周琴，張心愿，葉亮，許皓，謝敏，張穎，譚彬，易勤，田杰，朱靜

重慶醫(yī)科大學附屬兒童醫(yī)院兒科研究所/兒童發(fā)育疾病研究教育部重點實驗室/國家兒童健康與疾病臨床醫(yī)學研究中心(重慶)/兒童發(fā)育重大疾病國家國際科技合作基地/兒科學重慶市重點實驗室，重慶 400014

心血管疾病是導致人類死亡的主要原因之一[1]。 由于心肌細胞不可再生，一旦心肌發(fā)生損傷將不可逆轉(zhuǎn)，因此，尋找可替代的細胞來源成為當前的研究重點[2-3]。誘導多能干細胞(induced pluripotent stem cells，iPSCs)是2006年由Takahashi研究團隊[4]利用基因編輯技術(shù)在小鼠成纖維細胞中導入4種關鍵干性因子[八聚體結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子3/4(octamer-binding transcription factor3/4，Oct-3/4)、性別決定區(qū)Y框蛋白2(sex determining region Y-box 2，SOX2)、細胞性骨髓細胞瘤癌基因(cellular-myelocytomatosis oncogene，c-MYC)、Krüppel樣因子4(Krüppel-like factor4，Klf4)]誘導而成的，具有自我更新、無限增殖及多向分化特性，同時又無免疫排斥及倫理學爭議等問題[5]。因此，人誘導多能干細胞衍生心肌細胞(human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes，hiPSC-CMs)在心血管疾病的再生醫(yī)學、疾病模型、心臟毒理研究、藥物研發(fā)、心臟發(fā)育等方面具有廣闊的應用前景[6-7]。近年來，盡管多能干細胞(PSCs)心肌分化的效率得到了顯著提升，但是目前對于分化過程中的代謝調(diào)控方式及其機制卻知之甚少。研究表明，PSCs主要利用有氧糖酵解供能并維持多能性狀態(tài)[8]，而分化的心肌細胞利用基于氧化磷酸化的有氧代謝來供能，表現(xiàn)為腺嘌呤核苷三磷酸(adenosine triphophate，ATP)合成增加、線粒體膜電位升高、氧化磷酸化代謝相關基因表達增高等[9-10]。心肌細胞直接利用的能量形式為ATP，ATP供能對于心肌細胞的功能及活性至關重要。有研究發(fā)現(xiàn)，雌激素受體(estrogen-related receptor，ERR)亞家族(包含ERRα、ERRβ及ERRγ 3個成員)在細胞代謝調(diào)節(jié)中發(fā)揮了重要作用。其中，ERRα是心臟等高能量需求器官中通過控制組織生物能量來調(diào)節(jié)內(nèi)穩(wěn)態(tài)的關鍵調(diào)節(jié)因子，在調(diào)控線粒體生物合成及氧化功能中具有重要作用[11-12]。但其在人誘導多能干細胞(hiPSCs)向hiPSCs-CMs分化前后的變化情況及調(diào)控ATP合成的機制卻未見報道。本研究分析hiPSCs向hiPSC-CMs分化前后ATP合成和ERRα及其下游靶基因的蛋白表達差異，初步探討ERRα對ATP合成的影響及其相關機制，為進一步闡明PSCs向心肌細胞分化過程中的代謝調(diào)控機制提供支持。

1 材料與方法

1.1細胞及主要試劑 未分化的hiPSCs細胞系、PGM1人多能干細胞培養(yǎng)基及PSCs消化液購自北京賽貝生物科技有限公司；基質(zhì)膠(Matrigel)購自美國BD公司；無葡萄糖RPMI 1640基礎培養(yǎng)基、含胰島素與不含胰島素的B27和腫瘤抗性抗原1-60(TRA-1-60)一抗購自美國Life Technologies公司；糖原合成激酶3(glycogen synthase kinase-3，GSK-3)抑制劑CHIR99021和Wnt信號抑制劑IWP-2購自美國Selleck公司；RPMI 1640基礎培養(yǎng)基與乳酸鈉購自美國Sigma公司；RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄定量PCR試劑盒及反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自日本TaKaRa公司；心肌肌鈣蛋白T2(TNNT2)、肌球蛋白重鏈6(MYH6)、GAPDH引物均合成于中國擎科生物科技有限公司；心肌肌鈣蛋白T(cTnT)、縫隙連接蛋白43(Cx43)、ERRα和細胞色素C(CytC)一抗購自英國Abcam公司；SOX2一抗和HRP標記的羊抗兔IgG二抗購自美國Proteintech公司；階段特異性胚胎抗原4(SSEA4)、線粒體丙酮酸載體1(MPC1)一抗購自美國Cell Signaling Technology公司；XCT790購自美國Med Chem Express公司；線粒體膜電位檢測試劑盒、BCA蛋白濃度測定試劑盒和ATP檢測試劑盒購自中國碧云天生物技術(shù)有限公司；羊抗小鼠IgGFITC和羊抗兔IgG-Cy3熒光二抗購自美國Santa Cruz公司。

1.2實驗方法

1.2.1hiPSCs的培養(yǎng)及心肌分化hiPSCs在Matrigel包被的平板上于無飼養(yǎng)細胞培養(yǎng)條件下應用PGM1人多能干細胞培養(yǎng)基維持培養(yǎng)(37 ℃，5%CO2)，至80%～95%融合后傳代。采用時序性短暫激活/抑制Wnt信號通路的方法將未分化的hiPSCs定向誘導分化為心肌細胞。當干細胞鋪板達到90%～100%融合時，更換培養(yǎng)基為無胰島素RPMI 1640+B27作為基礎培養(yǎng)基，首先添加GSK-3抑制劑CHIR99021(6 μmol/L)處理48 h，分化至第4天時采用Wnt通路阻滯劑IWP2(5 μmol/L)處理48 h。分化至第7天更換培養(yǎng)基為含胰島素RPMI 1640+B27的培養(yǎng)基。分化至第8天左右，即有細胞開始跳動。利用心肌細胞與非心肌細胞代謝方式的差異性，于分化第14天(此時絕大部分細胞可見明顯收縮活動)將培養(yǎng)基更換為含胰島素、4 mmol/L乳酸鈉的無葡萄糖RPMI 1640+B27培養(yǎng)基培養(yǎng)3 d，此時培養(yǎng)基中的主要供能物質(zhì)為乳酸，而其他非心肌細胞則失去能量供應而死亡。然后更換為含胰島素RPMI 1640+B27的培養(yǎng)基，于分化第18天左右，將心肌細胞消化成單細胞，再接種至新的平板中，然后應用含胰島素RPMI 1640+B27培養(yǎng)基維持培養(yǎng)。hiPSCs心肌分化方案如圖1所示。

1.2.2免疫熒光染色 在未分化及分化第18天時進行細胞爬片，并行免疫熒光染色，具體步驟如下:PBS洗3次，4%多聚甲醛固定細胞20 min，PBS漂洗5 min×3次，然后加入0.5% Trixon-100透膜10 min，PBS漂洗，5%牛血清白蛋白室溫封閉30 min，加入待測抗體(SOX2、SSEA4A、TRA-1-60、cTnT和Cx43一抗，均為1:200稀釋)，4 ℃孵育過夜。37 ℃復溫30 min，PBS漂洗5 min×3次，避光分別加入羊抗小鼠IgG-FITC或羊抗兔IgG-Cy3熒光二抗(均為1:200稀釋)，37 ℃避光孵育1 h，PBS漂洗5 min×3次，最后DAPI(1:20)染色20 min，PBS漂洗5 min×3次，90%甘油封片，倒置熒光顯微鏡觀察hiPSCs中多能性標志物SOX2、SSEA4A、TRA-1-60和分化第20天的hiPSC-CMs中心肌標志物cTnT、Cx43表達情況，并拍照保存。

1.2.3RT-qPCR檢測TNNT2及MYH6 mRNA的表達水平 Trizol法提取hiPSCs與分化第20天的心肌細胞RNA，反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。以cDNA為模板、GAPDH為內(nèi)參進行擴增，檢測心肌標志物TNNT2及MYH6 mRNA的表達水平。PCR反應條件:95 ℃預變性3 min；95 ℃ 5 s、60 ℃ 30 s，39個循環(huán)；65 ℃延伸5 s。結(jié)果以2-ΔΔCt法表示，取3次的平均值。引物序列見表1。

圖1 hiPSCs心肌分化方案Fig.1 Protocol of myocardial differentiation from hiPSCs

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

1.2.4Western blotting檢測ERRα、CytC及MPC1蛋白的表達水平 首先采用Western blotting檢測hiPSCs及分化第30天心肌細胞中的ERRα、CytC及MPC1蛋白水平。然后將分化第30天的心肌細胞分為4組:對照組(0 μmol/L)、5 μmol/L XCT790組、10 μmol/L XCT790組及15 μmol/L XCT790組，采用含相應濃度的ERRα特異性抑制劑XCT790的培養(yǎng)基處理心肌細胞24 h，Western blotting檢測不同濃度XCT790對ERRα的抑制作用以篩選XCT790最佳工作濃度。最后將分化第30天的心肌細胞分為對照組及XCT790組，以XCT790最佳工作濃度處理72 h后檢測細胞中CytC及MPC1蛋白的表達水平。步驟如下:①各組細胞中加入適量的細胞裂解液冰浴裂解細胞，獲取蛋白后使用BCA法進行蛋白濃度定量；②取等量蛋白(30 μg)進行SDS-PAGE電泳分離，將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上后，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h；③分別加入GAPDH、ERRα、MPC1及CytC抗體(1:1000)，放入4 ℃冰箱中孵育過夜，加入相應二抗室溫孵育1 h，使用ECL顯影液進行顯影；④采用Image Lab軟件對顯影條帶進行灰度分析。

1.2.5ATP檢測試劑盒檢測胞內(nèi)ATP含量 檢測hiPSCs與分化第30天心肌細胞內(nèi)ATP的含量。同時將分化第30天的心肌細胞分為對照組及XCT790組，對照組常規(guī)培養(yǎng)，XCT 7 9 0 組以篩選出的XCT790最佳工作濃度處理，72 h后檢測胞內(nèi)ATP含量。步驟如下:①按照1:9的比例用ATP檢測試劑稀釋液稀釋ATP檢測試劑，冰上保存；②吸除培養(yǎng)液，加入裂解液，細胞裂解后在4 ℃以12 000×g離心5 min，取上清，用于后續(xù)的測定；③加100 μl ATP檢測工作液到檢測孔內(nèi)，然后加入20 μl樣品或標準品，迅速用加樣槍混勻，至少間隔2 s后，采用化學發(fā)光儀測定化學發(fā)光值(RLU)；④根據(jù)標準曲線計算出樣品中ATP的濃度，同時應用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定樣品中的總蛋白濃度，把ATP的濃度換算成nmol/mg prot的形式。

1.2.6細胞計數(shù)試劑盒(CCK-8)檢測不同濃度XCT790對hiPSC-CMs細胞活力的影響 將分化第30天的心肌細胞以3×103個/孔的密度接種于96孔板，待細胞貼壁恢復搏動后分為4組:對照組(0 μmol/L)、5 μmol/L XCT790組、10 μmol/L XCT790組和15 μmol/L XCT790組，更換為含對應濃度XCT790的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h。吸棄細胞上清，加入工作濃度的CCK-8檢測液，37 ℃避光孵育4 h后，在450 nm波長處檢測各孔吸光度(A)值。每組細胞活力(%)=(加藥孔A值－空白對照孔A值)/(細胞對照孔A值－空白對照孔A值)×100%。

1.2.7線粒體膜電位檢測試劑盒檢測XCT790對hiPSC-CMs線粒體膜電位的影響 將分化第30天的心肌細胞分為對照組與XCT790組，對照組常規(guī)培養(yǎng)，XCT790組以篩選出的XCT790最佳工作濃度處理，72 h后用PBS洗滌細胞1次，加入1 ml細胞培養(yǎng)液后加入1 ml JC-1染色工作液，充分混勻，細胞培養(yǎng)箱中37 ℃孵育20 min，用JC-1染色緩沖液洗滌2次，Hoechst染色10 min，PBS洗滌2次，加入2 ml細胞培養(yǎng)液，激光共聚焦顯微鏡下觀察并拍照。統(tǒng)計每組細胞紅綠熒光的比值，用紅綠熒光的相對比例來衡量線粒體膜電位的高低。

1.3統(tǒng)計學處理 采用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料以x±s表示，兩組間比較采用t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1hiPSCs形態(tài)觀察及鑒定 倒置顯微鏡下，hiPSCs呈集落生長，集落邊緣光滑，細胞排列緊密，細胞增殖較快，生長狀態(tài)良好(圖2A)。免疫熒光檢測結(jié)果顯示，hiPSCs表達干細胞多能性標志物SOX2、SSEA4及TRA1-60(圖2B)。

圖2 hiPSCs形態(tài)觀察(A)及多能性鑒定(B)Fig.2 Observation of hiPSCs morphology (A) and identification of pluripotency (B)

2.2hiPSC-CMs形態(tài)觀察及鑒定 消化成單細胞的hiPSC-CMs再接種后約48 h恢復跳動，與hiPSCs相比，hiPSC-CMs無增殖能力，形態(tài)發(fā)生較大變化:細胞體積增大，核質(zhì)比降低，細胞呈梭形(圖3A)。RT-qPCR檢測結(jié)果顯示，與hiPSCs相比，分化第20天的hiPSC-CMs心肌標志物TNNT2(82.820±2.005 vs. 1.001±0.029)及MYH6(90 982.000±1 968.000 vs. 1.003±0.053)mRNA相對表達量明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義(t分別為40.790、46.230，P＜0.001)。免疫熒光結(jié)果顯示，分化第20天的hiPSC-CMs表達心肌標志物cTnT及Cx43(圖3B)。

圖3 hiPSC-CMs形態(tài)觀察及鑒定Fig.3 Morphological observation and identification of hiPSC-CMs

2.3心肌分化前后胞內(nèi)ATP含量、ERRα及其下游蛋白的表達情況 與hiPSCs相比，分化第30天的hiPSC-CMs胞內(nèi)ATP含量及ERRα、CytC、MPC1蛋白表達水平明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05，圖4，表2)。

圖4 hiPSCs(D0)與分化第30天的hiPSC-CMs中ERRα、CytC及MPC1蛋白表達情況Fig.4 Expressions of ERRα, CytC and MPC1 protein in hiPSCs and hiPSC-CMs on day 30 of differentiation

2.4XCT790最佳工作濃度篩選 Western blotting檢測結(jié)果顯示，與對照組相比，5、10、15 μmol/LXCT790組的ERRα蛋白表達降低，且呈濃度依賴性，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05，圖5A)。CCK-8檢測結(jié)果顯示，與對照組相比，15 μmol/L XCT790能明顯抑制hiPSC-CMs細胞活力，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，而5、10 μmol/L XCT790組與對照組差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05，圖5B)。因此選擇10 μmol/L作為XCT790的最佳工作濃度用于后續(xù)實驗。

2.5抑制ERRα對hiPSC-CMs胞內(nèi)ATP含量的影響 應用10 μmol/L XCT790處理hiPSC-CMs 72 h后，胞內(nèi)ATP含量為(4.903±1.158) nmol/mg prot，低于對照組的(9.310±0.980) nmol/mg prot，差異有統(tǒng)計學意義(t=2.904，P＜0.05)。

2.6抑制ERRα對hiPSC-CMs線粒體膜電位的影響 JC-1染色結(jié)果顯示，10 μmol/L XCT790組的紅綠熒光比值明顯低于對照組(1.407±0.022 vs. 1.977±0.093)，差異有統(tǒng)計學意義(t=5.959，P＜0.05，圖6)。

表2 hiPSCs與分化第30天的hiPSC-CMs胞內(nèi)ATP含量及ERRα、CytC、MPC1蛋白表達變化(±s，n=3)Tab.2 Changes of intracellular ATP content and protein expressions of ERRα, CytC and MPC1 in hiPSCs and hiPSC-CMs on day 30 of differentiation (±s, n=3)

表2 hiPSCs與分化第30天的hiPSC-CMs胞內(nèi)ATP含量及ERRα、CytC、MPC1蛋白表達變化(±s，n=3)Tab.2 Changes of intracellular ATP content and protein expressions of ERRα, CytC and MPC1 in hiPSCs and hiPSC-CMs on day 30 of differentiation (±s, n=3)

D0. hiPSCs；D30. 分化第30天hiPSC-CMs；ERRα. 雌激素相關受體α；CytC. 細胞色素C；MPC1. 線粒體丙酮酸載體1

2.7抑制ERRα對hiPSC-CMs中CytC、MPC1蛋白表達的影響 用10 μmol/L XCT790處理hiPSCCMs 72 h后，其CytC和MPC1蛋白表達水平明顯低于對照組(分別為0.705±0.019 vs. 0.897±0.011、0.594±0.021 vs. 0.797±0.025)，差異有統(tǒng)計學意義(t分別為8.794、6.206，P＜0.01，圖7)。

圖5 不同濃度XCT790對ERRα蛋白表達(A)及細胞活性(B)的抑制作用Fig.5 Inhibitory effect of XCT790 with different concentrations on ERRα protein expression (A) and cell activity (B)

圖6 XCT790抑制ERRα對hiPSC-CMs線粒體膜電位的影響(JC-1染色)Fig.6 XCT790 inhibits the effect of ERRα on the mitochondrial membrane potential of hiPSC-CMs (JC-1 staining)

圖7 XCT790抑制ERRα對CytC和MPC1蛋白表達的影響Fig.7 XCT790 inhibits the effect of ERRα on the protein expressions of CytC and MPC1

3 討 論

心肌細胞屬于不可再生細胞，在心肌梗死心肌細胞受到不可逆損傷而缺乏修復手段時，最終可能發(fā)展為心力衰竭。近期發(fā)現(xiàn)，在非人類靈長動物模型中，多能干細胞衍生心肌細胞(PSCCMs)能有效改善梗死心臟的結(jié)構(gòu)及功能[13-14]， 充分證明了PSC-CMs的潛在價值。盡管近年來心肌分化效率及應用方面取得了可喜成果，但是傳統(tǒng)培養(yǎng)方法誘導的hPSC-CMs仍存在代謝不成熟的問題，限制了其應用[15-17]。

現(xiàn)有研究初步證實，干細胞分化過程伴隨著線粒體重塑及代謝重塑[18-19]，PSCs維持較高的糖酵解率，分化為心肌細胞后糖酵解率降低，氧化磷酸化水平升高[20-22]。心臟是線粒體最富集的器官之一，線粒體約占心臟容量的30%，心臟中合成的ATP超過95%來源于線粒體氧化磷酸化，ATP的合成直接反映了心肌細胞的代謝狀態(tài)[23]。線粒體膜電位是反映細胞內(nèi)線粒體功能狀態(tài)的重要參數(shù)之一，正常的線粒體膜電位是維持線粒體進行氧化磷酸化、產(chǎn)生ATP的先決條件，線粒體膜電位下降會抑制氧化磷酸化反應，進而引發(fā)ATP合成受阻。ERRα是線粒體功能及生物發(fā)生相關基因的關鍵核調(diào)節(jié)因子之一，通過調(diào)控其下游代謝基因的表達調(diào)控能量代謝[12,24]。有研究發(fā)現(xiàn)，ERRα可促進心臟線粒體氧化磷酸化、脂肪酸β氧化及線粒體生物合成等代謝過程[25]，ERRα基因敲除小鼠在心臟壓力超負荷時表現(xiàn)出心室擴張、最大ATP合成速率降低等心力衰竭特征[26]，提示ERRα在調(diào)控心臟代謝及功能中具有重要作用。hiPSCCMs與原代心肌不完全相同，ERRα在hiPSC-CMs中調(diào)控ATP合成的作用尚未見報道。MPC1定位于線粒體內(nèi)膜，主要功能是將丙酮酸從線粒體外運輸?shù)骄€粒體內(nèi)，然后進入三羧酸循環(huán)合成ATP[27-28]。 線粒體電子傳遞鏈(ETC)作為氧化磷酸化過程的一部分，消耗氧氣以產(chǎn)生ATP，而CytC是ETC上重要的電子傳遞體，是有氧化代謝的核心。當CytC缺乏時，呼吸鏈上的電子傳遞被阻斷，ATP合成直接受到抑制。研究證實，ERRα作為轉(zhuǎn)錄因子可靶向MPC1與CytC基因的啟動子，直接調(diào)控其轉(zhuǎn)錄過程[11,29-30]。

部分分化的hiPSCs將影響心肌分化的效率，免疫熒光檢測結(jié)果顯示hiPSCs表達多能性標志物，說明hiPSCs具有多能性且處于未分化狀態(tài)，可用于后續(xù)的心肌誘導分化。本研究采用小分子化合物CHIR與IWP2時序性短暫激活/抑制Wnt信號通路的方法誘導hiPSCs心肌分化[31-32]，RT-qPCR與免疫熒光結(jié)果均證實成功誘導hiPSCs分化為表達心肌特異性標志物的心肌細胞。當hiPSCs分化為hiPSC-CMs后ATP合成明顯增加，這與其高氧化磷酸化狀態(tài)相符。細胞功能的改變往往伴隨蛋白表達的變化。本研究發(fā)現(xiàn)，hiPSCs在分化為心肌細胞后ERRα、CytC及MPC1蛋白表達均明顯升高，與胞內(nèi)ATP含量呈正相關。因此，筆者推測在hiPSCs分化為hiPSC-CMs后，ATP合成增多是由ERRα表達增高引起，ERRα在調(diào)控ATP合成中扮演重要角色。為了進一步探明ERRα在ATP合成中的作用，本研究選用10 μmol/L的ERRα特異性抑制劑XCT790抑制hiPSC-CMs中ERRα的蛋白活性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ERRα受抑制后，hiPSC-CMs胞內(nèi)ATP含量與線粒體膜電位均降低，證實hiPSC-CMs胞內(nèi)高水平的ATP含量與ERRα表達增高有關，ERRα能夠通過影響線粒體膜電位參與調(diào)控hiPSC-CMs中ATP的合成。本研究還發(fā)現(xiàn)，ERRα受抑制后MPC1及CytC表達均降低，說明在hiPSC-CMs中ERRα可能通過調(diào)控MPC1及CytC的表達而影響ATP的合成。

綜上所述，本研究初步證實了ERRα在hiPSC分化為hiPSC-CMs及其ATP合成的調(diào)控中具有重要作用，可能的機制是通過調(diào)控線粒體膜電位及CytC、MPC1等下游靶蛋白的表達而影響ATP的合成，提示可通過促進hiPSC-CMs中ERRα的表達增強hiPSCCMs的氧化代謝，進而促進其代謝成熟，為將來hiPSC-CMs更好地應用于臨床奠定了基礎，但仍需后續(xù)實驗證實。此外，hiPSCs向心肌細胞分化過程中伴隨的代謝變化及調(diào)控機制極其復雜，也需更多的研究進一步闡明。