信躍文，董寧，吳瑤，柴艷芬*，姚詠明*

1天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院急診醫(yī)學(xué)科，天津 300052；2解放軍總醫(yī)院第四醫(yī)學(xué)中心創(chuàng)傷研究中心，北京 100048

燒傷后皮膚局部的炎癥反應(yīng)對(duì)創(chuàng)面愈合及預(yù)后具有重要的調(diào)節(jié)作用[1]。傷口愈合過程一般包括炎癥反應(yīng)、組織再生及重塑期三個(gè)階段[2]。研究證實(shí)，調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory T cells，Tregs)穩(wěn)定存在于哺乳動(dòng)物和人類外周非淋巴組織中并參與維持免疫耐受平衡[3-4]，其中皮膚駐留Tregs參與傷口愈合過程的炎癥反應(yīng)階段，并可能與全層皮膚損傷后創(chuàng)面愈合相關(guān)[5-6]。本研究觀察了局部耗竭Tregs對(duì)燒傷創(chuàng)面愈合的動(dòng)態(tài)影響，并探討其潛在的作用及 意義。

1 材料與方法

1.1主要試劑及儀器 白喉毒素(diphtheria toxin，DT，美國List Biological Laboratories公司)；FITC抗小鼠CD4單克隆抗體、PE抗小鼠CD25單克隆抗體(美國Biolegend公司)；APC抗小鼠CD152(CTLA-4)單克隆抗體(美國eBioscience公司)；膠原酶Ⅺ型(美國Sigma公司)；中性蛋白酶Ⅱ型(瑞士Celln Tec公司)。FACS Calibur流式細(xì)胞分析儀(美國BD 公司)。

1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 C57BL/6J野生型(WT)雄性小鼠60只，6～8周齡，購自北京華阜康生物科技股份有限公司。叉頭翼狀螺旋轉(zhuǎn)錄因子p3(forkhead/winged helix transcription factor p3，F(xiàn)oxp3)DTR型轉(zhuǎn)基因小鼠[C57BL/6J-Tlreml(flox)somc]60只，8～15周齡，購自上海南方模式生物科技股份有限公司。實(shí)驗(yàn)前讓小鼠充分適應(yīng)環(huán)境1周，自由進(jìn)食進(jìn)水。設(shè)置Foxp3DTR型-白喉毒素注射組(F-DT組，n=18)和野生型-白喉毒素注射組(C-DT組，n=18)，組內(nèi)依據(jù)隨機(jī)數(shù)字表法分別分為早期組(n=9)與晚期組(n=9)。

1.3燒傷模型制備 小鼠腹腔注射5%水合氯醛(6～8 ml/kg)麻醉，備皮，俯臥位充分暴露背部皮膚，固定四肢。用黃銅探針(直徑8 mm)誘導(dǎo)小鼠背部皮膚全層接觸燒傷，溫度設(shè)置為300 ℃，接觸皮膚2～3 s，制備小鼠燒傷模型，經(jīng)組織學(xué)證明為全層損傷[7-8]。腹腔注射0.9%氯化鈉注射液進(jìn)行液體復(fù)蘇，觀察小鼠復(fù)蘇情況，24～48 h持續(xù)觀察小鼠生命體征。每組小鼠單獨(dú)圈養(yǎng)，自由進(jìn)食進(jìn)水。每日檢查傷口情況，避免感染與鼠群撕咬增加額外 創(chuàng)傷。

1.4體內(nèi)Tregs階段性誘導(dǎo)性耗竭 在不影響燒傷小鼠存活的前提下，F(xiàn)-DT組與C-DT組小鼠腹腔注射10 ng/g DT[7,9]。為了達(dá)到在燒傷愈合早期耗竭Tregs的目的，分別于傷前1天(D-1)、傷后第0天(D0)、第3天(D3)對(duì)F-DT早期組和C-DT早期組小鼠腹腔注射10 ng/g DT[6]；為耗竭晚期愈合過程中的Tregs，分別于燒傷后第5天(D5)、第7天(D7)和第9天(D9)對(duì)F-DT晚期組和C-DT晚期組小鼠腹腔注射10 ng/g DT。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5傷口測(cè)量與組織形態(tài)學(xué)分析 從致傷后開始，分別于D0、D3、D5、D7、D9、D11對(duì)小鼠背部創(chuàng)面進(jìn)行拍照，通過ImageJ軟件(NIH，Bethesda，MD)應(yīng)用數(shù)字化傷口照片測(cè)量不同時(shí)間點(diǎn)傷口面積以評(píng)估傷口愈合率。每張圖片中的度量標(biāo)尺均設(shè)置測(cè)量標(biāo)準(zhǔn)。各組部分小鼠于傷后第7天處死，取傷口及周圍1～2 cm皮膚，用生理鹽水沖洗干凈，75%乙醇浸泡消毒后，4%甲醛固定，包埋，切片，蘇木精-伊紅(HE)染色，光鏡下觀察表皮層及真皮層組織病理學(xué)變化。

1.6流式細(xì)胞學(xué)分析 采用酶消化法消化真皮組織得到細(xì)胞懸液，用于流式細(xì)胞儀分析傷口愈合期間Tregs局部浸潤及功能表型的變化。剪取傷口周圍1～2 cm皮膚，用生理鹽水反復(fù)沖洗或70%乙醇消毒，去除皮下脂肪及結(jié)締組織。再用0.2%中性蛋白酶Ⅱ于4 ℃浸泡消化過夜。隔夜取出皮膚組織，剝離表皮，將真皮組織剪碎，用2 mg/ml膠原酶Ⅺ于37 ℃恒溫?fù)u床消化30～50 min，觀察消化效果。真皮細(xì)胞懸液經(jīng)過濾、漂洗、計(jì)數(shù)后分裝，分別加入抗小鼠CD4抗體、抗小鼠CD25抗體、抗小鼠CTLA-4抗體、抗小鼠可誘導(dǎo)性共刺激分子(inducible costimulator，ICOS)抗體并于破膜后加入抗小鼠Foxp3抗體。避光孵育，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)Tregs局部浸潤及表面分子[10]的表達(dá)變化。以CD4+Foxp3+作為皮膚Tregs的基礎(chǔ)表型[11]。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以x±s表示，組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1DT對(duì)燒傷愈合過程中皮膚局部Tregs浸潤的影響 流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示，早期Tregs誘導(dǎo)耗竭第3天，F(xiàn)-DT組小鼠皮膚局部組織Tregs浸潤與第0天比較明顯減少，且F-DT組少于C-DT組(P＜0.05)。晚期Tregs誘導(dǎo)耗竭第7天，F(xiàn)-DT組小鼠皮膚局部組織Tregs浸潤與第0天比較明顯減少，且F-DT組少于C-DT組(P＜0.05，表1)。

2.2體內(nèi)Tregs耗竭對(duì)燒傷創(chuàng)面愈合的影響 早期注射DT期間，F(xiàn)-DT組小鼠燒傷創(chuàng)面愈合率與C-DT組比較明顯降低，主要表現(xiàn)為第7～11天傷口愈合減慢，愈合曲線坡度變緩(P＜0.05，圖1A)；晚期注射DT期間，兩組燒傷創(chuàng)面愈合率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05，圖1B)。

表1 兩組小鼠皮膚Tregs浸潤情況 (±s，n=6)Tab.1 The infiltration of skin Tregs in two groups of mice (±s, n=6)

表1 兩組小鼠皮膚Tregs浸潤情況 (±s，n=6)Tab.1 The infiltration of skin Tregs in two groups of mice (±s, n=6)

與D0比較，(1)P＜0.05；與C-DT組比較，(2)P＜0.05。

圖1 DT注射期間兩組小鼠皮膚創(chuàng)面愈合情況及愈合率比較Fig.1 Comparison of skin wound healing and healing rate curve of two groups of mice during DT injection

2.3小鼠皮膚燒傷后愈合情況 HE染色結(jié)果顯示，燒傷后第7天，C-DT組小鼠皮膚可見明顯結(jié)痂，血管生成明顯，再上皮化進(jìn)程迅速；與C-DT組相比，F(xiàn)-DT早期組小鼠皮膚肉芽組織增生明顯，無明顯結(jié)痂及瘢痕生成，血管生成不明顯，再上皮化進(jìn)程緩慢；與C-DT組及F-DT早期組相比，F(xiàn)-DT晚期組小鼠皮膚可見明顯結(jié)痂及瘢痕組織，血管生成明顯，再上皮化進(jìn)程與C-DT組相似，但略慢于C-DT組(圖2)。

2.4燒傷后WT小鼠皮膚Tregs浸潤及表型變化 流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示，WT小鼠皮膚CD4+Foxp3+T細(xì)胞浸潤在燒傷后即明顯增加，以第5天最為顯著(表2)，其后則逐漸降低，第11天降至基礎(chǔ)水平。小鼠皮膚CD25+Tregs在燒傷后即明顯增加，于第3天達(dá)峰值，然后逐漸下降。小鼠皮膚Tregs CTLA-4表達(dá)水平在燒傷后即明顯增高，第3天達(dá)峰值，然后逐漸降低(表2)。同樣，Tregs ICOS表達(dá)水平在燒傷后即明顯增高，第5天達(dá)峰值，然后逐漸降低，第11天降至基礎(chǔ)水平(表2)。

圖2 兩組小鼠皮膚燒傷后愈合情況(HE ×4)Fig.2 Healing after skin burns in two groups of mice

表2 燒傷后不同時(shí)間WT小鼠皮膚Tregs的局部浸潤及功能表型變化 (%，±s，n=6)Tab.2 Local infiltration and phenotypic changes of skin Tregs in WT mice after burn injury (%,±s, n=6)

表2 燒傷后不同時(shí)間WT小鼠皮膚Tregs的局部浸潤及功能表型變化 (%，±s，n=6)Tab.2 Local infiltration and phenotypic changes of skin Tregs in WT mice after burn injury (%,±s, n=6)

與D0比較，(1)P＜0.05。

3 討 論

本研究首先對(duì)Foxp3DTR型小鼠注射DT，特異性、階段性地抑制Tregs的表型及功能。Foxp3DTR型小鼠DT受體基因的表達(dá)受Foxp3啟動(dòng)子調(diào)控，因此在注射DT期間會(huì)引起Tregs耗竭[6,9]。傳統(tǒng)的選擇性抑制細(xì)胞功能分子表達(dá)的方法多用于蛋白轉(zhuǎn)錄及免疫酶學(xué)研究領(lǐng)域[12-13]，有學(xué)者運(yùn)用該方法選擇性耗竭Tregs以觀察其對(duì)小鼠全層皮膚損傷后愈合過程的影響，初步觀察到Tregs耗竭可減慢皮膚再上皮化進(jìn)程[6]，但該方法用于體內(nèi)實(shí)驗(yàn)存在明顯缺陷。

據(jù)報(bào)道，采用50 ng/g DT注射Foxp3DTR型小鼠48 h之內(nèi)僅4%的CD4+T細(xì)胞表達(dá)Foxp3+，表明這種方法可引起小鼠體內(nèi)96%的Tregs耗竭[9]。本研究在充分保證燒傷后Foxp3DTR型小鼠存活的條件下，給予腹腔注射10 ng/g DT，發(fā)現(xiàn)在燒傷早期及晚期，該劑量DT作用下F-DT組小鼠皮膚Tregs耗竭達(dá)C-DT組的80%以上。進(jìn)一步分析皮膚Tregs對(duì)燒傷創(chuàng)面愈合率的影響，觀察到燒傷愈合早期(前5 d)耗竭小鼠皮膚Tregs可使第5～11天創(chuàng)面愈合明顯減慢；而在燒傷愈合晚期(第7～11天)耗竭小鼠皮膚Tregs對(duì)創(chuàng)面愈合率的影響不明顯，表明皮膚Tregs在燒傷早期參與了創(chuàng)面愈合的過程，這一結(jié)果與創(chuàng)面組織HE染色及組織病理學(xué)變化一致。分析燒傷后炎癥反應(yīng)階段對(duì)皮膚Tregs功能表型的影響，發(fā)現(xiàn)野生型小鼠皮膚Tregs浸潤在傷后第3～5天明顯增加，第5天達(dá)峰值，然后逐漸減少；CTLA-4和ICOS功能分子表達(dá)水平在燒傷后第3天最高。已知CTLA-4是T細(xì)胞膜表面重要的共抑制分子，在外周T細(xì)胞免疫耐受中發(fā)揮著重要作用，可用來反映Tregs的功能活性；ICOS是新近發(fā)現(xiàn)的在T細(xì)胞活化中起關(guān)鍵作用的共刺激分子，在T細(xì)胞亞群構(gòu)成變化及功能表達(dá)方面具有重要意義[14]。因此，結(jié)合組織病理學(xué)變化，本研究結(jié)果表明皮膚Tregs在燒傷早期作用于創(chuàng)面局部組織，可增強(qiáng)免疫調(diào)節(jié)效應(yīng)，促進(jìn)創(chuàng)面愈合過程。

綜上所述，皮膚中駐留的Tregs對(duì)燒傷創(chuàng)面愈合過程具有積極的促進(jìn)作用。本研究通過體內(nèi)實(shí)驗(yàn)初步明確了燒傷后皮膚Tregs的免疫活性及功能特點(diǎn)，為臨床應(yīng)用提供了新線索，如通過誘導(dǎo)劑促進(jìn)Tregs的功能表達(dá)，從而加速燒傷創(chuàng)面愈合值得進(jìn)一步研究[15-16]。此外，創(chuàng)傷修復(fù)一直是再生醫(yī)學(xué)及軍事醫(yī)學(xué)研究的重要領(lǐng)域[17]，各種組織修復(fù)替代材料應(yīng)用于創(chuàng)面局部發(fā)揮其免疫效應(yīng)以促進(jìn)組織修復(fù)日益受到關(guān)注[18-20]。因此，通過組織替代材料的免疫原性調(diào)控皮膚Tregs狀態(tài)進(jìn)而影響創(chuàng)面修復(fù)過程，值得深入探討。