譚立明，葉舒慧，華蕾，郭斌，趙永雷，張皓承，胡澤宇，曹梓超，吳洋，曾婷婷，田永建，余建林，李華，陳娟娟

1南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科/江西省檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南昌 330006；2南昌大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，南昌 330006；3宜春市萬(wàn)載縣婦幼保健院，江西宜春 336100；4南昌大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院，南昌 330006

慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B，CHB)是由乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)感染所致。目前，全世界至少有3.5億CHB患者[1]。HBV不直接殺傷肝細(xì)胞，但HBV的活躍復(fù)制、肝臟細(xì)胞的炎性反應(yīng)及壞死易使CHB患者肝臟發(fā)生纖維化，最終發(fā)展成肝硬化及肝細(xì)胞肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC)。監(jiān)控CHB患者肝臟纖維化程度，抑制HBV DNA復(fù)制、減輕肝臟細(xì)胞受損程度，可延緩肝衰竭、肝硬化失代償及HCC等嚴(yán)重并發(fā)癥的發(fā)生，改善CHB患者的預(yù)后和生活質(zhì)量[2]。肝臟是人體銅藍(lán)蛋白(ceruloplasmin，CER)、游離三碘甲腺原氨酸(free triiodothyronine 3，F(xiàn)T3)代謝的主要器官，透明質(zhì)酸(hyaluronic acid，HA)是肝臟細(xì)胞外基質(zhì)的重要成分，肝臟功能異常會(huì)導(dǎo)致血清CER、HA和FT3水平異常。本研究探討了血清CER、HA和FT3水平對(duì)CHB患者肝臟纖維化程度的評(píng)估價(jià)值。

1 資料與方法

1.1研究對(duì)象 南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院2014年7月－2018年1月確診的患者200例，包括CHB 136例、乙型肝炎后肝硬化44例、HBsAg陽(yáng)性原發(fā)性肝癌20例。隨機(jī)選取同期50例健康體檢者作為對(duì)照組。所有患者均符合納入排除標(biāo)準(zhǔn)，所有標(biāo)本均在患者知情同意條件下獲得。本研究獲得南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)許可。

1.2納入標(biāo)準(zhǔn) ①CHB患者均符合2018年美國(guó)肝病研究學(xué)會(huì)制定的CHB診斷標(biāo)準(zhǔn)[3]；②肝硬化患者符合《慢性乙型肝炎防治指南》病理診斷標(biāo)準(zhǔn)[1]，肝纖維化分期等級(jí)≥S4期；③乙型肝炎后肝硬化患者與HCC患者均按照《APASL臨床實(shí)踐指南:肝細(xì)胞癌的管理》[4]經(jīng)過(guò)肝臟活檢、肝臟影像學(xué)檢查及臨床醫(yī)師確診。

1.3排除標(biāo)準(zhǔn) ①甲、丙、丁、戊型肝炎病毒及人類(lèi)免疫缺陷病毒(HIV)感染者；②酒精性肝炎、自身免疫性肝炎、原發(fā)性膽汁性肝硬化及肝臟轉(zhuǎn)移性癌癥者；③合并糖尿病，自身免疫性疾病，嚴(yán)重心腦血管、心臟、腎臟、血液系統(tǒng)疾病者；④近期接受過(guò)影響凝血功能的相關(guān)治療者；⑤近期接受過(guò)抗肝纖維化治療或抗病毒治療者。

1.4方法 所有研究對(duì)象均取3 ml晨起空腹外周靜脈血，靜置30 min后放入離心機(jī)中1026×g離心15 min，留取上層血清待檢。血清CER的檢測(cè)采用免疫比濁法(美國(guó)貝克曼公司產(chǎn)IMMAGE 800型全自動(dòng)特定蛋白分析系統(tǒng)及配套試劑)。血清HA和FT3的檢測(cè)采用化學(xué)發(fā)光法(美國(guó)西門(mén)子全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光免疫分析系統(tǒng)ADVIA Centaur XP)。血小板(PLT)測(cè)算采用電阻抗法(SISMEX全自動(dòng)血液分析儀，型號(hào):XE-2100)，谷丙轉(zhuǎn)氨酶(alanine aminotransferase，ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(aspartate transaminase，AST)的檢測(cè)使用Beckman AU5800全自動(dòng)生化分析儀。所有操作均嚴(yán)格遵循各試劑說(shuō)明書(shū)及南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院質(zhì)量管理標(biāo)準(zhǔn) 文件。

1.5肝纖維化無(wú)創(chuàng)性診斷 采用AST/PLT比率指數(shù)(AST-to-platelet ratio index，APRI)與基于4因子的肝纖維化指標(biāo)(fibrosis index based on four factors，F(xiàn)IB-4)兩種模型分別計(jì)算CHB、肝炎后肝硬化及HCC的肝臟纖維化程度。APRI=([AST/ULN*]/PLT)×100；FIB-4=(年齡×AST)/(PLT×ALT0.5)[5-6]。 其中，ULN*為正常值上限40 U/L，AST、ALT單位為U/L，年齡單位為年，PLT單位為109/L。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 所有檢測(cè)結(jié)果經(jīng)EXCEL 2016軟件整理分類(lèi)，利用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。正態(tài)分布數(shù)據(jù)以±s表示，非正態(tài)分布數(shù)據(jù)以M(P25，P75)表示。對(duì)各組數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)和方差齊性檢驗(yàn)(Levene's檢驗(yàn))。若同時(shí)滿(mǎn)足正態(tài)性和方差齊性，采用單因素方差分析(one-way ANOVA)進(jìn)行組間比較，兩兩比較采用Dunnet t檢驗(yàn)、SNK法。未同時(shí)滿(mǎn)足正態(tài)性和方差齊性的數(shù)據(jù)采用秩和檢驗(yàn)，兩兩比較采用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)多個(gè)樣本間多重比較的正態(tài)近似法。相關(guān)性分析采用Pearson法和Spearman秩相關(guān)分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。對(duì)檢驗(yàn)數(shù)據(jù)行受試者特征(receiver operating characteristic，ROC)曲線分析，計(jì)算ROC曲線下面積(area under the curve，AUC)，AUC=0.5～0.7為有較低的診斷準(zhǔn)確性，AUC=0.7～0.9為有一定的診斷準(zhǔn)確性，AUC＞0.9為有較高的診斷準(zhǔn)確性。

2 結(jié) 果

2.1一般資料 各組間性別比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；CHB組和肝硬化失代償組年齡與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；重度CHB組、失代償期肝硬化組CER水平均低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；重度CHB組、肝硬化組HA水平均高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；肝硬化組、HCC組FT3水平均低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；中重度CHB組、HCC組AST水平均高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；重度CHB組ALT水平高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；CHB組、肝硬化組、HCC組PLT均低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，表1)。

2.2CER、HA、FT3與肝纖維化APRI、FIB-4的相關(guān)性分析 Pearson相關(guān)分析結(jié)果顯示，CER與APRI、FIB-4呈負(fù)相關(guān)，HA、FT3與APRI、FIB-4均呈正相關(guān)(表2)。

2.3CER、HA、FT3診斷肝硬化的可靠性分析 以肝臟活檢結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn)，評(píng)價(jià)CER、HA和FT3水平診斷肝纖維化分期等級(jí)≥S4期的可靠性，結(jié)果顯示CER、HA敏感度(均為79.1%)高于FT3，F(xiàn)T3的特異度最高，為89.1%(表3)。

2.4CER、HA、FT3診斷肝硬化的ROC曲線分析 CER、HA、FT3診斷肝硬化的AUC分別為0.608、0.826、0.831，三者均具有良好的診斷價(jià)值，其中FT3的AUC最大。聯(lián)合診斷的診斷效能從高到低依次為CER+HA+FT3、HA+FT3、CER+HA和CER+FT3(圖1)。

3 討 論

據(jù)世界衛(wèi)生組織估計(jì)，全球約有2.4億慢性HBV感染者，中國(guó)35%～62%的人檢出HBV感染標(biāo)志物[5-6]。CHB的自然過(guò)程可以按照病毒-宿主相互作用分為4個(gè)階段:免疫耐受、免疫清除、低復(fù)制或無(wú)復(fù)制及活化。CHB的發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜，迄今尚未完全闡明。研究表明，HBV不直接殺傷肝細(xì)胞，其引起的免疫應(yīng)答是肝細(xì)胞損傷及炎癥的主要發(fā)生機(jī)制，而炎癥反復(fù)存在是CHB進(jìn)展為肝硬化甚至HCC的重要因素[7]。肝纖維化嚴(yán)重程度是影響CHB患者預(yù)后的一個(gè)重要因素，此外，它可以輔助確定患者開(kāi)始進(jìn)行抗病毒治療的具體時(shí)間，評(píng)估抗病毒治療的療效，確定開(kāi)始監(jiān)測(cè)的最佳時(shí)間，分析肝癌、肝硬化的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)[8]。因此，對(duì)CHB患者進(jìn)行肝纖維化評(píng)估至關(guān)重要。

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CER是血清中分離出的一種由肝臟合成的α2-糖蛋白，屬于急性期蛋白，在感染、炎癥和創(chuàng)傷期其血清水平會(huì)上升，機(jī)制是炎性細(xì)胞因子介導(dǎo)肝細(xì)胞基因轉(zhuǎn)錄[9]。本研究中，重度CHB患者和CHB后肝硬化進(jìn)展為失代償患者血清CER水平顯著低于健康對(duì)照組；在CHB由輕度發(fā)展為重度，肝硬化從代償狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)槭Т鷥敔顟B(tài)的過(guò)程中，CER水平逐漸降低，這與Zeng等[9]、Yin等[10]的研究一致；ROC曲線分析顯示，CER診斷肝硬化的AUC為0.668，提示CER是判斷肝臟損害程度的良好指標(biāo)。肝細(xì)胞受到HBV在其內(nèi)復(fù)制帶來(lái)的免疫損傷后，分泌出的大量細(xì)胞因子會(huì)引起肝損害甚至肝衰竭，使CER的合成減少[11]。但本研究中，HBV陽(yáng)性的HCC組患者CER水平升高，可能與HCC導(dǎo)致的CER核心鹽藻糖基化修飾有關(guān)[10]。

表2 CER、HA、FT3與肝纖維化診斷模型的相關(guān)性Tab.2 Correlation analysis of serum CER, HA and FT3 with the diagnostic model of the liver fibrosis

表3 CER、HA、FT3診斷肝硬化的可靠性分析Tab.3 Analysis of the reliability of CER, HA and FT3 for diagnosis of hepatic cirrhosis

圖1 CER(A)、HA(B)、FT3(C)及其聯(lián)合應(yīng)用(D)診斷肝硬化的ROC曲線分析Fig.1 ROC curve of CER, HA, FT3 and combined detection on the diagnosis of liver cirrhosis

HA是肝細(xì)胞外基質(zhì)的一種重要成分，主要由肝內(nèi)儲(chǔ)脂細(xì)胞合成。當(dāng)肝臟發(fā)生纖維化時(shí)，纖維細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞增生，導(dǎo)致HA合成增加。同時(shí)，肝臟受損又使其分解HA的能力下降，進(jìn)一步升高了體內(nèi)HA水平[12]。絕大多數(shù)肝病患者血清HA水平呈不同程度上升，尤其是在肝硬化患者中。本研究結(jié)果顯示，重度CHB組、肝硬化組HA水平高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，且HA與肝纖維化無(wú)創(chuàng)診斷模型指數(shù)具有中度相關(guān)性；HA檢測(cè)已發(fā)生肝硬化患者的AUC為0.826，有較好的診斷價(jià)值，提示HA是評(píng)價(jià)肝臟纖維化程度的良好指標(biāo)。鑒于早期的肝纖維化是可逆的，而肝硬化是不可逆的[13]，因此，可通過(guò)對(duì)CHB患者進(jìn)行HA檢測(cè)以監(jiān)測(cè)其肝臟纖維化程度，從而早期發(fā)現(xiàn)、早期治療肝臟纖維化。

肝臟是眾多激素代謝的主要場(chǎng)所，CHB患者易并發(fā)甲狀腺疾病。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)是最主要的促進(jìn)纖維化的細(xì)胞因子，通過(guò)激活SMAD轉(zhuǎn)錄因子發(fā)揮作用[14]。而3,5,3,-三碘甲腺原氨酸(triiodothyronine，T3)可通過(guò)與核受體結(jié)合抑制TGF-β/SMAD通路轉(zhuǎn)錄激活，從而抑制纖維化的發(fā)生。CHB患者肝臟功能受損，代謝激素能力減弱，且肝臟纖維化導(dǎo)致合成代謝降低、分解代謝升高，進(jìn)一步降低了甲狀腺激素水平，有學(xué)者指出肝纖維化患者甲狀腺激素水平越低，預(yù)后越差[15]。FT3是甲狀腺激素T3的活性部分，故血清FT3水平與肝臟纖維化有密切關(guān)系[16]。 本研究結(jié)果顯示，肝硬化組、HCC組FT3水平均低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且血清FT3水平與肝纖維化無(wú)創(chuàng)診斷模型具有相關(guān)性。FT3診斷肝硬化的ROC曲線下面積為0.831，有較好的診斷價(jià)值。提示血清FT3水平也是評(píng)價(jià)肝臟纖維化及CHB患者預(yù)后的較好指標(biāo)。

早期監(jiān)測(cè)CHB患者肝臟纖維化及肝功能損害程度至關(guān)重要[17]。目前，肝纖維化診斷的金標(biāo)準(zhǔn)仍是肝臟活檢，但由于其具有侵入性、風(fēng)險(xiǎn)性和價(jià)格較高等特點(diǎn)，且肝臟標(biāo)本選取位置及觀察視野的差異等也會(huì)導(dǎo)致最終結(jié)果出現(xiàn)偏差，故不能用于CHB患者肝纖維化程度的持續(xù)監(jiān)控[18]。而血清學(xué)標(biāo)本可重復(fù)、多次采集，并可實(shí)現(xiàn)持續(xù)監(jiān)控。本研究證實(shí)血清CER、HA、FT3水平在CHB進(jìn)展為肝硬化、HCC的過(guò)程中有提示作用，且與肝纖維化無(wú)創(chuàng)診斷模型相比，三者與肝纖維化水平均具有相關(guān)性，聯(lián)合診斷肝硬化的檢驗(yàn)效能良好。