陳容娟，劉妍，羅丹，黃碧霞，王鈞，思蘭蘭，李曉東，徐東平*，段昌柱*

1重慶醫(yī)科大學細胞生物學及遺傳學教研室/分子醫(yī)學與腫瘤研究中心，重慶 400016；2解放軍總醫(yī)院第五醫(yī)學中心臨床研究管理中心，北京 100039

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)感染可致肝硬化、肝衰竭和肝細胞癌(HCC)[1-3]，嚴重威脅人類健康。據(jù)統(tǒng)計，全球約有2.92億人為HBV感染者，我國約8600萬。目前，臨床常用的抗HBV藥物是核苷(酸)類似物[nucleos(t)ide analogues，NAs]，可直接靶向作用于HBV反轉(zhuǎn)錄酶(RT)區(qū)抑制病毒復制，但因其不能直接抑制肝細胞中HBV復制的原始模板cccDNA而需長期用藥，且長期多種NAs序貫或聯(lián)合治療易產(chǎn)生病毒耐藥或多重耐藥，導致治療失敗[4-5]。多重耐藥是指不同耐藥突變存在于同一病毒基因組中，該突變病毒株至少對2種無交叉耐藥譜且是不同類別的NAs耐藥，多重耐藥HBV不僅導致聯(lián)合用藥療效不佳，還增加了抗HBV藥物的選擇難度，國內(nèi)外已有多重耐藥病例的報道[6-12]。 本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，rtA181S為新型阿德福韋酯(ADV)耐藥突變，其與經(jīng)典拉米夫定耐藥突變(LAMr)或恩替卡韋耐藥突變(ETVr)是否共存于同一病毒基因組中，形成新的多重耐藥病毒株，以及此新型多重耐藥突變的發(fā)生特點及表型特征至今尚未見臨床大樣本報道。本研究通過臨床大樣本數(shù)據(jù)與體外表型耐藥分析，闡明我國臨床流行的rtA181S相關多重耐藥HBV感染的特點，并對該新型多重耐藥突變進行鑒定，為HBV感染的防治和挽救治療提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1研究對象 回顧性分析2012－2017年于解放軍總醫(yī)院第五醫(yī)學中心(原解放軍第302醫(yī)院)就診并接受HBV耐藥突變檢測的慢性HBV感染者的臨床資料和序列信息。慢性HBV感染疾病包括慢性乙型肝炎、HBV相關性肝硬化和HCC，診斷依據(jù)為我國《慢性乙型肝炎防治指南(2015年版)》[13]。排除其他肝炎病毒及人類免疫缺陷病毒共同感染、酒精性肝病及自身免疫性肝病患者?；颊哐鍢颖居?20 ℃保存，所有常規(guī)臨床指標均由該院臨床檢驗中心完成。本研究經(jīng)原解放軍第302醫(yī)院倫理委員會批準。

1.2主要試劑 病毒DNA OUT試劑盒購自北京天恩澤基因科技有限公司；膠回收試劑盒及質(zhì)粒小量提取試劑盒購自生工生物工程上海(股份)有限公司；T4DNA連接酶購自美國Promega公司；2×EasyTaq PCR SuperMix及Trans 109感受態(tài)細胞購自北京全式金生物技術有限公司；Xho Ⅰ/Sph Ⅰ核酸內(nèi)切酶購自日本TaKaRa公司；pTriEx-HBV 1.1倍載體由法國里昂大學Zoulim教授惠贈；轉(zhuǎn)染用Plasmid Mini Kit購自德國QIAGEN公司；X-tremeGENE HP DNA轉(zhuǎn)染試劑購自美國Roche公司；DMEM培養(yǎng)液購自美國Gibco公司。

1.3方法

1.3.1臨床及實驗室檢查 從HBV基因數(shù)據(jù)庫篩選HBV rtA181S陽性突變患者，收集其接受NAs治療前后的臨床診療數(shù)據(jù)，包括基本信息、NAs治療史、血清HBV DNA和生化學檢測指標、乙肝五項等。

1.3.2HBV RT區(qū)序列及基因型分析 根據(jù)所測定的HBV RT區(qū)序列，分析rtA181S以及rtL180M、rtA181V/T/C、rtT184L/I/A/S/F/G、rtS202G/C、rtM204V/I、rtN236T、rtM250I/V/L等LAM、替比夫定(LdT)、ADV和ETV耐藥相關位點，應用MEGA 7軟件分析基因型[14-15]。

1.3.3基因克隆 將PCR產(chǎn)物克隆到pGEM-Teasy載體，隨機挑選≥20個陽性克隆進行DNA測序并分析耐藥相關突變。

1.3.41.1倍pTriEx-HBV重組質(zhì)粒構建及鑒定 選取患者來源的HBV RT野生株和rtA181S+T184I+M204I突變株質(zhì)粒經(jīng)Sph Ⅰ和Xho Ⅰ雙酶切的RT區(qū)片段連接至pTriEx-HBV 1.1倍載體上，經(jīng)克隆測序鑒定成功后提取轉(zhuǎn)染級質(zhì)粒備用。

1.3.5表型耐藥分析 HepG2細胞按1×105個/孔接種至24孔板中，待細胞生長至60%～80%融合時，應用X-tremeGENE HP DNA轉(zhuǎn)染試劑進行轉(zhuǎn)染，每孔轉(zhuǎn)染0.25 μg質(zhì)粒。轉(zhuǎn)染5 h后，培養(yǎng)液更換為不含或含不同NAs藥物濃度梯度的2%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液(LAM/TDF:0、0.01、0.1、1.0、10、100 μmol/L； ADV:0、0.1、0.33、1.0、3.3、10 μmol/L；ETV:0、0.001、0.01、0.1、1.0、10 μmol/L)。隔天換液，連續(xù)培養(yǎng)4 d后收集細胞上清，采用實時熒光定量PCR檢測細胞上清HBV DNA水平。病毒的復制力以無藥物壓力下自然產(chǎn)生的HBV DNA水平評價，病毒的藥物敏感性以EC50評價，EC50值越高表明藥物敏感性越低。實驗獨立重復3次。

1.4統(tǒng)計學處理 采用SPSS 16.0軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料以±s或M(Min，Max)表示，組間比較采用兩獨立樣本t檢驗或χ2檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1HBV rtA181S突變患者的臨床特點 在16 443例慢性HBV感染者中，有124例(0.75%)檢出rtA181S突變。鑒于前期鑒定的rtA181S為新型ADV耐藥變異，本研究將rtA181S陽性突變患者分為ADV耐藥突變組rtA181S±ADVr(ADVr: rtA181V/rtN236T)和潛在的新型多重耐藥突變組rtA181S+L AMr/ETVr。經(jīng)對兩組患者的臨床資料進行統(tǒng)計分析，結果顯示，兩組患者年齡、性別、HBV DNA載量及ALT、AST、TBIL、HBeAg水平差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，但在基因型方面，rtA181S+LAMr/ETVr突變更易在C基因型患者中檢出(C/B，23/6 vs. 90/2，P=0.002，表1)。

2.2HBV rtA181S突變與NAs經(jīng)典耐藥突變共存分析 直接測序分析結果顯示，124例rtA181S陽性患者中有19例單獨存在，10例與ADVr同時出現(xiàn)，21例與LAMr共存，74例與ETVr共存。其中伴隨LAMr出現(xiàn)的突變形式主要為rtA181S+M204I(n=9)和rtA181S+L180M+M204V(n=6)，伴隨ETVr出現(xiàn)的突變形式主要為rtA181S+T184I+M204I(n=57，表2)。

2.3rtA181S+T184I+M204I突變患者的臨床資料及突變模式分析 對其中5例含rtA181S+T184I+M204I新型突變或與其他突變共存且具有完整動態(tài)臨床診療信息的患者進行分析顯示，患者均有長期ADV、ETV和(或)LAM/LdT序貫或聯(lián)合抗病毒治療史；克隆測序分析顯示，rtA181S+T184I+M204I共存于同一病毒基因組中，其中1 例檢出少量rtA181S+T184M+M204I突變株(表3)。

表2 乙型肝炎病毒rtA181S突變與NAs經(jīng)典耐藥突變共存分析Tab.2 Analysis of coexistence of rtA181S mutation and NAs classical resistance mutation

2.4代表性患者的臨床信息及病毒學演變特點 1 例代表性患者序貫接受L A M(3 0 個月)、LAM+ADV(8個月)、ETV(43個月)、LdT+ADV(12個月)和替諾福韋酯(TDF，30個月)治療(圖1)。 患者在應用LAM治療16個月和26個月時，病毒學應答不佳，此時HBV DNA水平分別為6.86 log10IU/ml 和5.14 log10IU/ml，克隆測序顯示由100%野生株(A 1)變?yōu)? 0 0% r t M 2 0 4 I 突變株(A 2)。隨后加用A DV 抗病毒治療8 個月仍無法獲得完全病毒學應答，調(diào)整為E T V 抗病毒治療4 3 個月，rtA181S+T184I+M204I突變株在ETV治療期間由5% rtA181S+T184I+M204I(A3)逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)閮?yōu)勢病毒株90%(A4)和95%(A5)，并在A4時發(fā)生病毒學突破，且在ETV治療43個月時，HBV DNA持續(xù)高載量(7.67 log10IU/ml)。改用LdT+ADV方案治療不理想后改用TDF治療，在TDF治療11個月時，HBV DNA水平下降至2.39 log10IU/ml，病毒準種池A6顯示90%的rtA181S+T184I+M204I突變株和10%的野生型病毒株。TDF治療30個月后，患者獲得完全的病毒學和生化學應答，HBV DNA水平低于檢測下限，ALT水平恢復正常。

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2.5rtA181S+T184I+M204I表型特性分析 對rtA181S+T184I+M204I突變株和野生株進行表型分析顯示，rtA181S+T184I+M204I突變株的復制力降低，為野生株的46.3%；藥物敏感性分析結果顯示，rtA181S+T184I+M204I突變株對LAM、ADV和ETV耐藥，耐藥倍數(shù)分別為＞1000倍、3.9倍和383.3倍，對TDF仍敏感(表4)。

3 討 論

長期應用NAs治療可有效抑制HBV復制，減少肝臟相關并發(fā)癥的發(fā)生[16-17]，但在治療過程中，耐藥的發(fā)生成為影響治療效果的一個極為重要的問題。與未發(fā)生耐藥的患者相比，耐藥不僅使已取得的治療效果喪失或病情急劇惡化，還可使疾病加速進展為肝衰竭，增高肝移植率、HCC發(fā)病率和病死率。病毒耐藥是病毒在藥物壓力下產(chǎn)生的一系列適應性突變，最終導致病毒對藥物的敏感性下降[18-19]。

ADV于2002年上市，因其對HBV野生株和LAM耐藥株具有較強的抗病毒作用而被廣泛用于臨床抗HBV治療，但長期應用具有較高的耐藥率(5年耐藥率為29%)[20]。經(jīng)典ADV耐藥突變位點為rtA181V和rtN236T，本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)rtN236V、rtI233V和rtA181S與ADV耐藥相關[21-23]。LAM經(jīng)典耐藥變異為rtM204I/V；在LAM耐藥基礎上，同時出現(xiàn)rtT184、rtS202或rtM250任意一個位點即可引起ETV耐藥[2]。多重耐藥突變即HBV基因組上rtM204I/V±rt184/202/250突變與rtA181V和(或)rtN236T突變同時出現(xiàn)。其中在rtA181S耐藥變異研究中，rtA181S與LAMr或ETVr同時出現(xiàn)，可形成一種新型多重耐藥突變，目前國內(nèi)外缺少此類新型多重耐藥突變的相關研究報道。

新型耐藥突變的鑒定依據(jù)以下幾個特征:①臨床上出現(xiàn)病毒學突破和(或)應答不佳；②在多例患者中出現(xiàn)并與臨床用藥相關；③體外表型耐藥分析顯示對藥物的敏感性降低[24]。本研究的臨床大樣本數(shù)據(jù)分析顯示rtA181S+LAMr/ETVr突變可在多例患者中檢出，其中rtA181S+T184I+M204I突變檢出率最高，占rtA181S+ETVr突變患者的77.0%(57/74)。對rtA181S+T184I+M204I突變患者的HBV進行克隆分析發(fā)現(xiàn)，rtA181S主要與rtT184I+M204I共存于同一病毒基因組中，且上述患者均有ADV、ETV和(或)LAM/LdT序貫或聯(lián)合抗病毒治療史。1例代表性患者在檢出rtA181S+T184I+M204I突變時，經(jīng)歷了LAM→LAM+ADV→ETV序貫或聯(lián)合治療并發(fā)生病毒學應答不佳，隨后發(fā)生病毒學突破，且rtA181S+T184I+M204I突變轉(zhuǎn)為優(yōu)勢病毒株，提示rtA181S+T184I+M204I突變的發(fā)生與患者使用高耐藥率、低耐藥基因屏障藥物LAM或ADV進行初始抗病毒治療有關；發(fā)生耐藥后應用ETV或ADV+LdT挽救治療應答不佳或發(fā)生病毒學突破，表明rtA181S+T184I+M204I突變與應用存在交叉耐藥譜的NAs藥物相關。

圖1 1例乙型病毒性肝炎代表性患者臨床信息及病毒學演變特點Fig.1 Clinical information and virologic evolutions of a representative patient with HBV

表4 乙型肝炎病毒rtA181S+T184I+M204I突變株相對復制力及表型分析Tab.4 Relative replicability and phenotypic characteristics of rtA181S+T184I+M204I mutants

體外表型研究結果顯示，突變株對A DV 的EC50升高2～9倍即可耐藥，而引起ETV和TDF耐藥變異的EC50需增加10倍以上(通常＞50倍)，引起LAM耐藥變異的EC50需增加500倍以上[14,25-26]。 本研究發(fā)現(xiàn)，rtA181S+T184I+M204I突變株對LAM、ADV和ETV的耐藥倍數(shù)分別為＞1000倍、3.9倍和383.3倍，對TDF仍敏感，進一步證實rtA181S+T184I+M204I是一種新型的多重耐藥突變。對于多重耐藥患者，應采用強效高耐藥基因屏障藥物TDF或ETV+TDF聯(lián)用進行挽救治療，可有效抑制病毒復制并延緩疾病進展。

總之，本研究通過臨床大樣本研究，首次明確了rtA181S+T184I+M204I為一種新型多重耐藥突變，并分析了其臨床發(fā)生特點，有助于加深對HBV耐藥突變的認識，為臨床合理治療多重耐藥患者提供幫助。