石珊，李夢(mèng)凡，王玲，古蘭，田雨欣，舒歡

空軍軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院燒傷與皮膚外科，西安 710032

燒傷后創(chuàng)面愈合是一個(gè)復(fù)雜的病理生理過(guò)程，包括炎癥、細(xì)胞增殖、傷口收縮、膠原代謝，以及細(xì)胞、胞外基質(zhì)與細(xì)胞因子間繁雜的相互作用[1]。 作為創(chuàng)面愈合修復(fù)的重要效應(yīng)細(xì)胞，成纖維細(xì)胞在傷后瘢痕形成及傷口的再塑過(guò)程中起著關(guān)鍵性的作用[2-3]。燒傷創(chuàng)面愈合往往形成增生性瘢痕(hypertrophic scar，HS)，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì) 量[4-9]。因此，加速創(chuàng)面愈合、預(yù)防或減少增生性瘢痕的形成已成為燒傷領(lǐng)域的重要研究課題[10-12]。燒傷造成的皮膚屏障破損往往引起微生物的侵襲，革蘭陰性(G-)菌是燒傷感染常見的微生物，能夠在傷口表面釋放大量的內(nèi)毒素(endotoxin)，對(duì)細(xì)胞及胞外基質(zhì)成分造成損害，延緩創(chuàng)面愈合，甚至引起傷口嚴(yán)重感染。脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)作為內(nèi)毒素的化學(xué)成分，其活性、細(xì)胞毒性及免疫性往往預(yù)示著傷口愈合及瘢痕形成的情況[13-14]。本研究利用體外培養(yǎng)的正常皮膚及增生性瘢痕組織的成纖維細(xì)胞，觀察LPS作用下細(xì)胞纖維化相關(guān)因子的表達(dá)及亞顯微結(jié)構(gòu)的變化，并基于小鼠創(chuàng)面愈合模型，探討LPS對(duì)真皮成纖維細(xì)胞纖維化相關(guān)因子及增生性瘢痕形成的影響。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2017年11月－2018年11月西京醫(yī)院燒傷與皮膚外科收治的燒傷早期增生性瘢痕手術(shù)患者24例，其中男11例，女13例，年齡11～52(37.3±6.8)歲。納入標(biāo)準(zhǔn):①燒傷創(chuàng)面愈合時(shí)間12個(gè)月以內(nèi)；②前期未接受其他瘢痕增生治療或防治；③無(wú)感染、器質(zhì)性疾病、自身免疫性疾病等；④臨床表現(xiàn):燒傷受損部位瘢痕高出體表，充血明顯，色澤潮紅，伴疼痛、瘙癢等癥狀；⑤患者知情同意并經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)審查批準(zhǔn)。取患者增生性瘢痕組織(面頸部6例，軀干9例，上肢7例，下肢2例)及其周圍正常皮膚組織用于實(shí)驗(yàn)。

1.2試劑與儀器 LPS購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；抗Ⅰ型膠原(collagen Ⅰ，ColⅠ)兔多克隆抗體、抗Ⅲ型膠原(collagen Ⅲ，ColⅢ)兔多克隆抗體購(gòu)自英國(guó)Abcam公司；抗α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)兔單克隆抗體、抗β-actin兔單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling公司。ABI7500熒光定量PCR儀購(gòu)自美國(guó)ABI公司；JEM-123透射電鏡購(gòu)自日本JEOL公司。

1.3增生性瘢痕組織病理形態(tài)學(xué)觀察 取患者組織制作石蠟切片，行常規(guī)HE染色及Masson染色；每張切片鏡下選取6個(gè)視野，掃描成纖維細(xì)胞數(shù)目及膠原灰度，以膠原蛋白指數(shù)即灰度所占比例反映增生性瘢痕組織(HS組)與正常皮膚組織(NS組)成纖維細(xì)胞合成膠原蛋白的情況。

1.4真皮成纖維細(xì)胞的培養(yǎng) 切取適量增生性瘢痕組織及正常皮膚組織，分別剪切成0.5～1.0 mm3小塊，用彎頭吸管將其均勻接種在培養(yǎng)瓶中，翻轉(zhuǎn)置于37 ℃孵育6 h；將培養(yǎng)瓶轉(zhuǎn)正，加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)；待成纖維細(xì)胞爬滿，用0.25%胰蛋白酶消化、傳代、凍存，取第3～5代成纖維細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.5LPS致瘢痕形成細(xì)胞模型的建立 將凍存的成纖維細(xì)胞復(fù)蘇培養(yǎng)至融合度90%～100%時(shí)傳代。設(shè)正常皮膚成纖維細(xì)胞對(duì)照組(NSFs組)、正常皮膚成纖維細(xì)胞LPS處理組(NSFs+LPS組)、同代增生性瘢痕組織成纖維細(xì)胞組(HSFs組)。細(xì)胞融合度70%～80%時(shí)用于實(shí)驗(yàn)。

1.6纖維化相關(guān)因子表達(dá)水平檢測(cè) 采用反轉(zhuǎn)錄實(shí)時(shí)定量PCR(reverse transcription-qPCR，RT-qPCR)檢測(cè)纖維化相關(guān)因子mRNA的表達(dá)水平。提取患者正常皮膚、增生性瘢痕組織及體外培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以其為模板行qPCR，以GAPDH為內(nèi)參，測(cè)定纖維化相關(guān)因子ColⅠ、ColⅢ、α-SMA的mRNA相對(duì)表達(dá)水平。引物序列見表1。

采用免疫組織化學(xué)和Western blotting法檢測(cè)纖維化相關(guān)因子蛋白的表達(dá)水平。取患者組織的石蠟切片或固定的成纖維細(xì)胞爬片，進(jìn)行ColⅠ、ColⅢ、α-SMA的免疫組化染色，計(jì)算陽(yáng)性著色強(qiáng)度或陽(yáng)性細(xì)胞率。另取培養(yǎng)細(xì)胞樣品，充分裂解后提取蛋白，進(jìn)行纖維化因子的Western blotting檢測(cè)，評(píng)價(jià)其蛋白表達(dá)情況。

1.7成纖維細(xì)胞亞顯微結(jié)構(gòu)的觀察 體外培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞用2.5%戊二醛固定，離心后再次固定，常規(guī)透射電鏡制片，觀察細(xì)胞亞顯微結(jié)構(gòu)。

表1 纖維化相關(guān)因子的引物序列Tab.1 The primer sequences of fibrosis-related factors

1.8LPS對(duì)小鼠創(chuàng)面愈合模型的影響 6～8周齡18～20 g雄性BALB/c小鼠12只，購(gòu)于本校動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，常規(guī)環(huán)境飼養(yǎng)。應(yīng)用10% NaS脫去小鼠背毛，隔天制備1.0 cm×0.5 cm創(chuàng)面；隨機(jī)均分為L(zhǎng)PS組和PBS組，分別按5 mg/kg體重腹腔注射LPS或等體積PBS；并于第3天、第5天各追加一次；經(jīng)3周后創(chuàng)面愈合，脫臼處死小鼠，采集愈合組織，制備石蠟切片，進(jìn)行HE染色、Masson染色，光鏡下觀察創(chuàng)面大小及其真皮形態(tài)結(jié)構(gòu)。

1.9統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以±s表示，組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1增生性瘢痕組織的病理形態(tài)學(xué)變化 HE染色后，視野內(nèi)可見嗜蘇木精著藍(lán)色的細(xì)胞核、伊紅染色的細(xì)胞質(zhì)和胞外基質(zhì)成分。統(tǒng)計(jì)顯示，增生性瘢痕組織與正常皮膚組織成纖維細(xì)胞數(shù)的比值為2.43±0.48，增生性瘢痕組織中成纖維細(xì)胞明顯增多(P＜0.05，圖1A-C)。Masson染色結(jié)果顯示，增生性瘢痕組織中膠原纖維粗大，排列紊亂，有些成漩渦狀，染色深；正常皮膚組織膠原纖維排列規(guī)則，整齊有序，染色較淺；灰度掃描結(jié)果顯示增生性瘢痕組織與正常皮膚組織膠原蛋白指數(shù)的比值為3.90±1.23，增生性瘢痕組織中膠原蛋白明顯增多(P＜0.01，圖1D-F)。

2.2增生性瘢痕組織中纖維化相關(guān)因子的表達(dá)水平分析 RT-qPCR檢測(cè)結(jié)果顯示，與正常皮膚組織(NS)或其成纖維細(xì)胞(NSFs)相比，增生性瘢痕組織(HS)與其成纖維細(xì)胞(HSFs)的ColⅠ、ColⅢ、α-SMA mRNA相對(duì)表達(dá)水平均明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖2，P＜0.05)。

免疫組化染色顯示，增生性瘢痕組織與正常皮膚組織ColⅠ、ColⅢ陽(yáng)性著色強(qiáng)度的相對(duì)比值分別為6.12±1.24(圖3A-C，P＜0.01)、5.31±1.63(圖3D-F，P＜0.05)；增生性瘢痕組織與正常皮膚組織α-SMA陽(yáng)性細(xì)胞的相對(duì)比值為10.21±3.67(圖3G-I，P＜0.01)。

2.3LPS對(duì)成纖維細(xì)胞纖維化相關(guān)因子表達(dá)的影響 RT-qPCR檢測(cè)結(jié)果顯示，0.5 μg/ml LPS刺激正常皮膚組織成纖維細(xì)胞24 h后，ColⅠ、ColⅢ、α-SMA的mRNA相對(duì)表達(dá)水平均較正常皮膚成纖維細(xì)胞顯著增高(P＜0.01，圖4A)。

圖1 增生性瘢痕組織(HS)與正常皮膚組織(NS)的HE與Masson染色(n=6)Fig.1 HE and Masson staining in hyperplastic scar tissue (HS) and normal skin tissue (NS) (n=6)

Western blotting檢測(cè)結(jié)果顯示，與正常皮膚組織成纖維細(xì)胞對(duì)照組相比，正常組織成纖維細(xì)胞LPS處理組、同代增生性瘢痕組織成纖維細(xì)胞組ColⅠ、ColⅢ、α-SMA蛋白表達(dá)水平均明顯增高 (P＜0.01)，而后兩組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05，圖4B-D)。

圖2 增生性瘢痕組織(HS)、正常皮膚組織(NS)及其成纖維細(xì)胞(HSFs、NSFs)纖維化相關(guān)因子mRNA的表達(dá)(n=3)Fig.2 mRNA expressions in HS, NS, and their fibrosis-related factors HSFs and NSFs of fibroblasts (n=3)

免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，正常皮膚成纖維細(xì)胞LPS處理組與正常皮膚成纖維細(xì)胞對(duì)照組ColⅠ陽(yáng)性著色強(qiáng)度之比為5.84±1.56，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01，圖5A、B、D)；同代增生性瘢痕組織成纖維細(xì)胞組與正常皮膚成纖維對(duì)照組ColⅠ陽(yáng)性著色強(qiáng)度之比為7.27±1.88，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.01，圖5A、C、D)；而正常皮膚成纖維細(xì)胞LPS處理組與同代瘢痕組織成纖維細(xì)胞組ColⅠ陽(yáng)性著色強(qiáng)度相比沒(méi)有明顯差異(P＞0.05，圖5B-D)。

2.4 L P S對(duì)成纖維細(xì)胞亞顯微結(jié)構(gòu)的影響 透射電鏡觀察顯示，正常皮膚組織成纖維細(xì)胞具有規(guī)則扁平的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、適量的溶酶體或自噬溶酶體及囊泡狀結(jié)構(gòu)(圖6 A)；L P S刺激的正常皮膚組織成纖維細(xì)胞則呈現(xiàn)出腫脹的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、萎縮的溶酶體及少量囊泡狀結(jié)構(gòu)(圖6 B)；增生性瘢痕組織成纖維細(xì)胞中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膨脹，含豐富的自噬溶酶體及囊泡狀結(jié)構(gòu) (圖6 C)。

圖3 增生性瘢痕組織(HS)與正常皮膚組織(NS)中纖維化相關(guān)因子的免疫組化染色(n=6)Fig.3 Immunohistochemical staining for fibrosis-related factors in HS and NS (n=6)

圖4 LPS對(duì)正常皮膚組織成纖維細(xì)胞纖維化相關(guān)因子表達(dá)水平的影響(n=3)Fig.4 Effects of LPS on the expression levels of NSFs (n=3)

圖5 LPS對(duì)成纖維細(xì)胞Col Ⅰ表達(dá)影響的免疫組織化學(xué)分析(n=6)Fig.5 Immunohistochemical analysis of the effect of LPS on fibroblast Col Ⅰ (n=6)

2.5LPS對(duì)小鼠創(chuàng)面愈合及瘢痕形成的影響 HE染色與Masson染色結(jié)果顯示，愈合創(chuàng)面周圍出現(xiàn)大量的毛囊結(jié)構(gòu)，LPS注射3周后愈合的創(chuàng)面真皮層(切口寬度為0.5 cm)在寬度上與PBS組相比有明顯差異(圖7A-D，箭頭所指)。愈合創(chuàng)面真皮層膠原纖維在PBS組規(guī)則有序(圖7C)，LPS組紊亂無(wú)序(圖7D)，而兩組膠原蛋白的分布未觀察到明顯差異(圖7C、D)。

圖6 LPS對(duì)成纖維細(xì)胞亞顯微結(jié)構(gòu)的影響Fig.6 Effects of LPS on the ultrastructure of fibroblasts

圖7 LPS對(duì)小鼠創(chuàng)面愈合及瘢痕形成的影響Fig.7 Effects of LPS on wound healing and scar formation in mice

3 討 論

傷口創(chuàng)面經(jīng)炎癥期、增殖修復(fù)期和再塑期愈合而形成瘢痕。炎癥期是創(chuàng)面愈合過(guò)程中的關(guān)鍵時(shí)期，決定著創(chuàng)面愈合的時(shí)間及愈后瘢痕的外觀。燒傷患者往往形成增生性瘢痕[10-11,15-18]。雖然目前增生性瘢痕的發(fā)生機(jī)制尚不明確，但越來(lái)越多的研究表明細(xì)菌成分及其延長(zhǎng)的炎癥反應(yīng)起著關(guān)鍵性的調(diào)節(jié)作用[13-14,19-21]。增生性瘢痕的發(fā)生往往是由創(chuàng)面發(fā)生感染引起的，且與慢性炎癥存在一定的相關(guān) 性[22-23]，LPS可能是其重要作用分子。

增生性瘢痕作為一種嚴(yán)重的皮膚纖維化疾病，其顯著特點(diǎn)是胞外基質(zhì)蛋白代謝紊亂及過(guò)度沉積，主要包括Ⅰ、Ⅲ型膠原，以及成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)化(以α-SMA為標(biāo)志蛋白)[19-21]。本研究發(fā)現(xiàn)，LPS可使正常皮膚組織成纖維細(xì)胞纖維化相關(guān)因子的表達(dá)明顯升高，胞外基質(zhì)蛋白過(guò)度沉積，誘導(dǎo)正常皮膚成纖維細(xì)胞向增生性瘢痕成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化，促進(jìn)瘢痕的形成。透射電鏡觀察顯示，正常皮膚組織成纖維細(xì)胞具有規(guī)則扁平的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、適量的溶酶體或自噬溶酶體及囊泡狀結(jié)構(gòu)，而LPS作用后正常皮膚組織的成纖維細(xì)胞呈現(xiàn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腫脹，與增生性瘢痕組織成纖維細(xì)胞中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)極度膨脹結(jié)構(gòu)相似。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)在纖維化相關(guān)因子的合成、加工和運(yùn)輸方面起著重要作用，提示LPS可增加成纖維細(xì)胞的異常分化，致使胞外基質(zhì)蛋白過(guò)度合成、分泌并沉積，引起正常皮膚成纖維細(xì)胞向增生性瘢痕成纖維細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化，進(jìn)而導(dǎo)致增生性瘢痕的形成，這與既往的研究結(jié)果相似[24-25]。本研究小鼠創(chuàng)面愈合模型結(jié)果顯示，LPS能夠延緩傷口愈合，導(dǎo)致愈合創(chuàng)面真皮結(jié)構(gòu)膠原纖維排列紊亂，增加了創(chuàng)面的瘢痕化，提示LPS是瘢痕形成的重要因素。

綜上所述，LPS作為炎性介質(zhì)能夠使正常皮膚成纖維細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)及功能發(fā)生改變，造成胞外基質(zhì)蛋白的過(guò)度沉積，從而引起成纖維細(xì)胞代謝、增殖、分化等生物學(xué)功能的改變，誘導(dǎo)正常成纖維細(xì)胞向增生性瘢痕成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化，最終導(dǎo)致增生性瘢痕的形成。