唐杜鵬 陳朝元

福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬人民醫(yī)院，福建省福州市 350004

胃食管反流病(Gastro-esophageal reflux disease, GERD)是指胃內(nèi)容物反流到食管、口腔(包括喉部)或肺部引起的一系列癥狀或并發(fā)癥[1-2]。GERD是一種常見的臨床慢性病，高達(dá)40%的世界人口每月至少患1次[3]。亞洲胃食管反流的患病率低于歐美，但我國(guó)發(fā)病率正在逐年上升[4-5]。反流性食管炎(Reflux esophagitis, RE)是GERD的典型癥狀，胃酸、膽汁鹽和其他有毒物質(zhì)的回流被認(rèn)為是RE的主要原因[6]。疏降飲是陳朝元教授依據(jù)自身治療肝胃不和型RE的臨床經(jīng)驗(yàn)加減優(yōu)化而成，該自擬方不會(huì)對(duì)患者造成明顯的不良反應(yīng)[7]，然而，其治療機(jī)制尚待闡明。

1 材料與方法

1.1 材料 水合氯醛(北京金橋生物工程有限公司)，塑料扎線(浙江誠(chéng)成塑料有限公司)，臺(tái)式低溫高速離心機(jī)(Beckman，美國(guó))，動(dòng)物手術(shù)器械包，2-0和3-0縫線(中國(guó)上海金環(huán)醫(yī)療用品有限公司)。

1.2 疏降飲組成及制備 柴胡12g、白芍9g、旋覆花15g(包煎)、代赭石15g(打碎先煎)、黨參10g、白術(shù)12g、黃連6g、牡丹皮9g、砂仁6g(后入)、木香6g(后入)、煅瓦楞子15g(打碎先煎)、海螵蛸15g(打碎先煎)、炙甘草6g，上述方藥組成的疏降飲由福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬人民醫(yī)院藥劑科統(tǒng)一由煎藥機(jī)煎制，分裝保存于4℃冰箱中。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及模型制備：健康雄性Sprague-Dawley大鼠30只，體重(230±15)g，均購(gòu)于福建醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)SCXK(閩)2017-0001。均按照福建醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物試驗(yàn)中心的標(biāo)準(zhǔn)和要求進(jìn)行喂養(yǎng)。30只大鼠隨機(jī)分為模型組、干預(yù)組及正常對(duì)照組(假手術(shù)組)，每組10只。術(shù)前置于網(wǎng)格底鏤空飼養(yǎng)籠中喂養(yǎng)，禁食禁水24h后使用10%水合氯醛腹腔注射麻醉，腹部朝上固定于自制固定板上，剔除腹部毛發(fā),碘伏嚴(yán)格消毒，鋪設(shè)無菌洞巾，在上腹部做1.5cm的中線切口。前胃用2-0不可吸收縫線結(jié)扎，幽門用自制的尼龍環(huán)部分結(jié)扎幽門至直徑4.2mm，操作過程應(yīng)輕柔，以防大出血甚至穿孔，經(jīng)腹腔注射5%甲硝唑1ml和慶大霉素0.5ml后用3-0不可吸收縫線縫合切口，整個(gè)手術(shù)過程嚴(yán)格遵守?zé)o菌制度。假手術(shù)組，開腹后胃及十二指腸等組織不作任何手術(shù)，僅置于腹腔外3min后關(guān)腹。術(shù)后每天早上9點(diǎn)，取大小夾力一致的鐵夾夾住每只大鼠的尾巴的中1/3部位，以激怒大鼠、使其相互廝打，10min后更換1次夾子的位置，避免缺血造成損傷，每次刺激持續(xù)30min，1次/d。上述操作方法可制成肝胃不和型RE大鼠模型，所有操作按我國(guó)善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的規(guī)定執(zhí)行。

1.3.2 給藥干預(yù)：于造模2周后，每日上午10點(diǎn)，正常對(duì)照組及模型組均予1ml/100g體重量蒸餾水灌胃，干預(yù)組以1ml/100g疏降飲灌胃給藥，給藥時(shí)間連續(xù)2周。給藥時(shí)藥物解凍并加熱到25℃左右。

1.3.3 術(shù)后觀察：術(shù)后每日記錄各組大鼠精神狀態(tài)、活動(dòng)、食量的變化，測(cè)量大鼠體質(zhì)量，分析死亡大鼠的死因。

1.3.4 標(biāo)本的采集及檢測(cè)：造模、干預(yù)4周后大鼠安樂死，迅速取出食管，生理鹽水洗滌后擦干，儲(chǔ)存于液氮中用于檢測(cè)mRNA表達(dá)水平。食管組織中相關(guān)指標(biāo)mRNA的檢測(cè)按照Takara逆轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增試劑盒說明書采用Trizol法提取總RNA，相關(guān)的引物序列如表1所示。

表1 RT-PCR引物序列

檢測(cè)步驟如下：在初步實(shí)驗(yàn)中確定了每組引物的對(duì)數(shù)擴(kuò)增階段的條件，包括在95℃下初始步驟5min，然后95℃下30s，60℃下30s，72℃下30s，40個(gè)循環(huán)，最后在72℃下延長(zhǎng)步驟5min，采用2%瓊脂糖凝膠電泳對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行粒徑分離。PCR產(chǎn)物的大小由凝膠文件系統(tǒng)(美國(guó)加州紫外線產(chǎn)品有限公司)測(cè)定，通過與對(duì)照組比較，確定相對(duì)表達(dá)水平。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)，計(jì)數(shù)資料以構(gòu)成比表示，結(jié)果用χ2檢驗(yàn)進(jìn)行分析；計(jì)量資料用學(xué)生t試驗(yàn)(Student’st-test)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠造模后存活情況 大鼠死亡主要發(fā)生在術(shù)后第1周內(nèi)，2周后大鼠未見死亡，解剖后發(fā)現(xiàn)其主要死因是反流導(dǎo)致的吸入性肺炎。各組大鼠存活率如表2所示。各組大鼠成活率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，說明我們的造模方法穩(wěn)定，且術(shù)后成活率較高。

表2 各組大鼠術(shù)后4周存活率比較

2.2 大鼠體重及食量變化 術(shù)后第1周內(nèi)，大鼠精神狀態(tài)均較差、不好動(dòng)、拒絕進(jìn)食、毛發(fā)較臟，術(shù)后10d左右逐漸恢復(fù)正常飲食，精神、活動(dòng)狀態(tài)及毛發(fā)光澤好轉(zhuǎn)，具體變化如表3所示。術(shù)前各組大鼠的基線情況一致(P術(shù)前食量>0.05,P術(shù)前體重>0.05)。造模后第1周內(nèi)，造模組及干預(yù)組較對(duì)照組大鼠食量及體重均有所下降，但干預(yù)組和模型組比較提示組間無差別(P>0.05)。術(shù)后第2周開始食欲及體重逐漸增加，與模型組相比,干預(yù)組、對(duì)照組大鼠進(jìn)食量、體重均增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05), 而干預(yù)組與對(duì)照組相比則無差別(P>0.05)。

表3 各組大鼠手術(shù)前后進(jìn)食及體重變化比較

2.3 大鼠食管組織IL-1β、IL-8及TNFα mRNA表達(dá)情況 與正常對(duì)照組比較，干預(yù)組、模型組IL-1β、IL-8和TNFα的mRNA均明顯增多，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；但干預(yù)組中表達(dá)較模型組低，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，具體如表4所示。

表4 各組大鼠食管IL-1β、IL-8及TNFα mRNA表達(dá)

3 討論

RE是現(xiàn)代醫(yī)學(xué)名稱，在中醫(yī)中并沒有確切對(duì)應(yīng)的病名，根據(jù)中醫(yī)辨證分型將其分為肝胃不和型、肝胃郁熱型、脾虛氣逆型、痰濕中阻型、氣虛血瘀及寒熱錯(cuò)雜型[8-9]。在本研究中，采用前胃結(jié)扎聯(lián)合不全幽門梗阻術(shù)疊加夾尾刺激，模擬了RE患者“肝郁氣滯、胃氣上逆”的中醫(yī)病機(jī)，建立肝胃不和型RE大鼠模型，手術(shù)2周后無大鼠死亡，提示模型已穩(wěn)定，故我們?cè)诘?周開始用藥干預(yù)，該模型手術(shù)簡(jiǎn)單易學(xué)，易于復(fù)制，且生存率高。

大鼠的體重及進(jìn)食量是反映大鼠生存狀態(tài)的重要指標(biāo)，術(shù)前各組大鼠基線一致，術(shù)后第1周，模型組及干預(yù)組較對(duì)照組大鼠食量及體重均有所下降，但干預(yù)組和模型組比較提示組間無差別，考慮術(shù)后第1周的食量、體重下降主要與術(shù)前的禁食禁水、手術(shù)創(chuàng)傷等有關(guān)，術(shù)后第2周開始大鼠食欲及體重逐漸增加，與模型組相比,干預(yù)組、對(duì)照組大鼠進(jìn)食量、體重均明顯增加，提示干預(yù)組大鼠應(yīng)用疏降飲治療后生存質(zhì)量明顯改善。

IL-1β、IL-8和TNFα是機(jī)體內(nèi)重要的炎性因子，既往傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為是反流的胃內(nèi)容物對(duì)食管黏膜的化學(xué)損傷導(dǎo)致了RE的發(fā)生和進(jìn)展，但該假說逐漸被摒棄，近年來，細(xì)胞因子介導(dǎo)食管上皮免疫炎性反應(yīng)導(dǎo)致RE的假說逐漸得到大家的認(rèn)可[10-11]。在本研究中干預(yù)組與模型組IL-1β、IL-8和TNFα的mRNA水平均明顯升高，證實(shí)了炎癥反應(yīng)參與了RE的發(fā)展，但具體機(jī)制仍不明確。大量研究指出蛋白酶激活受體2(Protease-activated receptor 2, PAR-2)廣泛存在于人體的各個(gè)組織[12]，在炎癥、免疫、應(yīng)激等病理過程中發(fā)揮重要作用[13-15]，PAR-2可通過PI3K-PKB-NF κB這一信號(hào)通路而促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞中IL-1β、IL-6、IL-8和TNFα等促炎因子的表達(dá)與釋放[16]，亦有學(xué)者指出氧化應(yīng)激參與大鼠RE模型中食管黏膜的損傷[17-19]。

肝胃不和型RE發(fā)病的根本病機(jī)在于肝郁氣滯、胃氣上逆，應(yīng)用中醫(yī)理論陰陽平衡辨證論治，根據(jù)中藥配伍規(guī)律，疏降飲方中多味中藥相互補(bǔ)充，疏肝解郁、和胃降逆，取得了良好的療效。

綜上所述，疏降飲對(duì)肝胃不和型RE大鼠可明顯改善體重、增加食量、減輕食管炎癥損傷，但其作用機(jī)制尚不明確，PAR-2激活PI3K-PKB-NF κB通路及氧化應(yīng)激反應(yīng)有可能是其未來研究的方向。