毛琦，鄧夢(mèng)楊，李祿豐，趙曉輝

陸軍軍醫(yī)大學(xué)新橋醫(yī)院心內(nèi)科，重慶 400037

動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)被歸類為衰老性疾病[1]，組織病理學(xué)研究顯示血管衰老與AS密切相關(guān)[2]。進(jìn)展期AS斑塊呈現(xiàn)出細(xì)胞周期停滯、表觀遺傳學(xué)修飾及端粒縮短等一系列衰老表征；血管細(xì)胞衰老促進(jìn)了AS的發(fā)生及斑塊的進(jìn)展[3-4]。血管內(nèi)皮既是簡(jiǎn)單的機(jī)械屏障，又發(fā)揮著重要的抗AS作用[5]。內(nèi)皮衰老可引起血管通透性增加、舒縮失調(diào)、凝血障礙及慢性炎癥[6]，進(jìn)而導(dǎo)致脂質(zhì)沉積、剪應(yīng)力變化、泡沫細(xì)胞及微血栓形成，從而促進(jìn)AS的形成[7]。因此，改善內(nèi)皮細(xì)胞衰老有助于延緩AS進(jìn)程，具有重要的科學(xué)意義及臨床價(jià)值。

循環(huán)Klotho蛋白主要由腎臟近曲小管產(chǎn)生，是體內(nèi)重要的多效性激素樣因子，其水平與組織衰老及個(gè)體壽命密切相關(guān)[8-9]。敲除Klotho的小鼠顯示出血管僵硬、鈣化及AS的衰老表型，而外源性補(bǔ)充Klotho可以明顯改善血管病變程度[9]。自噬是真核細(xì)胞“自我消化”的一種保守生物學(xué)行為，適度激活自噬有助于維持血管穩(wěn)態(tài)及機(jī)體健康[10-11]。Klotho對(duì)AS的保護(hù)效應(yīng)可能源于其抗衰老作用，然而，既往對(duì)于Klotho抗衰老的認(rèn)識(shí)主要基于“自由基損傷及抗氧化理論”，Klotho與自噬在心血管疾病中的關(guān)系尚不清楚[12-13]。本研究擬從內(nèi)皮活力、衰老程度、細(xì)胞自噬等幾個(gè)方面探討代謝應(yīng)激條件下Klotho是否可以通過調(diào)節(jié)自噬改善內(nèi)皮細(xì)胞衰老。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)細(xì)胞及主要試劑 人冠狀動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞(HCAEC)及ECM培養(yǎng)基(美國Sciencell公司)，胎牛血清及胰酶(美國Gibico公司)，Klotho蛋白(美國RD公司)，氧化低密度脂蛋白(oxidized low density lipoprotein，ox-LDL，廣州奕源生物公司)，CCK-8細(xì)胞活力檢測(cè)試劑盒(武漢博士德生物公司)，SA-β-GAL衰老染色試劑盒、一抗β-actin(小鼠單抗，上海碧云天生物公司)，一抗P53、P16、LC3、P62(兔單抗，美國Abcam公司)，腺病毒GFPLC3(上海漢恒生物公司)，山羊抗鼠二抗、山羊抗兔二抗(北京中杉金橋公司)，F(xiàn)ITC綠色熒光標(biāo)記山羊抗兔二抗、Alexa Fluor 647紅色熒光標(biāo)記山羊抗兔二抗(美國Invitrogen公司)，ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒(美國Millipore公司)，雷帕霉素(美國MCE公司)，氯喹(美國Sigma公司)。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)及處理分組 ①將HCAEC接種在含有5%胎牛血清、100 U/ml青霉素、100 mg/ml鏈霉素的ECM內(nèi)皮細(xì)胞專用培養(yǎng)基中，于5%CO2、37 ℃條件下培養(yǎng)。②當(dāng)HCAEC融合至70%左右時(shí)，分別向培養(yǎng)基中加入100、200、400、800 pmol/L的Klotho預(yù)處理2 h，并用0、25、50、75、100 μg/ml 的ox-LDL分別處理細(xì)胞24、48、72及96 h，檢測(cè)HCAEC的增殖活力及衰老水平，確定ox-LDL及Klotho的處理濃度，最終選擇400 pmol/L Klotho及75 μg/ml ox-LDL處理細(xì)胞72 h作為干預(yù)衰老較為合適的實(shí)驗(yàn)條件[14]。③以400 pmol/L Klotho、75 μg/ml ox-LDL以及75 μg/ml ox-LDL+400 pmol/L Klotho分別預(yù)處理細(xì)胞2 h并繼續(xù)培養(yǎng)72 h，SA-β-GAL染色檢測(cè)衰老細(xì)胞，細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)P53及P16蛋白在胞內(nèi)的表達(dá)。④在ox-LDL (75 μg/ml) 處理?xiàng)l件下，分別以400 pmol/L Klotho、5 μmol/L雷帕霉素、2 μmol/L 氯喹、400 pmol/L Klotho+2 μmol/L氯喹預(yù)處理細(xì)胞2 h，并繼續(xù)培養(yǎng)72 h，CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活力，SAβ-GAL染色檢測(cè)衰老細(xì)胞，轉(zhuǎn)染腺病毒GFP-LC3檢測(cè)細(xì)胞自噬水平，Western blotting檢測(cè)P53、P16、LC3及P62蛋白的表達(dá)[15]。

1.3CCK-8法檢測(cè)HCAEC細(xì)胞增殖活力 將1×105/ml密度的細(xì)胞懸液以每孔100 μl接種于96孔板中，待細(xì)胞全部貼壁生長且融合度達(dá)70%時(shí)，將細(xì)胞分為對(duì)照組與ox-LDL處理組，用0、25、50、75、100 μg/ml的ox-LDL分別處理細(xì)胞24、48、72及96 h。處理完成后，于每孔加入10 μl CCK-8溶液，在細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育1 h；取出96孔板，置于酶標(biāo)儀在450 nm波長處測(cè)定每孔的吸光度值，結(jié)合空白對(duì)照計(jì)算細(xì)胞的增殖活力相對(duì)值。

1.4SA-β-Gal染色檢測(cè)衰老染色陽性細(xì)胞比例 將1×105/ml密度的細(xì)胞懸液接種于6孔板中，待細(xì)胞全部貼壁生長且融合至約70%時(shí)，將細(xì)胞分為對(duì)照組、400 pmol/L Klotho處理組、75 μg/ml ox-LDL處理組以及75 μg/ml ox-LDL+400 pmol/L Klotho處理組；處理72 h結(jié)束后，棄去培養(yǎng)基，PBS溶液漂洗2次，于每孔加入1 ml的染色固定液室溫固定15 min，吸除固定液，并用PBS溶液漂洗3次，每次3 min；每孔加入1 ml配制好的染色液，用parafilm膜封住孔板邊緣以免蒸發(fā)，將6孔板置于無CO2的37 ℃培養(yǎng)箱中孵育過夜；第2天于倒置顯微鏡下觀察染色情況，任意選取每孔的5個(gè)視野進(jìn)行染色陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)，并統(tǒng)計(jì)陽性細(xì)胞百分比。

1.5Western bloはing檢測(cè)衰老相關(guān)蛋白P53、P16及自噬相關(guān)蛋白LC3、P62的表達(dá) 將細(xì)胞分為75 μg/ml ox-LDL處理組、75 μg/ml ox-LDL+400 pmol/L Klotho處理組、75 μg/ml ox-LDL+5 μmol/L雷帕霉素處理組、75 μg/ml ox-LDL+2 μmol/L氯喹處理組、75 μg/ml ox-LDL+400 pmol/L Klotho+2 μmol/L氯喹處理組，從培養(yǎng)箱取出處理后的6孔板，每孔加入250 μl含苯甲基磺酰氟(PMSF，終濃度1 mmol/L)的RIPA裂解液，刮取細(xì)胞后置于冰上裂解混勻，4 ℃、12 000 r/min離心10 min后收集上清蛋白，并用BCA法進(jìn)行蛋白定量。配制SDS-PAGE凝膠，每泳道加入50 μg蛋白樣本，以恒壓模式電泳跑膠，5%濃縮膠階段電壓80 V，時(shí)間30 min，分離膠階段電壓120 V，時(shí)間90～100 min。當(dāng)Marker條帶徹底分離或溴酚藍(lán)接近凝膠下緣時(shí)終止電泳；切膠，以恒壓90 V轉(zhuǎn)膜60 min，TBST洗滌后，Quick Block封閉液室溫封閉2 h，PVDF膜按各自轉(zhuǎn)膜的目標(biāo)蛋白放入相應(yīng)的一抗(P53、P16、LC3、P62、β-actin單抗)孵育盒中4 ℃過夜；第2天取出，TBST洗膜3次，每次10 min，加入相應(yīng)二抗(1:5000)于37 ℃孵育1 h；TBST洗滌后曝光，以LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比值反映自噬水平，以β-actin作為內(nèi)參照。

1.6細(xì)胞免疫熒光觀察衰老相關(guān)蛋白的表達(dá) 取出培養(yǎng)在6孔板中的細(xì)胞爬片，4%多聚甲醛室溫固定15 min，洗滌后用0.1% Triton-X處理10 min，漂洗后加入Quick Block封閉液室溫封閉15 min；在爬片中心滴加30 μl按1:250稀釋的P53一抗或P16一抗，將其放入鋪有濕紗布的濕盒內(nèi)，4 ℃避光過夜孵育；第2天取出并漂洗爬片，滴加30 μl熒光標(biāo)記的二抗稀釋液(1:2500；FITC綠色熒光二抗處理P53；Alexa Fluor 647紅色熒光處理P16)，37 ℃避光孵育1 h，洗滌3次；滴加少許DAPI進(jìn)行細(xì)胞核染色，處理3 min后洗滌，濾紙吸去多余水分，滴加10 μl防淬滅封片劑于載玻片上，輕輕蓋上爬片，使細(xì)胞面接觸封片液，并盡量避免產(chǎn)生氣泡；激光共聚焦顯微鏡下觀察細(xì)胞免疫熒光情況。

1.7轉(zhuǎn)染腺病毒GFP-LC3檢測(cè)細(xì)胞自噬的變化 將生長良好的細(xì)胞以1×105/ml密度接種于共聚焦培養(yǎng)皿中，待其融合至60%左右取出；每皿加入8 μl的病毒液，使每皿的病毒MOI值均達(dá)到50，37 ℃孵育2 h后更換新培養(yǎng)基；感染24 h后，向各皿施加不同的藥物處理，繼續(xù)培養(yǎng)72 h；激光共聚焦顯微鏡觀察代表自噬體形成的綠色熒光亮點(diǎn)，拍照保存后用Image J軟件進(jìn)行亮點(diǎn)計(jì)數(shù)。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 24.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以x±s表示，均進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)；若方差齊，多組間比較行單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)；若方差不齊，組間比較以Welch法進(jìn)行近似方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用Bonferroni檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué) 意義。

2 結(jié) 果

2.1Klotho對(duì)ox-LDL介導(dǎo)的HCAEC增殖活力的影響 CCK-8法檢測(cè)結(jié)果顯示:ox-LDL處理組的細(xì)胞活力明顯低于非處理組(P＜0.05)；ox-LDL處理濃度越高，處理時(shí)間越長，HCAEC活力越低(P＜0.05)。經(jīng)過200、400、800 pmol/L的Klotho蛋白預(yù)處理后，ox-LDL暴露條件下預(yù)處理組的細(xì)胞活力較未預(yù)處理組明顯改善(P＜0.05，圖1)。

2.2Klotho對(duì)ox-LDL介導(dǎo)的衰老陽性細(xì)胞比例的影響 ox-LDL組的SA-β-GAL染色陽性細(xì)胞比例(50.70%±1.94%)明顯高于對(duì)照組(1.32%±0.11%)，ox-LDL+Klotho組的SA-β-GAL染色陽性細(xì)胞比例(23.04%±1.69%)明顯低于ox-LDL組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，圖2)。

2.3Klotho對(duì)ox-LDL介導(dǎo)的衰老相關(guān)蛋白P53及P16表達(dá)的影響 ①細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)結(jié)果顯示，P53及P16在胞核及胞質(zhì)中均有表達(dá)，以核內(nèi)表達(dá)為主；ox-LDL處理增加了胞內(nèi)P53及P16的表達(dá)，而外源補(bǔ)充Klotho可以對(duì)抗ox-LDL對(duì)P53及P16表達(dá)的誘導(dǎo)作用(圖3)。②Western blotting檢測(cè)結(jié)果顯示，隨著ox-LDL處理濃度增加，P53及P16的表達(dá)較對(duì)照組明顯升高(P＜0.05)；且隨著ox-LDL處理時(shí)間的延長，P53及P16的表達(dá)較對(duì)照組亦明顯升高(P＜0.05)；而外源補(bǔ)充Klotho可以明顯下調(diào)ox-LDL誘導(dǎo)的P53及P16表達(dá)(P＜0.05，圖4)。

2.4ox-LDL對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞自噬水平的影響 Western blotting檢測(cè)結(jié)果顯示:①隨著ox-LDL處理濃度的增加，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比值逐漸降低，P62蛋白表達(dá)水平逐漸升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。②隨著ox-LDL處理時(shí)間的延長，24 h的LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值較對(duì)照組明顯升高，而48 h及72 h的LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值均較24 h明顯降低(P＜0.05)；且24 h的P62蛋白表達(dá)水平較對(duì)照組明顯降低，隨后逐漸升高且明顯高于對(duì)照組(P＜0.05，圖5)。

圖1 Klotho對(duì)ox-LDL介導(dǎo)的HCAEC增殖活力的影響(n=3)Fig.1 Effects of Klotho on HCAEC viability under ox-LDL exposure (n=3)

圖2 各組HCAEC衰老細(xì)胞SA-β-GAL染色情況(×200)Fig.2 Senescent cells in each group of HCAECs (SA-β-GAL staining, ×200)

2.5Klotho對(duì)ox-LDL介導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞自噬的影響 ①Western blotting檢測(cè)結(jié)果顯示:ox-LDL+Klotho組的LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值較ox-LDL組明顯升高，而P62蛋白表達(dá)則明顯降低(P＜0.01)；ox-LDL+Klotho+氯喹組的LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值較ox-LDL+氯喹組增加，而P62蛋白表達(dá)降低(P＜0.05)。②腺病毒GFPLC3熒光檢測(cè)結(jié)果顯示:ox-LDL+Klotho組的自噬體較ox-LDL組明顯增多(P＜0.05)；且Klotho可以明顯增加受ox-LDL及CQ共同抑制的胞內(nèi)自噬體數(shù)量(P＜0.01，圖6)。

2.6 K lotho調(diào)節(jié)自噬對(duì)ox-LDL介導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞衰老的影響 ①CCK-8法檢測(cè)結(jié)果顯示:ox-LDL+Klotho組及ox-LDL+雷帕霉素組的細(xì)胞活力明顯高于ox-LDL組(P＜0.01)；ox-LDL+氯喹組的細(xì)胞活力較ox-LDL組明顯降低(P＜0.01)；ox-LDL+Klotho+氯喹組的細(xì)胞活力較ox-LDL+氯喹組明顯增加(P＜0.01)。②SA-β-GAL細(xì)胞染色結(jié)果顯示:ox-LDL+Klotho組及ox-LDL+雷帕霉素組衰老陽性細(xì)胞的比例較ox-LDL組明顯減少(P＜0.01)；ox-LDL+氯喹組的陽性細(xì)胞比例較ox-LDL組明顯增加(P＜0.01)；ox-LDL+Klotho+氯喹組的衰老陽性細(xì)胞比例較ox-LDL+氯喹組明顯減少(P＜0.01)。③Western blotting檢測(cè)結(jié)果顯示:ox-LDL+Klotho組及ox-LDL+雷帕霉素組的P53及P16蛋白表達(dá)較ox-LDL組明顯降低(P＜0.01)；ox-LDL+氯喹組的P53及P16蛋白表達(dá)較ox-LDL組明顯升高(P＜0.01)；ox-LDL+Klotho+氯喹組的P53及P16蛋白表達(dá)較ox-LDL+氯喹組明顯降低(P＜0.05， 圖7)。

圖3 Klotho對(duì)ox-LDL介導(dǎo)的P53及P16表達(dá)的影響(免疫熒光染色，×400)Fig.3 Effects of Klotho on ox-LDL-induced P53 and P16 expression in HCAEC(Immunofluorescence staining, ×400)

圖4 Klotho對(duì)ox-LDL介導(dǎo)的P53及P16蛋白表達(dá)的影響 (n=3)Fig.4 Effects of Klotho on ox-LDL-induced expression of P53 and P16 (n=3)

圖5 ox-LDL對(duì)HCAEC自噬的影響(n=3)Fig.5 Effects of ox-LDL on autophagy of HCAEC (n=3)

3 討 論

AS是以血管壁脂質(zhì)沉積為特征的慢性血管疾病[16]。從循環(huán)攝取的LDL在動(dòng)脈壁轉(zhuǎn)變?yōu)閛x-LDL，后者可引起內(nèi)皮功能障礙，增加黏附分子表達(dá)，誘導(dǎo)單核/巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)化為泡沫細(xì)胞，進(jìn)而啟動(dòng)AS，故被認(rèn)為是重要的代謝應(yīng)激原及致AS因子[17-18]。本研究發(fā)現(xiàn)，較高濃度的ox-LDL可降低HCAEC活力并增加衰老陽性細(xì)胞比例，在其持續(xù)作用下，衰老相關(guān)蛋白P53及P16的表達(dá)也明顯增加，這表明ox-LDL可介導(dǎo)HCAEC的衰老，其促衰老的效應(yīng)呈現(xiàn)一定的時(shí)效/量效關(guān)系。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，在ox-LDL介導(dǎo)的HCAEC衰老過程中，細(xì)胞自噬也發(fā)生了相應(yīng)變化。隨著ox-LDL處理強(qiáng)度的增加，自噬的介導(dǎo)作用及清除能力均明顯降低，細(xì)胞自噬流受到ox-LDL的明顯抑制。在ox-LDL持續(xù)暴露下，細(xì)胞衰老水平與自噬水平呈明顯正相關(guān)，提示自噬可能作為保護(hù)機(jī)制參與了內(nèi)皮的衰老進(jìn)程。值得注意的是，本研究發(fā)現(xiàn)，ox-LDL短期處理可引起細(xì)胞自噬的短暫激活，而持續(xù)作用則會(huì)導(dǎo)致自噬的逐漸抑制。這提示應(yīng)激強(qiáng)度可影響自噬水平，自噬與衰老可能均為細(xì)胞應(yīng)對(duì)應(yīng)激的一種適應(yīng)方式。基于本研究結(jié)果推測(cè)，短期應(yīng)激可上調(diào)自噬以代償受損的細(xì)胞功能，持續(xù)應(yīng)激則重塑細(xì)胞的生物學(xué)行為并改變其生存狀態(tài)，細(xì)胞可能通過調(diào)節(jié)自噬影響自身結(jié)局[19]。

在心血管疾病中，Klotho與自噬的關(guān)系尚不明確。近期少量研究顯示，Klotho可能通過調(diào)節(jié)自噬參與了腎間質(zhì)及肺組織的重塑；然而，不同疾病模型間的自噬效應(yīng)差異很大，這顯示了組織的特異性及自噬調(diào)控的復(fù)雜性，而相關(guān)結(jié)論也有待評(píng)估及驗(yàn)證[20-21]。本研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，Klotho可以激活被ox-LDL抑制的HCAEC自噬，表現(xiàn)為:①Klotho可促進(jìn)自噬體形成并加快其降解，恢復(fù)并激活受損的自噬流。②Klotho可減輕受氯喹抑制的自噬，表現(xiàn)為以P62下調(diào)為特征的自噬清除能力的部分恢復(fù)，但其對(duì)抗氯喹的具體機(jī)制仍不清楚。筆者推測(cè)Klotho可能有助于改善受損的溶酶體功能，進(jìn)而加快自噬體降解速率。③在ox-LDL暴露下，雷帕霉素及Klotho具有類似的自噬激活作用；然而，在缺乏應(yīng)激的條件下，Klotho無法上調(diào)自噬，雷帕霉素依然具有激活自噬的作用，提示二者調(diào)控自噬的具體靶點(diǎn)可能不同。既往觀點(diǎn)認(rèn)為，Klotho的抗衰老效應(yīng)是基于對(duì)細(xì)胞抗氧化酶的誘導(dǎo)[22]。然而，本研究發(fā)現(xiàn)，上調(diào)自噬可明顯減輕細(xì)胞衰老，抑制自噬則加重衰老程度，Klotho可通過激活自噬改善ox-LDL介導(dǎo)的HCAEC衰老。Klotho基于激活自噬的抗衰老作用可能歸因于應(yīng)激損傷條件下對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞生物學(xué)行為的重塑，亦即通過自噬的“自我清除”機(jī)制減少受損細(xì)胞器、清除異常蛋白、降低氧化應(yīng)激水平，從而實(shí)現(xiàn)細(xì)胞自穩(wěn)[23]。既往研究提示，循環(huán)Klotho水平與胰島素抵抗相關(guān)，胰島素及其信號(hào)通路也參與了代謝應(yīng)激及衰老進(jìn)程，筆者推測(cè)Klotho可能通過胰島素/胰島素樣生長因子1(IGF-1)通路影響自噬水平[24]。另有研究提示，腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)依賴的信號(hào)通路與能量代謝及組織衰老關(guān)系密切，自噬信號(hào)感受器mTOR蛋白亦是AMPK途徑的關(guān)鍵下游靶點(diǎn)，Klotho也可能通過AMPK信號(hào)途徑調(diào)控細(xì)胞自噬[25]。在下一步工作中，本課題組將針對(duì)Klotho調(diào)控內(nèi)皮細(xì)胞自噬的具體分子機(jī)制進(jìn)行更為深入的研究。

圖6 Klotho對(duì)ox-LDL介導(dǎo)的HCAEC自噬的影響 (n=3)Fig.6 Effects of Klotho on ox-LDL-induced autophagy in HCAEC (n=3)

圖7 Klotho調(diào)節(jié)自噬對(duì)ox-LDL介導(dǎo)的HCAEC衰老的影響 (n=3)Fig.7 Effects of Klotho on ox-LDL-induced HCAEC senescence via regulation of autophagy (n=3)

綜上所述，Klotho可通過激活自噬改善ox-LDL介導(dǎo)的人冠狀動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞衰老?；诳顾ダ系男难芊乐尾呗杂兄诮档凸谛牟★L(fēng)險(xiǎn)，Klotho干預(yù)血管內(nèi)皮自噬或可成為新的抗粥樣硬化靶點(diǎn)。