付春燕，李祿全，肖灑，艾青，王政力

重慶醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院新生兒診治中心/兒童發(fā)育疾病研究教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/兒童發(fā)育重大疾病國家國際科技合作基地/兒科學(xué)重慶市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/國家住院醫(yī)師規(guī)范化培訓(xùn)示范基地，重慶 400014

腸道是人類微生物種群最多、最復(fù)雜的部位，在成人腸道內(nèi)有400多種細(xì)菌，總數(shù)達(dá)1×1014個[1]。 穩(wěn)定的腸道菌群可使宿主從多個方面獲益，包括營養(yǎng)轉(zhuǎn)化、提供維生素、免疫反應(yīng)的成熟等[2-5]。新生兒出生后腸道菌群定植受多種因素影響，包括宿主遺傳學(xué)、胎齡、生產(chǎn)方式、喂養(yǎng)方式及藥物，尤其是抗生素的應(yīng)用[5-6]。研究表明，腸道菌群多樣性的改變可在抗生素治療幾天內(nèi)迅速發(fā)生[7-8]。腸道菌群失衡與新生兒期及以后多種疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，如新生兒壞死性小腸結(jié)腸炎、炎癥性腸病、肥胖、代謝性疾病、哮喘、自身免疫性疾病及過敏等[9]，因此，及時監(jiān)測腸道菌群變化具有重要的臨床意義。目前監(jiān)測菌群的方法主要包括細(xì)菌培養(yǎng)及16S rDNA高通量測序技術(shù)，但其耗時長、價格高，且不能動態(tài)反映菌群的變化情況，臨床應(yīng)用存在較大局限性。因此，尋找一種能夠快速、便捷、靈敏地反映腸道菌群變化的指標(biāo)具有重要的臨床價值。

自誘導(dǎo)因子-2(autoinducing molecule-2，AI-2)是廣泛存在于革蘭陰性菌及革蘭陽性菌的群體感應(yīng)(quorum sensing，QS)信號分子，被認(rèn)為是菌種間交流的“公共語言”[10-11]。AI-2對菌群具有廣泛的調(diào)控作用，能調(diào)控腸道不同菌群的增殖、定植、毒力、生物膜形成、生物發(fā)光等行為[12-13]。有動物研究發(fā)現(xiàn)，腸道AI-2水平變化與腸道微生物群的改變有關(guān)[14]。AI-2是否可用于臨床監(jiān)測新生兒腸道菌群的變化，目前尚未見相關(guān)報道。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，使用抗生素7 d時患兒腸道菌群有明顯變化，但在使用3 d時，菌群在菌門水平無明顯差異，僅一個菌屬開始出現(xiàn)差異[15]，而此時AI-2是否已經(jīng)發(fā)生明顯變化尚不清楚。本研究旨在探討新生兒腸道菌群改變初期(使用抗生素3 d)AI-2是否發(fā)生改變。

1 資料與方法

1.1研究對象 選取重慶醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院新生兒中心2018年1－7月收治的34例新生兒，患病病種為新生兒病理性黃疸、新生兒肺炎或新生兒敗血癥。將34例患兒分為抗生素組與對照組，每組17例?？股亟M納入標(biāo)準(zhǔn):①患兒患病后直接入住我科，院外未使用過抗生素；②入院后立即使用廣譜抗生素治療，且住院期間使用超過3 d。按抗生素的使用類別將本組17例患兒分為阿莫西林克拉維酸鉀組(n=8)、頭孢噻肟組(n=7)，另2例聯(lián)合使用以上兩種抗生素的患兒除外。對照組納入標(biāo)準(zhǔn):①所患疾病為黃疸或新生兒肺炎，未使用抗生素；②住院時間超過3 d，且住院前3 d未使用過抗生素。兩組患兒的日齡、胎齡、喂養(yǎng)方式、生產(chǎn)方式差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05，表1)。兩組中肺炎、黃疸兩種疾病對AI-2相對發(fā)光值的影響差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。本研究獲得重慶醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)(批準(zhǔn)號2017-125)。

表1 兩組新生兒基本信息比較(n=17)Tab.1 Comparison of the general information between two groups of infants (n=17)

1.2方法

1.2.1標(biāo)本采集 采用病房專用一次性糞便收集管收集兩組患兒住院第3天(使用抗生素3 d)的糞便標(biāo)本；此外，從抗生素組中選取10例新生兒，以使用抗生素前為自身對照，收集使用前和使用抗生素3 d后的大便。將收集到的標(biāo)本用冰盒轉(zhuǎn)運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室，分裝于已消毒的1.5 ml EP管中，-80 ℃凍存。

1.2.2上清液制備 稱量糞便標(biāo)本40 mg，與1.6 ml的2216E液體培養(yǎng)基(青島日水生物科技有限公司)混合，旋渦震蕩5 min，5 000 r/min、4 ℃離心10 min后過濾，留作樣本待測液。將哈維弧菌BB170報告株(中國科技大學(xué)孫寶林院士惠贈)接種于2216E液體培養(yǎng)基中，30 ℃、200 r/min振蕩20 h，培養(yǎng)過夜，14 000 r/min、4 ℃離心10 min，使用0.22 μm已高溫消毒的一次性濾器過濾，保存于-20 ℃?zhèn)溆?。分別以哈維弧菌BB170和2216E液體培養(yǎng)基過濾上清作為陽性對照及陰性對照，以1 μmol/L AI-2溶液為標(biāo)準(zhǔn)液。

1.2.3糞便AI-2的相對發(fā)光值測定 按照文獻(xiàn)[16-17]的方法，將哈維弧菌BB170培養(yǎng)過夜，使用新鮮2216E液體培養(yǎng)基以1:5000進(jìn)行稀釋。每180 μl哈維弧菌BB170稀釋液與20 μl待測液體(兩組糞便上清液、AI-2標(biāo)準(zhǔn)液、2216E培養(yǎng)基、哈維弧菌BB170上清液)混合，加入96孔酶標(biāo)板(Corning公司，美國)，置于120 r/min、30 ℃恒溫?fù)u床中孵育，2.5 h后每隔30 min使用多功能酶標(biāo)儀(Thermo公司，美國)檢測其生物發(fā)光值，直至陰性對照組的值降至最低時各組讀數(shù)為最終測得值。將AI-2標(biāo)準(zhǔn)液的發(fā)光值設(shè)為100%，其余各組的發(fā)光值與AI-2標(biāo)準(zhǔn)液發(fā)光值的比值代表樣本的相對發(fā)光值。

1.2.4糞便樣本微生物群落分析 取出-80 ℃凍存的糞便標(biāo)本，提取微生物DNA，按照QIAamp FAST DNA Stool Mini-Kit (Qiagen公司，德國)試劑盒說明書操作。使用通用引物338F(5'-barcode-ACTCCTACG G G AG G CAG CA-3')及806R(5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3')擴(kuò)增16S rDNA基因的V3+V4區(qū)域。PCR反應(yīng)條件為:95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃ 30 s、55 ℃ 30 s、72 ℃ 45 s，共27個循環(huán)；最后72 ℃ 10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳分離后，使用AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒(AXYGEN公司)回收PCR產(chǎn)物，然后用QuantiFluorTM-ST藍(lán)色熒光定量系統(tǒng)(Promega，美國)進(jìn)行定量檢測，最后按照Illumina Miseq平臺相關(guān)流程建庫并上機(jī)測序。獲得的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行優(yōu)化，刪除讀數(shù)尾部質(zhì)量值20以下的堿基，過濾重疊長度＞10 bp的讀數(shù)、拼接序列重疊區(qū)域錯配率＞0.2的讀數(shù)以及barcode序列有錯配的讀數(shù)。對優(yōu)化后的序列通過Usearch(7.0版)進(jìn)行操作分類單位(operational taxonomic unit，OTU)劃分，通常對97%相似水平下的OUT進(jìn)行生物信息統(tǒng)計(jì)分析，對兩組患兒腸道菌群多樣性及物種豐富度進(jìn)行比較，并分析菌群群落組成。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 24.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。對計(jì)量資料進(jìn)行正態(tài)分布檢驗(yàn)，符合正態(tài)分布且方差齊的計(jì)量資料以±s表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)；非正態(tài)分布的計(jì)量資料以M(Q1，Q3)表示，組間比較采用秩和檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料以例表示，組間比較采用Fisher精確概率法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1兩組糞便A I-2 相對發(fā)光值比較 在抗生素組中，使用阿莫西林克拉維酸鉀與使用頭孢噻肟的患兒糞便A I-2 相對發(fā)光值分別為74.643±33.230、83.332±33.203，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-0.505，P＞0.05)?？股亟MAI-2的相對發(fā)光值為57.68(50.56，103.13)，明顯低于對照組的112.63(87.20，163.57)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=3.62，P＜0.001)。在自身對照組中，使用抗生素后AI-2的相對發(fā)光值為90.21±41.20，使用前為113.29±66.27，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.935，P＞0.05)。

2.2菌群多樣性及物種豐富度比較 兩組34例樣本通過Miseq平臺測序序列優(yōu)化后，總共獲得1 126 590條優(yōu)化序列數(shù)以及288個OTU。兩組患兒腸道菌群香農(nóng)威納指數(shù)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(0.83±0.45 vs. 1.02±0.46，t=1.284，P=0.228)，Chao指數(shù)比較差異亦無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(31.9±18.55 vs. 33.63±25.35，t=0.017，P=0.821)。

2.3菌群群落組成分析 將兩組樣本分別在門水平和屬水平上進(jìn)行群落組成分析。在門水平分析中，從整體上看，兩組間厚壁菌門有增加趨勢、變形菌門有減少趨勢，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05，圖1A)。在屬水平上，抗生素組中腸球菌屬明顯高于對照組(P=0.002)，而檸檬酸桿菌屬則明顯低于對照組(P=0.017)，其余菌群構(gòu)成變化差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05，圖1B)。

3 討 論

新生兒腸道菌群失衡可導(dǎo)致多種疾病，如新生兒壞死性小腸結(jié)腸炎及喂養(yǎng)不耐受等。引起菌群失衡的最主要危險因素是抗生素的不合理使用[18]。應(yīng)用抗生素可改變腸道菌群的組成，如環(huán)丙沙星會短暫降低腸道菌群多樣性，大環(huán)內(nèi)酯類抗生素會導(dǎo)致腸道厚壁菌門和放線菌菌群減少、擬桿菌門和變形菌門增加[19]。動物研究發(fā)現(xiàn)，長期使用鏈霉素會大幅度降低腸道菌群的多樣性，甚至僅使用2 d后腸道厚壁菌門菌群就由原來的42.9%降低到不足5.0%，而擬桿菌門則由47.8%增加至90.0%[14]。本研究發(fā)現(xiàn)，在屬水平上，抗生素組腸球菌屬明顯高于對照組(P=0.002)，檸檬酸桿菌屬明顯低于對照組(P=0.017)；在門水平上，兩組間的厚壁菌門、變形菌門、擬桿菌門無明顯差異，與前期研究[15]相似，提示即使短期使用抗生素，也會對新生兒腸道菌群造成一定影響。

有研究發(fā)現(xiàn)，AI-2廣泛存在于革蘭陰性菌及革蘭陽性菌中，是群體感應(yīng)系統(tǒng)中細(xì)菌間信息交流的通用信號分子[20-21]。AI-2通過密度依賴的方式來調(diào)節(jié)細(xì)菌的生物學(xué)功能，包括共生、毒力、運(yùn)動性、抗生素產(chǎn)生及生物膜形成等[12]。在最適AI-2濃度下，菌群處于動態(tài)穩(wěn)定狀態(tài)，而AI-2濃度明顯下降時會打破菌種間及種內(nèi)的細(xì)菌交流，致使致病菌更易繁殖[22]。同時腸道的AI-2變化可影響腸道菌群的組成[23]。有研究發(fā)現(xiàn)，添加AI-2的前體物質(zhì)S-4， 5-二羥基-2，3-戊二酮(DPD)達(dá)到一定濃度時，可明顯抑制白色念珠菌生物膜的形成[24]。本研究發(fā)現(xiàn)，新生兒糞便AI-2的變化十分靈敏，在菌群改變初期，AI-2已有顯著改變。因此，腸道AI-2水平可能是一個簡易、快捷、廉價、無創(chuàng)監(jiān)測腸道菌群多樣性改變的指標(biāo)。

圖1 兩組新生兒樣本間菌群差異分析Fig.1 Analysis of flora difference between two groups of infants

本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，長時間(≥7 d)使用抗生素可使患兒腸道菌群發(fā)生明顯變化，而使用抗生素3 d時，腸道菌群變化并不明顯[15]。本研究通過自身對照試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，使用抗生素前后的AI-2活性無明顯差異，且有3例患兒(日齡均＜7 d)使用抗生素后AI-2水平反而升高，可能是因?yàn)樾律鷥耗c道菌量在出生后1周左右達(dá)到初步的演替平衡[25-26]，而此時使用抗生素時間尚短，尚不足以引起AI-2的降低。由于新生兒早期腸道菌群處于快速變化的狀態(tài)，出生后數(shù)天內(nèi)其腸道菌群的定植可有較大變化，進(jìn)而可影響AI-2濃度的高低，故本研究采取1:1嚴(yán)格匹配的方式進(jìn)行對比研究，結(jié)果顯示，抗生素組與對照組的腸道群菌結(jié)構(gòu)在門水平上無明顯差異，僅腸球菌屬、檸檬酸桿菌屬出現(xiàn)明顯差異，這與本課題組前期關(guān)于自身對照組的菌群檢測結(jié)果一致[15]。

綜上所述，本研究結(jié)果提示監(jiān)測AI-2可能有助于早期預(yù)測腸道菌群的改變。此外，本研究雖然對抗生素種類進(jìn)行了匹配，但是由于樣本量較小，關(guān)于抗生素使用時間、抗生素種類對AI-2的影響還需進(jìn)一步研究。