542899）；2. 賀州學(xué)院食品科學(xué)與工程技術(shù)研究院（賀州 542899）；3. 廣西果蔬保鮮和深加工研究人才小高地（賀州 542899）

大果山楂又名麻缺頓、廣西楂（商品名）等，為薔薇科蘋果亞科蘋果屬植物，其果形大，果面光滑明艷，性微溫，味甘、酸、澀[1-2]。大果山楂含有多種酚類活性成分，具有降低血清膽固醇和甘油脂，降壓利尿和鎮(zhèn)靜等藥用價(jià)值，是難得的藥食兩用食品[3]。目前，以大果山楂作為生產(chǎn)原料的產(chǎn)品有山楂干片、山楂糕、山楂醋等，而山楂酵素這種生物發(fā)酵制品卻很少見，與之相關(guān)的文獻(xiàn)也不多。

酵素是一種微生物發(fā)酵產(chǎn)品，擁有許多生物活性成分，對(duì)于人體生命現(xiàn)象的運(yùn)動(dòng)有一定的作用。酵素?fù)碛衅渌嬃纤鶝]有的獨(dú)特風(fēng)味、香味和滋味，且富含豐富的酶類（超氧化物歧化酶、蛋白酶、纖維素酶等）、酚類、有機(jī)酸類等對(duì)人體有益的生物活性物質(zhì)，還具有抗菌、抗炎、凈化、分解消化、潤腸通便等作用[4]?，F(xiàn)今，隨著人們認(rèn)識(shí)到酵素食品的重要性，我國在逐步加快酵素產(chǎn)品的研究。新型的酵素食品將原料擴(kuò)展為蔬菜、水果、菇類等，酵母菌、乳酸菌和霉菌是其發(fā)酵的主要微生物。這些有益菌通過促進(jìn)一些生化反應(yīng)的進(jìn)行，有助于實(shí)現(xiàn)糖類、脂質(zhì)、蛋白質(zhì)之間相互轉(zhuǎn)化[5]。此外，有益菌還可以對(duì)原有的一些不良風(fēng)味進(jìn)行改進(jìn)，產(chǎn)生一些新的功能成分，且酵素食品的功能保健作用增強(qiáng)。王瑾等[6]研究的桑葚酵素就是利用乳酸茵、酵母菌和其他益生菌在特定條件下發(fā)酵桑葚原汁得到的一種營養(yǎng)豐富、口感俱佳且美容養(yǎng)顏的功能性發(fā)酵飲品。另外，賈麗麗等[7]以酵母菌和乳酸菌發(fā)酵冬棗泥得到的冬棗酵素，香氣濃郁，酸甜可口，品質(zhì)得到較大的提升。莫大美等[8]研究，由酵母菌、乳酸菌和醋酸菌發(fā)酵的玫瑰酵素比酵母菌和乳酸菌發(fā)酵的更優(yōu)。由此可見，不同發(fā)酵菌種對(duì)酵素品質(zhì)有著較為重要的影響。

研究通過自然發(fā)酵、單菌種（酵母菌）發(fā)酵、雙菌種（酵母菌+醋酸菌）發(fā)酵以及三菌種（酵母菌+醋酸菌+乳酸菌）發(fā)酵來探索這些發(fā)酵菌種對(duì)大果山楂酵素品質(zhì)的影響，為大果山楂酵素工藝的研發(fā)提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大果山楂，賀州泰和水果店購買；福林酚試劑（分析純）：北京索萊寶科技有限公司；2, 2-聯(lián)苯基-1-苦基阱基（2, 2-Diphenyl-1-picryldrazyl，DPPH）即（分析純）：上海麥克林生化科技有限公司；沒食子酸（分析純）：天津市大茂化學(xué)試劑廠；酚酞（分析純）：成都市科龍化工試劑廠；無水乙醇、無水碳酸鈉、重鉻酸鉀、三羥甲基氨基甲烷等（分析純）：廣東光華科技股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

立式壓力蒸汽滅菌器，重慶雅瑪拓科技有限公司；SW-CJ-1F潔凈工作臺(tái)，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；高速冷凍離心機(jī)，Eppendorf公司；722N型可見分光光度計(jì)，上海儀電分析儀器有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 菌種的培養(yǎng)

酵母菌：馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基，接種后在30 ℃、180 r/min條件下培養(yǎng)36～48 h。

乳酸菌：MRS培養(yǎng)基，接種后30 ℃培養(yǎng)24～48 h。

醋酸菌：醋酸菌培養(yǎng)基，接種后在30 ℃、180 r/min條件下培養(yǎng)24～48 h。

1.3.2 大果山楂酵素的制備

大果山楂→清洗干凈→切塊、去核、去?！}水護(hù)色→清水漂洗→接種→裝瓶→加糖→消毒封口→發(fā)酵→酵素

操作要點(diǎn)：把大果山楂切成4塊，去核去梗，放入0.1%鹽水中護(hù)色，然后撈出沖洗，瀝干。將大果山楂果肉和白砂糖紫外處理45 min，分別接種果肉質(zhì)量3%的酵母菌、1.5%酵母菌+1.5%醋酸菌、1%酵母菌+1%醋酸菌+1%乳酸菌、等量無菌水，裝入滅菌后的發(fā)酵瓶中，再在中、上層鋪入白糖，大果山楂與白糖質(zhì)量比3∶1，消毒封口，發(fā)酵，發(fā)酵過程中，每6 d取樣。將所取大果山楂酵素樣品離心（12 000 r/min，10 min，10 ℃），測定上清液的總酸度、酒精度、總酚含量、DPPH自由基清除率、羥自由基清除率、SOD酶活力及感官評(píng)分。

1.3.3 總酸的測定

參照GB 5009.239—2016測定酵素中的酸度。

1.3.4 總酚含量的測定

總酚含量的測定采用Folin-酚試劑法，具體參考文獻(xiàn)[9]，并稍作修改。取0～0.02 mg/mL的沒食子酸進(jìn)行總酚標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定，得線性回歸方程為：y=1.579 3x+0.013 4（x是沒食子酸濃度，y是吸光度），R2=0.998。根據(jù)總酚標(biāo)準(zhǔn)曲線方程和樣液中的吸光度測定酵素中的總酚濃度。

1.3.5 SOD活力的測定

根據(jù)鄰苯三酚自氧化法[10]測定SOD，詳細(xì)做法參照表1，在波長325 nm處每隔15 s測定1次吸光度A0，抑制率和SOD活力分別按照公式（1）和（2）進(jìn)行計(jì)算。

表1 鄰苯三酚自氧化速率測定加樣表

式中：V1為反應(yīng)液的總體積，mL；V2為所測樣品體積，mL；ΔA0為鄰苯三酚自氧化速率；ΔASOD為樣品光密度值變化速率；n為稀釋倍數(shù)。

1.3.6 酒精度的測定

采用重鉻酸鉀比色法[11]對(duì)酵素中的酒精度進(jìn)行測定。取體積分?jǐn)?shù)0～0.1%的乙醇進(jìn)行酒精度標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定，得線性回歸方程為：y=1.517 7x+0.006 2（x是乙醇體積分?jǐn)?shù)，y是吸光度），R2=0.993。根據(jù)酒精度標(biāo)準(zhǔn)曲線方程和樣液中的吸光度測定酵素中的酒精度。

1.3.7 DPPH自由基清除能力的測定

DPPH自由基清除能力的測定具體參照文獻(xiàn)[12]。

1.3.8 感官評(píng)審標(biāo)準(zhǔn)

參照表2對(duì)酵素產(chǎn)品進(jìn)行感官評(píng)定，具體的感官評(píng)定人員均為食品專業(yè)人士，并嚴(yán)格按照評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評(píng)分，然后給出相應(yīng)的分?jǐn)?shù)。

表2 感官評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)[13]

1.3.9 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)均為3次以上重復(fù)試驗(yàn)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差，使用Origin 8.0進(jìn)行作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同發(fā)酵菌種對(duì)大果山楂酵素中總酸的影響

酸度是衡量大果山楂酵素發(fā)酵成熟度的主要指標(biāo)，同時(shí)也是反應(yīng)大果山楂發(fā)酵液品質(zhì)的重要理化指標(biāo)[14]。由圖1可知，自然發(fā)酵、單菌種、雙菌種和三菌種發(fā)酵的總酸度隨著時(shí)間的延長呈現(xiàn)出先上升后緩慢下降的趨勢。自然發(fā)酵在微生物的慢速生長和代謝下產(chǎn)有機(jī)酸，而單菌種兼性厭氧酵母菌在前期有氧情況下大量繁殖，抑制其他微生物代謝，產(chǎn)生乙醇和二氧化碳，只有部分二氧化碳溶于水，因此，自然發(fā)酵的總酸度要高于單菌種發(fā)酵。發(fā)酵3～12 d內(nèi)，總酸度上升趨勢較快，且三菌種發(fā)酵酸度要高于其他發(fā)酵，原因可能是乳酸菌和醋酸菌通過利用酵素液中的營養(yǎng)物質(zhì)，產(chǎn)生大量的有機(jī)酸和醋酸；發(fā)酵24～30 d內(nèi)，總酸度下降的幅度都不大，基本趨于平穩(wěn)。

圖1 不同發(fā)酵菌種對(duì)大果山楂酵素中總酸的影響

2.2 不同發(fā)酵菌種對(duì)大果山楂酵素中總酚的影響

大果山楂發(fā)酵過程中酚類物質(zhì)是其重要的功能性成分，對(duì)其口感有著決定性作用，同時(shí)對(duì)酵素的色澤、香氣以及抗氧化性有一定的影響[15]。由圖2可知，自然發(fā)酵、單菌種、雙菌種、三菌種發(fā)酵的總酚濃度先不斷升高后趨于平緩，由初始1 mg/mL左右上升到6～8 mg/mL，這主要是因?yàn)樵诎l(fā)酵過程中，大果山楂中的酚類物質(zhì)隨著發(fā)酵時(shí)間的延長，逐漸溶入到山楂酵素液中[16]。發(fā)酵3～12 d，總酚濃度升高趨勢較大；發(fā)酵至24 d，總酚含量開始略微下降，有可能是酚類物質(zhì)氧化的原因；這2個(gè)過程都能看出這4種發(fā)酵總酚濃度的高低，三菌種發(fā)酵＞雙菌種發(fā)酵＞單菌種發(fā)酵＞自然發(fā)酵。

2.3 不同發(fā)酵菌種對(duì)大果山楂酵素中SOD活性的影響

生物體在新陳代謝的過程中往往會(huì)產(chǎn)生有害物質(zhì)，SOD能起到消除的作用。有研究發(fā)現(xiàn)，它能抑制心腦血管疾病，也有抗衰老、抗疲勞、抗輻射等效果[17]。大果山楂發(fā)酵過程中產(chǎn)生的SOD酶活性物質(zhì)可以提高免疫力，是細(xì)胞防御系統(tǒng)中主要的抗氧化酶[18]。如圖3所示，發(fā)酵過程中，三菌種發(fā)酵、雙菌種發(fā)酵、單菌種發(fā)酵以及自然發(fā)酵的酵素SOD酶活力在24 d時(shí)達(dá)到最高，依次為21.59，19.85，18.72和16.27 U/mL；24～30 d的SOD酶活力均趨于平緩?？梢钥闯?，三菌種發(fā)酵的酵素SOD酶活力最高，雙菌種發(fā)酵次之，其次是單菌種發(fā)酵，最后是自然發(fā)酵。

圖2 不同發(fā)酵菌種對(duì)大果山楂酵素中總酚的影響

圖3 不同發(fā)酵菌種對(duì)大果山楂酵素中SOD活性的影響

2.4 不同發(fā)酵菌種對(duì)大果山楂酵素中酒精度的影響

由圖4可知，隨著時(shí)間變化，自然發(fā)酵、單菌種發(fā)酵、雙菌種發(fā)酵和三菌種發(fā)酵的酒精度呈現(xiàn)先升后降的變化趨勢。發(fā)酵18 d，單菌種發(fā)酵的酒精度最高點(diǎn)達(dá)到25.7%vol，自然發(fā)酵、雙菌種發(fā)酵、三菌種發(fā)酵的酒精度最高點(diǎn)依次為16.7%，13.7%和12.6%vol，單菌種發(fā)酵的酒精度遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他發(fā)酵，這是因?yàn)榻湍妇诋a(chǎn)生大量酒精的同時(shí)，還抑制了其他微生物的生長，使得酵素酒味偏重。相對(duì)來說，三菌種發(fā)酵的酒精度隨時(shí)間變化都比其他發(fā)酵的要小，原因可能是醋酸菌和乳酸菌的生長繁殖，使得酵母菌可利用的營養(yǎng)物質(zhì)減少，酒精的形成量降低。

2.5 不同發(fā)酵菌種對(duì)大果山楂酵素中DPPH自由基清除率的影響

由圖5可知，隨著時(shí)間的延長，通過接種4種發(fā)酵菌種的大果山楂酵素，其DPPH自由基清除率的變化趨勢為先上升后下降。DPPH自由基清除能力與總酚的濃度有一定的關(guān)聯(lián)，一開始隨著總酚濃度的升高而呈現(xiàn)上升的趨勢，后面出現(xiàn)緩慢下降可能是抗氧化活性強(qiáng)的物質(zhì)被微生物降解或者通過結(jié)構(gòu)修飾成抗氧化活性弱的物質(zhì)所造成的[19]。發(fā)酵18 d，三菌種發(fā)酵的酵素DPPH自由基清除率達(dá)到最大值88.9%，比其他發(fā)酵高。發(fā)酵24 d，單菌種發(fā)酵的酵素DPPH自由基清除率達(dá)到最大值85.7%，但比雙菌種和三菌種發(fā)酵低。因而總體來說，三菌種發(fā)酵的酵素DPPH自由基清除能力最強(qiáng)，雙菌種發(fā)酵次之，其次是單菌種發(fā)酵，最后是自然發(fā)酵。

圖4 不同發(fā)酵菌種對(duì)大果山楂酵素中酒精度的影響

圖5 不同發(fā)酵菌種對(duì)大果山楂酵素中DPPH自由基清除率的影響

2.6 不同菌種發(fā)酵大果山楂過程中感官評(píng)分的變化

由圖6可知，隨著時(shí)間的變化，自然發(fā)酵、雙菌種發(fā)酵和三菌種發(fā)酵的感官評(píng)分呈現(xiàn)出上升的趨勢，最后趨于平穩(wěn)，最高評(píng)分都能達(dá)到80分以上，三菌種評(píng)分最高，88.2分。而單菌種發(fā)酵的感官評(píng)分變化為先下降后上升，最后稍微上下波動(dòng)，其評(píng)分最差，低于60分。總體看來，感官評(píng)分高低順序?yàn)椋喝N發(fā)酵＞自然發(fā)酵＞雙菌種發(fā)酵＞單菌種發(fā)酵。

圖6 不同菌種發(fā)酵大果山楂過程中感官評(píng)分的變化

3 結(jié)論

在大果山楂發(fā)酵過程中，自然發(fā)酵、單菌種、雙菌種和三菌種發(fā)酵的總酸度隨著時(shí)間的延長呈現(xiàn)出先上升后緩慢下降的趨勢，其中三菌種發(fā)酵的酵素總酸度相對(duì)偏高，適當(dāng)?shù)乃崮苋岷途凭鶐淼目酀?，提高酵素的營養(yǎng)物質(zhì)，賦予其獨(dú)特的風(fēng)味；發(fā)酵18 d時(shí)，單菌種發(fā)酵的酵素酒精度最高，達(dá)到25.7%vol，自然發(fā)酵次之，其次是雙菌種發(fā)酵，最后是三菌種發(fā)酵，酒精度稍低，酵素的口感不會(huì)那么苦澀；由于總酚對(duì)抗氧化性有一定的影響，因此，發(fā)酵過程中，總酚濃度升高，DPPH自由基清除率和SOD酶活力也隨之上升，且三菌種發(fā)酵＞雙菌種發(fā)酵＞單菌種發(fā)酵＞自然發(fā)酵；結(jié)合感官評(píng)分，酵母菌、醋酸菌和乳酸菌三菌種發(fā)酵的酵素品質(zhì)更佳。