董家勇，滕飛，郭聞淵，施曉敏，傅志仁，丁國善，楊璟輝

海軍軍醫(yī)大學(xué)第二附屬醫(yī)院器官移植科，上海 200003

原發(fā)性肝癌(肝癌)是臨床常見的惡性腫瘤之一，其病死率居全球癌癥的第2位[1]。目前手術(shù)切除肝癌腫瘤組織和肝移植是治療肝癌的主要方法[2]， 前者術(shù)后5年生存率普遍較低，而后者是一種較理想的療法，可根治性切除腫瘤，使肝臟的微環(huán)境和功能完全恢復(fù)，若受者選擇適當(dāng)，術(shù)后5年生存率高達65%～80%[3]。有研究發(fā)現(xiàn)，肝癌肝移植術(shù)后過度服用免疫抑制劑會促進腫瘤復(fù)發(fā)，降低療效[4]。 相比之下，維持最低有效免疫抑制濃度既可有效抑制排斥的發(fā)生，又可延緩腫瘤復(fù)發(fā)及進展。因此，如何維持最低有效免疫抑制濃度已成為各肝移植中心亟待解決的問題。近年來，臨床上采用ImmuKnowTM免疫細(xì)胞功能測定試劑盒檢測外周血CD4+T淋巴細(xì)胞的腺嘌呤核苷三磷酸(adenosine triphophate，ATP)含量，IOTest試劑盒檢測其亞群計數(shù)，以評估受體細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)(cellmediated immunity，CMI)狀態(tài)[5]。多個臨床試驗結(jié)果顯示，CD4+T淋巴細(xì)胞的ATP含量和亞群計數(shù)與移植術(shù)后的機體免疫狀態(tài)明顯相關(guān)，可作為評估器官移植術(shù)后免疫狀態(tài)的參考指標(biāo)[6-7]。本研究通過測定肝癌肝移植術(shù)后患者CD4+T淋巴細(xì)胞ATP含量和亞群計數(shù)，評估患者免疫狀態(tài)的變化，為制定個體化、精準(zhǔn)化的免疫抑制治療方案提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2015年11月－2018年11月于上海長征醫(yī)院因原發(fā)性肝癌行經(jīng)典原位肝移植術(shù)的84例患者，所有入組患者均符合肝癌肝移植受體選擇的“杭州標(biāo)準(zhǔn)”；器官供體、受體的ABO血型相同。根據(jù)腫瘤是否復(fù)發(fā)將患者分為復(fù)發(fā)組(n=42)與未復(fù)發(fā)組(n=42)。復(fù)發(fā)組:男38例，女4例；年齡35～66歲；復(fù)發(fā)部位包括肝內(nèi)(24例)、肺(11例)、椎體(3例)、肝門部淋巴結(jié)(2例)、右腎上腺(1例)及心包旁淋巴結(jié)(1例)。未復(fù)發(fā)組:男37例，女5例；年齡33～65歲。本研究經(jīng)長征醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，所有患者均簽署知情同意書。

1.2術(shù)后免疫抑制治療方案 所有患者術(shù)后免疫抑制治療方案均采用經(jīng)典三聯(lián)療法，即他克莫司(tacrolimus，F(xiàn)K506)+麥考酚嗎乙酯(mycophenolate mofetil，MMF)+甲潑尼龍。其中FK506劑量為0.05～0.10 mg/kg，每12 h口服1次，終身維持服用；MMF于術(shù)后1周開始口服，0.5 g/12 h，3個月后停用；甲潑尼龍用法為第1周靜脈滴注，術(shù)中無肝期1000 mg，術(shù)后第1天240 mg，以后40 mg/d逐漸減量，直至術(shù)后第7天改為口服甲潑尼龍片劑20 mg，維持1個月后停用。

1.3CD4+T淋巴細(xì)胞內(nèi)ATP含量及亞群計數(shù) 在排除感染和免疫排斥的情況下采集全血標(biāo)本，采集時間為確診復(fù)發(fā)當(dāng)日[術(shù)后(13.7±5.4)個月]，復(fù)發(fā)后第1、3、6個月；未復(fù)發(fā)患者全血標(biāo)本以與復(fù)發(fā)患者確診復(fù)發(fā)當(dāng)日相同術(shù)后時間為起點，之后1、3、6個月進行采集。采集后6 h內(nèi)完成細(xì)胞刺激培養(yǎng)，并于次日按照ImmuKnowTM免疫細(xì)胞功能測定試劑盒步驟檢測CD4+T淋巴細(xì)胞ATP含量，按照IOTest試劑盒(日本BECKMAN-COULTER流式細(xì)胞儀)說明書步驟檢測其亞群計數(shù)。

1.4統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 24.0和Graphpad Prism 8軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料以±s表示。組間及組內(nèi)比較采用分層重復(fù)測量數(shù)據(jù)的方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。在進行分層重復(fù)測量數(shù)據(jù)的方差分析時，先進行Mauchly's球?qū)ΨQ檢測，若P＜0.05，則采用Greenhouse-Geisser自由度校正結(jié)果。

2 結(jié) 果

2.1兩組CD4+T淋巴細(xì)胞ATP含量比較 Mauchly's球?qū)ΨQ檢測結(jié)果顯示，CD4+T淋巴細(xì)胞ATP含量不隨腫瘤復(fù)發(fā)時間的延長而發(fā)生變化(時間與時間及組別的交互項P值分別為0.824、0.647)。組間比較顯示，復(fù)發(fā)后第1、3、6個月，復(fù)發(fā)組患者CD4+T淋巴細(xì)胞ATP含量均明顯低于未復(fù)發(fā)組(P＜0.05， 圖1)。

圖1 兩組肝癌肝移植術(shù)后患者CD4+ T淋巴細(xì)胞ATP含量比較(n=42)Fig.1 Comparison of ATP contents in CD4+ T lymphocytes between the two groups of patients with liver cancer after liver transplantation

2.2兩組CD4+T淋巴細(xì)胞亞群計數(shù)比較 Mauchly's球?qū)ΨQ檢測結(jié)果顯示，CD4+T淋巴細(xì)胞亞群計數(shù)隨復(fù)發(fā)時間延長而降低，兩組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(時間與時間及組別的交互項P值均＜0.05)。組間比較顯示，與未復(fù)發(fā)組比較，復(fù)發(fā)組患者CD4+T淋巴細(xì)胞亞群計數(shù)在復(fù)發(fā)后第1個月內(nèi)基本維持穩(wěn)定，復(fù)發(fā)后第3～6個月呈明顯下降趨勢(P＜0.05，圖2)。

圖2 兩組患者CD4+ T淋巴細(xì)胞亞群計數(shù)比較(n=42)Fig.2 Comparison of subgroup count of CD4+ T lymphocytes between the two groups of patients with liver cancer after liver transplantation

3 討 論

腫瘤復(fù)發(fā)會影響肝移植患者的長期生存，其病理演變過程較復(fù)雜，涉及多環(huán)節(jié)、多系統(tǒng)、多階段、多通路等。有研究發(fā)現(xiàn)，促進肝移植術(shù)后腫瘤復(fù)發(fā)或復(fù)發(fā)后加速惡化的影響因素較多，按移植手術(shù)階段不同包括:移植前的肝癌腫瘤組織侵犯了肝內(nèi)脈管系統(tǒng)、淋巴組織等；移植手術(shù)期間腫瘤組織殘留在體內(nèi)；移植后長期過度免疫抑制加速微轉(zhuǎn)移灶的生長等。已有研究表明，過度免疫抑制為可調(diào)節(jié)因素，可影響肝癌肝移植術(shù)后腫瘤復(fù)發(fā)或復(fù)發(fā)后加速其進展[8]。肝癌肝移植術(shù)后的抗腫瘤過程主要由細(xì)胞免疫反應(yīng)介導(dǎo)，其中CD4+T淋巴細(xì)胞是機體CMI的啟動細(xì)胞。目前臨床上常用的鈣調(diào)磷酸酶抑制劑以CD4+T淋巴細(xì)胞為靶細(xì)胞，能夠抑制線粒體呼吸鏈，致使其ATP含量和亞群計數(shù)降低[9]。肝癌肝移植患者受到持續(xù)免疫抑制，其機體抗腫瘤能力下降，腫瘤易復(fù)發(fā)[10]。因此，定量監(jiān)測術(shù)后CD4+T淋巴細(xì)胞的ATP含量和亞群計數(shù)可量化評估受者免疫功能狀態(tài)，在不發(fā)生排斥反應(yīng)的情況下，調(diào)整免疫抑制劑用量，盡可能維持較低的免疫抑制劑濃度，對控制和延緩腫瘤復(fù)發(fā)具有重要意義。

T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫應(yīng)答的前提是CD4+T淋巴細(xì)胞活化[11]。有研究表明，可通過檢測外周血CD4+T淋巴細(xì)胞的免疫功能間接反映受檢者的CMI狀態(tài)[12]。盡管外周血CD4+T淋巴細(xì)胞的免疫功能在不同個體之間差異較大，但在健康及移植后免疫狀態(tài)穩(wěn)定的個體中，CD4+T淋巴細(xì)胞的ATP含量和亞群計數(shù)相對穩(wěn)定。當(dāng)移植受者因持續(xù)免疫抑制導(dǎo)致CMI降低時，其外周血CD4+T淋巴細(xì)胞的ATP含量和亞群計數(shù)均明顯降低[13-14]。2016年Zhang等[5]采用ImmuKnowTM法檢測76例肝癌肝移植術(shù)后患者CD4+T淋巴細(xì)胞ATP含量，結(jié)果顯示，健康人與免疫狀態(tài)穩(wěn)定的受者ATP含量均＞300 ng/ml，而腫瘤復(fù)發(fā)受者的ATP含量為190 ng/ml。

已有研究發(fā)現(xiàn)，肝癌肝移植術(shù)后腫瘤復(fù)發(fā)患者應(yīng)用免疫抑制劑可在一定程度上抑制機體內(nèi)細(xì)胞免疫系統(tǒng)，導(dǎo)致患者抗腫瘤能力進一步降低，因此，術(shù)后應(yīng)用免疫抑制劑是促進腫瘤復(fù)發(fā)后進展加速的重要因素之一[15-16]。Lerut等[17]分析了引起肝癌肝移植術(shù)后腫瘤復(fù)發(fā)的各種因素，發(fā)現(xiàn)術(shù)后免疫抑制劑的用量是影響腫瘤復(fù)發(fā)的獨立因素。Piros等[18]定量分析肝癌肝移植后復(fù)發(fā)的影響因素發(fā)現(xiàn)，低劑量的免疫抑制劑可抑制復(fù)發(fā)腫瘤細(xì)胞的快速進展。上述研究結(jié)果表明，術(shù)后免疫抑制劑的用量與腫瘤復(fù)發(fā)或復(fù)發(fā)后加速進展存在一定關(guān)聯(lián)，理論上免疫狀態(tài)的評估可指導(dǎo)免疫抑制劑的用量，為肝癌肝移植術(shù)后腫瘤復(fù)發(fā)患者制定個體化、精準(zhǔn)化的免疫抑制劑方案提供依據(jù)。

目前，利用肝癌肝移植術(shù)后復(fù)發(fā)患者外周血CD4+T淋巴細(xì)胞ATP含量和亞群計數(shù)評估免疫狀態(tài)的研究較少。本研究納入的研究對象(排除感染和排異患者)均處于免疫抑制相對穩(wěn)定的狀態(tài)，其CD4+T淋巴細(xì)胞ATP含量和亞群計數(shù)均低于健康人群。本課題組的前期研究發(fā)現(xiàn)，CD4+T淋巴細(xì)胞的亞群計數(shù)與ATP含量之間無明顯的線性相關(guān)，兩者是相對獨立的[19]。本研究結(jié)果顯示，與肝癌肝移植術(shù)后未復(fù)發(fā)患者相比，復(fù)發(fā)患者的CD4+T淋巴細(xì)胞ATP含量在確診復(fù)發(fā)后6個月內(nèi)的不同時期均明顯降低，原因可能為CD4+T淋巴細(xì)胞ATP含量的變化早于腫瘤復(fù)發(fā)，即當(dāng)患者確診腫瘤復(fù)發(fā)時，CD4+T淋巴細(xì)胞ATP含量已經(jīng)下降至較低水平。肝癌肝移植術(shù)后復(fù)發(fā)3個月后，可通過檢測CD4+T淋巴細(xì)胞亞群計數(shù)來有效判斷復(fù)發(fā)的免疫狀態(tài)，指導(dǎo)調(diào)節(jié)免疫抑制劑用量。對于肝癌肝移植術(shù)后復(fù)發(fā)患者的免疫抑制劑用量，可通過監(jiān)測外周血CD4+T淋巴細(xì)胞ATP含量和亞群計數(shù)來及時調(diào)整并維持最低有效濃度，可能有助于延緩腫瘤復(fù)發(fā)。因此，筆者認(rèn)為通過外周血CD4+T淋巴細(xì)胞ATP含量和亞群計數(shù)為肝癌肝移植患者擬定個體化治療方案具有重要的臨床意義。

雖然本研究結(jié)果顯示，通過外周血CD4+T淋巴細(xì)胞ATP含量來評估肝癌肝移植術(shù)后復(fù)發(fā)早期的免疫狀態(tài)更為敏感，但移植后腫瘤復(fù)發(fā)患者的免疫狀態(tài)是變化的，并非維持穩(wěn)定狀態(tài)，其隨腫瘤復(fù)發(fā)后的治療及腫瘤的不斷進展呈現(xiàn)逐漸下調(diào)趨勢，因此在積極抗腫瘤治療的同時，可早期減少免疫抑制劑用量，維持最低有效濃度，以提高機體抗腫瘤能力。本研究為單中心、小樣本研究，未來需要開展前瞻性、多中心、大樣本研究進一步證實肝癌肝移植術(shù)后復(fù)發(fā)患者能否使用免疫增強劑(如胸腺肽等)進行聯(lián)合治療。