徐先琳 張斌強(qiáng) 錢航 陳琴華 朱軍 李小雷 陳繼舜

1錦州醫(yī)科大學(xué)國藥東風(fēng)總醫(yī)院研究生培養(yǎng)基地（湖北十堰442008）；2湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬東風(fēng)醫(yī)院（湖北十堰442008）；3武當(dāng)特色中藥研究湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（湖北十堰442008）

高血壓和冠心病是最常見的心血管疾病，當(dāng)原發(fā)性高血壓合并冠心病時(shí)，因血管內(nèi)皮功能障礙、氧化應(yīng)激、遺傳基因突變等因素所導(dǎo)致的靶器官損害更成為了預(yù)后不佳的危險(xiǎn)因素之一，其中遺傳基因突變在原發(fā)性高血壓及冠心病的發(fā)生和發(fā)展中占據(jù)重要地位。位于血管緊張素轉(zhuǎn)換酶（angiotensin converting enzy-me，ACE）基因第16 內(nèi)含子存在I/D（插入/缺失）多態(tài)性，可擴(kuò)增出480 bp（插入片段）和191 bp（缺失Alu 片段）兩種長度片段，構(gòu)成II、DD、ID三種基因型，已有研究表明，ACE I/D 基因多態(tài)性作為遺傳基因標(biāo)志可為評價(jià)心血管疾病的危險(xiǎn)因素和識別易感人群提供依據(jù)［1］。傳統(tǒng)的觀點(diǎn)認(rèn)為胱抑素C（Cys-C）是評價(jià)腎小球內(nèi)皮功能障礙的標(biāo)志，對急、慢性腎臟病有一定的預(yù)測價(jià)值［2］，但實(shí)際Cys-C 也參與動(dòng)脈粥樣硬化的病理生理過程［3-4］。Cys-C 可由心肌細(xì)胞產(chǎn)生和分泌，在心肌缺血時(shí)合成增多，通過影響血管壁的完整性和重塑性影響血壓［5］，Cys-C 通過自嗜通路對抗細(xì)胞死亡，對動(dòng)脈粥樣硬化斑塊有預(yù)測作用［6］，提供冠心病患者心血管危險(xiǎn)的有效信息，Cys-C 升高會增加發(fā)生急性冠脈綜合征的風(fēng)險(xiǎn)［7］。目前國內(nèi)外缺少ACE基因多態(tài)性與Cys-C 相關(guān)性的研究，但ACE I/D 基因多態(tài)性與Cys-C 均與血管內(nèi)皮障礙有著密切的聯(lián)系。綜上，本研究的目的是通過在原發(fā)性高血壓合并冠心病患者中，分析ACE I/D 基因多態(tài)性與Cys-C 之間的可能關(guān)系，為臨床評估原發(fā)性高血壓合并冠心病時(shí)所致靶器官損害提供思路。

1 資料與方法

1.1 一般資料選取2018年1月至2019年7月于國藥東風(fēng)總醫(yī)院心內(nèi)科住院的18～75 歲患者共計(jì)282 例為研究對象，其中172 例納入高血壓合并冠心病（高血壓+冠心?。┙M，男100 例，女72 例，平均（56.51±9.62）歲，設(shè)為實(shí)驗(yàn)組；110 例選入單純原發(fā)性高血壓（高血壓）組，男63 例，女47 例，平均（55.60±8.62）歲，設(shè)為對照組。入選患者均符合《中國高血壓防治指南2018》的高血壓診斷標(biāo)準(zhǔn)：（1）未使用降壓藥物情況下，非同日3 次測量患者血壓，收縮壓≥140 mmHg 和（或）舒張壓≥90 mmHg；（2）有明確的高血壓史，目前正服用降壓藥的情況下，血壓雖然低于140/90 mmHg 亦可診斷。合并冠心病患者均為于我院行冠狀動(dòng)脈造影檢查明確診斷（冠脈主干狹窄＞50%）。

1.2 排除標(biāo)準(zhǔn)（1）繼發(fā)性高血壓、原發(fā)性腎臟病伴有高血壓，如腎性高血壓、腎血管性高血壓及內(nèi)分泌疾病引起的高血壓；（2）合并糖尿病、家族遺傳疾病、惡性腫瘤、慢性消耗性疾病和嚴(yán)重肝腎功能不全等；（3）慢性腎炎、遺傳性腎病、繼發(fā)性腎病、尿路感染等其他影響腎功能的疾??；（4）心力衰竭、嚴(yán)重心臟瓣膜病、心肌病、惡性心律失常等。

1.3 儀器和試劑由三力醫(yī)用科技有限公司提供的K2 乙二四乙酸（EDTA）抗凝真空采血管；TIANGEN 血液基因組DNA 提取試劑盒；博日實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀9600plus；美國Thermo Heraeus Pico 17/21 微量離心機(jī)；宏灝基因ACE（I/D）基因多態(tài)性檢測試劑盒（PCR-熒光探針法）。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 標(biāo)本采集采集各組研究對象清晨空腹靜脈血3～5 mL，分離、保存血清，于國藥東風(fēng)總醫(yī)院檢驗(yàn)科測定血生化指標(biāo)，同日留取清晨中段尿5 mL，于檢驗(yàn)科測定腎功能指標(biāo)?？偰懝檀迹═C）、甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白膽固醇（HDLC）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、尿素（UREA）、肌酐（CREA）、腎小球?yàn)V過率（GFR）、Cys-C、尿蛋白定量（UPRO）采用雅培C16000 儀測定，尿微量白蛋白（UMA）、24 h 尿微量白蛋白排泄率（24HUAE）、尿微量白蛋白/尿肌酐比（UACR）采用普門ACR 儀測定。記錄患者體質(zhì)量指數(shù)（BMI）、平均收縮壓（SBP）、平均舒張壓（DBP）。

1.4.2 ACE 基因I/D 基因多態(tài)性檢測（1）采取同日清晨空腹外周靜脈血5 mL，于含有EDTA 抗凝管中密封，4 ℃保存待測；（2）按照TIANGEN 血液基因組DNA 提取試劑盒說明方法提取DNA；（3）紫外分光光度計(jì)（pharmacia biotech）測定DNA水平，基因組DNA 濃度應(yīng)＞20 ng/μL，A260/A280比值應(yīng)介于1.7～2.0；（4）取2 μL 提取DNA 樣品加入宏灝個(gè)體化基因核酸檢測試劑反應(yīng)液中上熒光定量PCR 儀檢測，PCR 程序設(shè)定為：37 ℃，1 min；95 ℃，5 min；95 ℃，15 s，60 ℃，30 s，40 個(gè)循環(huán)。（5）結(jié)果判讀以空白對照的熒光曲線無Ct 值，陽性對照Ct 值≤34 判定結(jié)果有效，ACE 基因型別判讀方式為FAM 通道無Ct 值或Ct 值≥38，VIC 通道Ct 值≤34 為II 基因型；FAM 通道Ct 值≤34，VIC 通道Ct 值≤34 為ID 基因型；FAM 通道無Ct 值≤34，VIC 通道無Ct 值或Ct 值≥38 為DD 基因型。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料（年齡、BMI、TG、TC、HDL-C、LDL-C、24hSBP、24hDBP、UREA、CREA、GFR、UPRO、UACR、Cys-C、UMA）用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組比較采用t檢驗(yàn)，3 組比較用方差分析。計(jì)數(shù)資料（性別、吸煙史）用頻數(shù)表示，兩組和三組比較均采用χ2檢驗(yàn)。偏態(tài)分布的資料（24HUAE）用中位數(shù)（95%CI）表示，3 組比較采用秩和檢驗(yàn)。應(yīng)用χ2檢驗(yàn)對Hardy-Weinberg平衡進(jìn)行驗(yàn)證?；蛐皖l率與等位基因頻率采用卡方檢驗(yàn)。均以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ACE I/D 等位基因頻率比較單純高血壓組和原發(fā)性高血壓合并冠心病組的年齡、吸煙史、BMI、血脂等一般資料差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。DD、ID、和II 基因型分布符合Hardy-Weinberg 遺傳平衡定律（χ2=0.496，P=0.78），具有群體代表性。DD、ID、II 以及I、D 等位基因頻率在兩組間的分布差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=9.193，P＜0.05），高血壓+冠心病組的DD 基因型及D 等位基因頻率明顯高于高血壓組，見表1。

2.2 ACE 基因型分組資料比較原發(fā)性高血壓合并冠心病中根據(jù)ACE I/D 基因型分組的一般資料比較：DD 型、ID 型、II 型一般臨 床資料比較UREA、CREA、GFR、UPRO、UACR 等差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），Cys-C（P＜0.01）、UMA、24HUAE差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表2。DD 型組Cys-C、UMA 值明顯高于ID 型、II 型組。

表1 單純原發(fā)性高血壓組與原發(fā)性高血壓合并冠心病組ACE 基因型及基因頻率比較Tab.1 Comparison of ACE genotype and gene frequency between primary essential hypertension and essential hypertension combined with coronary heart disease 例（%）

表2 原發(fā)性高血壓合并冠心病中根據(jù)ACE I/D 基因型分組的一般資料及Cys-C、腎功能比較Tab.2 Comparison of general data and biochemical indicators in patients with essential hypertension combined with coronary heart disease grouped by ACE genotype ±s

表2 原發(fā)性高血壓合并冠心病中根據(jù)ACE I/D 基因型分組的一般資料及Cys-C、腎功能比較Tab.2 Comparison of general data and biochemical indicators in patients with essential hypertension combined with coronary heart disease grouped by ACE genotype ±s

年齡（歲）性別（男/女，例）吸煙史（有/無，例）體質(zhì)量指數(shù)（kg/m2）平均收縮壓（mm/Hg）平均舒張壓（mm/Hg）總膽固醇（mmol/L）甘油三酯（mmol/L）高密度脂蛋白膽固醇（mmol/L）低密度脂蛋白膽固醇（mmol/L）尿素（mmol/L）肌酐（μmol/L）腎小球?yàn)V過率（mL/min）尿蛋白定量（g/24 h）尿微量白蛋白/尿肌酐比24 h 尿微量白蛋白排泄率［μg/min，M（P25，P75）］尿微量白蛋白（mg/L）胱因素C（mg/L）DD（n=51）55.31±9.60 26/25 39/12 26.78±1.10 148.52±6.62 88.12±9.64 4.65±1.17 1.98±1.18 1.22±0.36 2.52±1.00 5.53±1.64 78.88±20.41 79.86±16.69 0.23±0.31 8.49±10.65 35.00（18.00，83.80）58.12±63.85 1.10±0.23 ID（n=79）57.67±8.87 45/34 54/25 26.06±2.34 146.97±8.31 87.56±8.59 4.32±0.76 1.95±2.85 1.19±0.25 2.34±0.66 4.98±1.50 72.68±13.61 84.82±13.62 0.18±0.27 6.59±8.43 15.30（8.90，25.70）33.69±50.86 0.95±0.18 II（n=42）55.98±9.44 29/13 27/15 26.80±1.89 147.72±7.61 88.31±8.74 4.25±1.12 1.63±0.89 1.20±0.26 2.30±0.93 5.03±1.35 73.48±16.40 85.62±13.44 0.17±0.27 6.66±8.80 15.20（8.25，31.88）29.75±40.00 0.89±0.22 P 值＞0.05＞0.05＞0.05＞0.05＞0.05＞0.05＞0.05＞0.05＞0.05＞0.05＞0.05＞0.05＞0.05＞0.05＞0.05＜0.05＜0.05＜0.01

2.3 ACE 基因型中Cys-C 異常頻率分布根據(jù)Cys-C 水平分組分析原發(fā)性高血壓合并冠心病中ACE I/D 位點(diǎn)不同基因型的頻率分布：以Cys-C=1.03 mg/L 為臨界值，將高血壓+冠心病患者分為Cys-C＞1.03 組和Cys-C≤1.03 組，DD 基因型在Cys-C＞1.03組中的分布頻率更高（χ2=8.47，P＜0.05），見表3。

2.5 ACE I/D 等位基因預(yù)測Cys-C 水平的相關(guān)ROC 曲線曲線下面積為0.662，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），D 等位基因存在時(shí)對Cys-C 升高有一定預(yù)測意義，見圖1。

3 討論

我國原發(fā)性高血壓及冠心病的患病率逐年升高，當(dāng)兩種疾病合并時(shí)不僅會嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量，而且隨之而來的靶器官損害也會增加不良事件發(fā)生率，因此從遺傳基因突變角度結(jié)合特異性臨床檢測指標(biāo)對靶器官損害的評估具有重大意義。動(dòng)脈粥樣硬化是原發(fā)性高血壓及冠心病共同的病理基礎(chǔ)，有研究表示，控制危險(xiǎn)因素是預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化的有效手段［8］。

表3 原發(fā)性高血壓合并冠心病不同ACE 基因型組Cys-C正常頻數(shù)及異常頻數(shù)比較Tab.3 Comparison of normal and abnormal frequency of Cys-C in different ACE genotypes of essential hypertension combined with coronary heart disease 例

圖1 ACE I/D 等位基因預(yù)測Cys-C 水平的相關(guān)ROC 曲線Fig.1 ROC curve of ACE I/D allele in predicting cystatin level

本次研究中，高血壓合并冠心病組的DD 基因型、D 等位基因頻率均高于單純高血壓組，D 等位基因可能是冠心病發(fā)病的危險(xiǎn)因素。經(jīng)典觀點(diǎn)中，ACE 作用于血管緊張素Ⅰ之后生成的血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）是一種強(qiáng)有力的血管收縮劑和醛固酮促分泌劑［9］，通過刺激血管平滑肌細(xì)胞中的G 蛋白以及腎上腺皮質(zhì)的醛固酮分泌而升高血壓、加重冠狀動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞的損傷［10］。ACE I/D多態(tài)基因造成了mRNA穩(wěn)定性改變，進(jìn)一步調(diào)節(jié)ACE的表達(dá)與分泌，DD 基因型正是由于缺失相關(guān)序列導(dǎo)致了轉(zhuǎn)錄時(shí)ACE 基因的活化與高表達(dá)［11］。與Ⅱ基因型相比，DD基因型的血漿ACE水平更高，這不僅增強(qiáng)了RAAS系統(tǒng)作用，加重血管內(nèi)皮損傷，使心血管疾病發(fā)生率增加［12］，而且能夠抑制緩激肽誘導(dǎo)的組織血纖維蛋白溶酶原激活劑（tPA）釋放，誘發(fā)血栓形成和心肌梗塞［13］。因此，雖然ACE 多態(tài)基因在基因調(diào)控層面的具體機(jī)制尚不清楚，但與DD 基因型相關(guān)的心血管風(fēng)險(xiǎn)增加可能是通過內(nèi)皮細(xì)胞損傷、RAAS激活、凝血功能異常、血栓形成等復(fù)雜機(jī)制所介導(dǎo)。在老年高血壓患者的研究中發(fā)現(xiàn)，DD 基因型者血管性假血友病因子和血栓調(diào)節(jié)蛋白水平升高，提示血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷在DD 基因型患者中增強(qiáng)［14］。而在另一項(xiàng)大樣本對照試驗(yàn)中的分析發(fā)現(xiàn)，DD 基因型作為一種危險(xiǎn)基因型，使東亞人發(fā)生左心室肥厚的幾率增加59%［15］。

本研究中，高血壓合并冠心病的DD 基因型組的Cys-C 水平較ID 型、II 型更高，且DD 基因型可能對Cys-C 升高有一定預(yù)測意義，考慮Cys-C 水平可能與ACE I/D 基因有著一定的相關(guān)性。在血管損傷過程中，炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生增加，進(jìn)而刺激彈性水解半胱氨酸蛋白酶的產(chǎn)生，Cys-C 則作為蛋白酶抑制劑調(diào)節(jié)蛋白酶的活性，在組織重塑中起著重要的功能［16］。國外學(xué)者表示，體內(nèi)自噬作用的失衡正是動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)展的特征，而Cys-C 則在自噬中起調(diào)節(jié)及抗動(dòng)脈粥樣硬化的作用［17］。近年來越來越多的數(shù)據(jù)顯示，Cys-C在評價(jià)冠心病發(fā)病、預(yù)后等方面具有較高價(jià)值，Cys-C升高心血管疾病的死亡率也隨之增加［18］。DONG 等人的結(jié)果表明，Cys-C＞1.055 mg/L可用于預(yù)測急性缺血性腦卒中后短暫腦缺血發(fā)作的發(fā)生發(fā)展［19］，也有研究認(rèn)為血清Cys-C水平與亞臨床動(dòng)脈粥樣硬化密切相關(guān)［20］。Cys-C的升高可作為判斷糖尿病患者心血管疾病風(fēng)險(xiǎn)的一個(gè)有價(jià)值的代表指標(biāo)［20］。除此之外，筆者也發(fā)現(xiàn)相較于II 基因型和ID 基因型，DD 基因型患者的UMA、24HUAE 水平也較其他兩組高，已有研究表示UMA 升高時(shí)發(fā)生冠心病的幾率比UMA 正常時(shí)高4 倍［21］，在心血管病患者藥物治療期間，減少24HUAE 水平會降低心血管事件的發(fā)生率［22］。可見UMA、24HUAE 與心血管疾病也存在著緊密的聯(lián)系，內(nèi)皮功能障礙和慢性炎癥、腎小球?yàn)V過膜的損害、經(jīng)血管滲漏的大分子物質(zhì)增加是解釋Cys-C、UMA、24HUAE 與冠心病、高血壓等心血管疾病之間的關(guān)聯(lián)的重要候選條件［23］，DD 基因型患者的RAAS 系統(tǒng)作用更強(qiáng)，因此各病理因素所致的UMA、24HUAE 水平可能也隨之升高。近期一項(xiàng)研究證明，在妊娠高血壓的早期腎損害中，Cys-c 與UMA 聯(lián)合檢測較單一檢測更能提高診斷效率［24］。國內(nèi)也有研究認(rèn)為Cys-c 聯(lián)合斑塊評分可以提高篩查嚴(yán)重冠心病的能力［25］。但以往的研究未從遺傳基因?qū)用孢M(jìn)行探討，本研究不僅證明了ACE I/D 基因與Cys-c的相關(guān)性，而且可見ACE I/D基因與Cys-c、UMA、24HUAE 聯(lián)合檢測用于評估原發(fā)性高血壓合并冠心病的病情進(jìn)展是具有現(xiàn)實(shí)意義的。

本研究可能存在樣本量偏小、生化指標(biāo)尚不全面等問題，而且國外有學(xué)者表示自噬活動(dòng)與動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)展存在反向關(guān)聯(lián)，隨著氧化應(yīng)激的時(shí)間延長，自噬活動(dòng)減弱［26］，可能在一定程度上影響了Cys-c 水平。未來的研究中我們?nèi)孕枥^續(xù)隨訪評估不同ACE 基因型患者病情進(jìn)展與Cys-c 的變化。綜上所述，ACE 基因多態(tài)性從遺傳基因水平對高血壓、冠心病的易感人群進(jìn)行早期預(yù)測，而Cys-C 作為冠心病的預(yù)測因子，也與ACE 基因多態(tài)性有著一定相關(guān)性，因此我們認(rèn)為這種相關(guān)性或許可以更準(zhǔn)確的反映高血壓合并冠心病時(shí)的靶器官損害水平，輔助我們在臨床工作中對患者提供更為準(zhǔn)確的診斷以及合理有效的治療。