董文敬 張海松 徐玉曉 崔靜 陳玉杰 王倩 葛坤 高燕 董文英

1河北大學附屬醫(yī)院（河北保定071000）；2保定市第一中心醫(yī)院（河北保定071000）；3河北大學（河北保定071000）；4吉林大學（吉林吉林132000）

羥基磷灰石（HAP）是骨骼和牙齒中最重要的無機礦物成分，但并非所有的HAP 都對人體有益。在泌尿系統(tǒng)，由HAP 誘導形成的Randall 斑塊是促進腎結石形成的重要原因［1］。在Randall 斑塊中存在從大小由納米到微米及不同形態(tài)的HAP［2］。草酸鈣結石是一種最常見的腎結石，其形成機制尚未完全闡明［3］。HAP 參與草酸鈣結石的形成，以及是如何促進腎結石的形成的機制研究尚未明確。

草酸鈣在腎乳頭Randall 斑塊上的過度生長是草酸鈣結石形成的潛在機制［4］。EVAN 等［5］通過腎臟活檢發(fā)現，Randall 斑起源于髓袢基底膜，隨后擴散到了腎直小管，最后到尿路上皮表面，促進草酸鹽晶體的成核、生長和聚集，從而增加了腎結石形成的風險。在含鈣結石或尿液中發(fā)現了許多磷酸鈣鹽成分，最常見的磷酸鈣鹽是HAP［6］。因此，HAP 與腎結石之間存在密切的關系，腎小管上皮細胞的氧化炎癥損傷與結石的形成密切相關［7］。YU 等［8］通過將HK-2 細胞與不同濃度的HAP 和/或巨噬細胞共同培養(yǎng)，HAP 增加上調了HK-2 細胞中骨橋蛋白（OPN）的表達水平，并引起異質的成核、粘附和晶體沉積，從而促進了Randall 斑塊和腎結石的形成。RAO 等［9］通過研究四種不同類型的HAP（球狀、針狀、棒狀、盤狀），結果表明HAP 的細胞毒性：球狀＞針狀＞棒狀＞盤狀，HAP 的物理性質對其細胞毒性起著至關重要的作用，同時發(fā)現HAP 可能激活細胞氧化應激反應，引發(fā)一系列細胞功能障礙、凋亡和壞死。本實驗設計不同濃度的HAP 探究其通過氧化應激反應對HK-2 細胞的凋亡的影響及其機制，為泌尿系結石的機制研究作一定探討。

1 材料與方法

1.1 主要試劑人源近端腎小管上皮細胞（HK-2細胞武漢普諾生命科技有限公司中國）、HAP（水熱法合成、分散性好、棒狀、60～100 nm×12 nm）、MEM 培養(yǎng)基和胎牛血清（Gibco 公司 美國）、胰蛋白酶（Sigma 公司 美國）、Annexin V-FITC/PI 細胞凋亡和壞死雙染料試劑盒、活細胞/死細胞染色試劑盒和DCFH-DA（上海貝博生物有限公司中國）、青霉素和鏈霉素、線粒體膜電位檢測試劑盒（JC-1）、吖啶橙（AO）染料（碧云天生物技術公司中國）、四甲基偶氮唑藍（hiazoyl blue tetrazolium dromide，MTT）（Amresco 公司美國）、Lyso-Tracker Red 和Mito-Tracker Green、過氧化氫（H2O2）試劑盒（賽默飛世爾科技有限公司 中國）、Caspase-3 活性試劑盒（南京建成生物工程研究所中國）。

1.2 實驗方法

1.2.1 HAP 的合成和表征根據文獻，利用水熱法合成了HAP［10］。將樣品分散到無水乙醇中、超聲均勻分散，滴于銅網，干燥，用透射電子顯微鏡（TEM）進行觀察。將樣品分散到無水乙醇中、超聲均勻分散，滴于硅片，干燥，用掃描電子顯微鏡（SEM）進行觀察。取適量的樣品，用X-射線衍粉末射儀（XRD）對其結構進行測定。取適量的樣品，用固態(tài)熒光測量儀對樣品的熒光性質進行。

1.2.2 細胞培養(yǎng)將HK-2 細胞接種到含有10%FBS，100 μg/mL 青霉素和100 μg/mL 鏈霉素的MEM培養(yǎng)基上在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，胰蛋白酶消化用于細胞繁殖，細胞同步后，實驗模型分組：（1）對照組：僅添加等體積PBS 溶液（0 μg/mL）；（2）HAP 處理組：將HK-2 細胞暴露于5、10、20、40、80 μg/mL 的HAP。

含HAP 的PBS 懸液的制備：將一定量的HAP粉末鋪板，用紫外線滅菌，過夜，然后分散在PBS溶液中，制備濃度為4 mg/mL 的懸浮液，并超聲處理5 min。

1.2.3 HK-2 細胞存活率和活細胞/死細胞染色檢測通過用MTT 的方法測定HK-2 細胞存活率［11］。將HK-2 細胞（2×104）接種到96 孔板上，按照上述分組分別孵育24、48、72 h，分別加入10 μL MTT，在37 ℃的條件下孵育4 h，棄去上清并加入100 μL DMSO，搖床震蕩10 min，使用酶標儀測定570 nm 的吸光度（OD）值。細胞活性=OD實驗組/OD對照組×100%。

將HK-2 細胞（1×105）接種到6 孔板上，實驗模型孵育24h，嚴格按照活死染試劑盒說明書操作，通過熒光顯微鏡觀察，綠色為活細胞，紅色為死細胞。

1.2.4 HK-2 細胞凋亡測定Annexin V-FITC/PI 細胞凋亡和壞死雙染料檢測細胞凋亡［12］。將HK-2細胞（1×105）接種到6 孔板上，實驗模型分為兩組：（1）對照組：僅添加PBS 溶液（0 μg/mL）；（2）HAP處理組：將HK-2 細胞暴露于10、20、40 μg/mL 的HAP，孵育6、24 h，嚴格按照試劑盒的說明書步驟操作，通過流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。

1.2.5 HAP 在HK-2 細胞內分布分別用Lyso-Tracker Red 或Mito-Tracker Green 追蹤HAP 在HK-2細胞中的細胞內分布［13］。將HK-2 細胞（2×104）接種到培養(yǎng)皿上，用HAP（40 μg/mL）處理HK-2 細胞6 h。用Lyso-Tracker Red 和Mito-Tracker Green分別給溶酶體和線粒體染色，用共聚焦顯微鏡觀察HAP 在細胞中的分布。

1.2.6 ROS 的檢測用DCFH-DA 檢測到細胞內ROS 水平［14］。孵育6 h，將細胞用200 μL DCFHDA 染色，在37 ℃暗處孵育20 min，PBS 洗滌3 次后，PBS 重懸，通過流式細胞儀檢測氧化DCFH-DA的熒光。

嚴格按H2O2試劑盒說明書步驟操作，使用酶標儀在415 nm 下測量吸光度。實驗模型分組：（1）對照組：僅添加等體積PBS 溶液（0 μg/mL）；（2）HAP 處理組：將HK-2 細胞暴露于5、10、20、40 μg/mL 的HAP。用5 mmol/L N-乙酰半胱氨酸（NAC）預處理1 h，使用酶標儀在570 nm 下測量吸光度。細胞活性=OD實驗組/OD對照組×100%。

1.2.7 溶酶體完整性檢測吖啶橙（AO）檢測溶酶體完整性，孵育6 h，用PBS 制備的5 μg/mL 吖啶橙染料（AO）溶液染色15 min，通過流式細胞儀檢測通透性。

用Lyso-Tracker Red 檢測溶酶體通透性的改變。加入Lyso-Tracker Red 和Hochest，分別孵育30 min和15 min。用熒光顯微鏡觀察溶酶體的堿化。

1.2.8 線粒體膜電位（ΔΨm）和Caspase-3 檢測將HK-2 細胞（每孔1×105個細胞）接種在6 孔板中，同2.2.4 實驗模型分組，孵育6 h，收集細胞并以1 000 rpm/min 離心5 min，吸出上清液，用PBS洗滌，再次離心獲得細胞沉淀，加入500 μL JC-1，在黑暗中于37 ℃孵育20 min，PBS 洗滌三次除去未反應的JC-1，并通過流式細胞儀檢測分析細胞的線粒體膜電位的變化。

將HK-2 細胞（每孔1×105個細胞）接種在6 孔板中，孵育6 h，嚴格按照說明書裂解細胞，取少量細胞樣品用BCA 蛋白濃度定量試劑盒定量蛋白濃度以保證每組的蛋白濃度在100～200 μg。Caspase-3 活性測定嚴格按說明書操作。用酶標儀測定波長為405 nm 的吸光度（OD）。Caspase-3 活化程度=OD樣品組/OD對照組×100%。

1.3 統(tǒng)計學方法所有結果至少作三個獨立平行實驗。數據表示為均數±標準差。單因素方差分析用于多重比較，兩組間比較用獨立樣本t檢驗。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 HAP 表征通過TEM 和SEM 對HAP 的形貌和大小進行測定。HAP 為分散性良好的棒狀，長度×高度：（60～100）nm×12 nm（圖1a、b）。利用XRD 對HAP 的結構進行測定，通過與標準衍射圖（JCPDS No.09-0432 標準衍射圖）對比，HAP 與標準衍射圖一致，表明合成了純的HAP（圖1c）。利用固態(tài)熒光測量儀檢測HAP 發(fā)藍光（圖1d）。

圖1 HAP 表征結果Fig.1 HAP characterization results

2.2 HAP 對的HK-2 細胞存活率影響MTT 法觀察不同劑量HAP 處理24、48 和72 h 對HK-2 細胞生存率的影響，見圖2a。0、5、10、20、40和80 μg/mL的HAP 處理的HK-2 細胞在24、48 和72 h 對HK-2細胞增殖均有明顯的抑制作用，并呈明顯的劑量依賴性。在24 h，HAP 在5、10 μg/mL 細胞存活率無明顯差異，約降低17%～19%，80 μg/mL 細胞存活率約降低60%。本結果顯示，HAP 抑制HK-2 細胞增殖，降低細胞生存率且引起細胞產生細胞毒性且呈濃度-時間依賴性。

活細胞/死細胞染色結果表明HK-2 細胞增殖能力隨濃度的增加而降低（圖2b）HAP 在20 μg/mL后釋放紅色熒光的死細胞逐漸增多，釋放綠色熒光的活細胞逐漸減少。HAP 在5、10 μg/mL 活/死細胞未觀察到明顯差異，80 μg/mL 時僅觀察到了少量的活細胞?；?死細胞染色結果與MTT 結果基本一致。

2.3 HAP 引起的HK-2 細胞調亡由于80 μg/mL的HAP 明顯的抑制HK-2 細胞的增殖并導致壞死脫落。結合細胞活性和活死染結果，選擇0、10、20、40 μg/mL 的HAP 分別作用于HK-2 細胞共孵育6、24 h，凋亡結果表明6 h 細胞的存活率沒有明顯差異（圖2c），24 h 凋亡結果表明細胞的凋亡和壞死率隨著濃度的增加而升高（圖2c、d）。

圖2 HK-2 細胞凋亡結果Fig.2 Results HK-2 cell apoptosis

2.4 HAP 在HK-2 細胞中的分布見圖3，HAP的藍色熒光主要與Lyso-Tracker 標記的溶酶體的紅色熒光重疊，與Mito-Tracker 標記的綠色熒光僅有部分局限，結果表明HAP 主要分布在溶酶體。

2.5 HAP 誘導HK-2 細胞ROS 的釋放DCFHDA 熒光探針檢測了HAP 誘導的HK-2 細胞中ROS的變化。熒光強度的定量結果表明，HK-2 細胞中的ROS 水平隨濃度增加增加（圖4a）。HK-2 細胞中的H2O2水平隨濃度增加增加（圖4b）。正常組的細胞具有暗熒光，表明細胞內ROS 水平低。HAP治療組的綠色熒光均顯著增強（圖4d），表明HAP導致細胞內ROS 水平升高。乙酰半胱氨酸（NAC）是一種抗氧化劑，加入NAC，HAP 誘導的細胞活性較未加入NAC 的細胞生存率升高（圖4c），表明細胞的生存率與ROS 釋放有關，HAP 在5、10 μg/mL細胞存活率無明顯差異。

圖3 在暴露于40 μg/mL 的HAP 中6 h 后，HK-2 細胞中HAP 的分布（標尺：10 μm）Fig.3 HAP distribution in HK-2 cells after 6 hours of exposure to HAP at 40 μg/mL（Scale：10 μm）

圖4 HK-2 細胞ROS 的釋放Fig.4 ROS release from HK-2 cells

2.6 HAP 對HK-2 細胞溶酶體膜完整性的影響見圖5a。HAP 可使HK-2 細胞溶酶體通透性增加，溶酶體內的大量的水解酶釋放，溶酶體膜受損。Lyso-Tracker Red 是一種堿性染料，溶酶體紅在溶酶體內的熒光強弱可間接反應溶酶體的完整性，見圖5d。HAP 可使HK-2 細胞溶酶體完整性受損。結果表明HAP 可使HK-2 細胞溶酶體完整性受損，且呈濃度依賴性。

2.7 HAP 對HK-2 細胞線粒體功能的影響見圖5b，所示隨HAP 濃度的增加ΔΨm 降低。HAP引起的細胞內ROS 水平升高可能導致ΔΨm降低。

2.8 caspase-3 的釋放caspase-3 是細胞凋亡的過程中的一種關鍵酶。見圖5c，所示隨HAP 濃度的增加caspase-3 增加。由HAP 引起的細胞ΔΨm 降低可能導致caspase-3 激活。

3 討論

腎結石是一種日益增長的泌尿系統(tǒng)疾病，約占世界人口的5%～13%［15］。目前治療腎結石的主要方法是外科手術［16］，但患者的復發(fā)率高，5年復發(fā)率約為50%［17］。因此，了解腎結石的發(fā)病機制對結石的治療和預防復發(fā)具有重要意義。目前國內外主要集中在草酸鈣在腎結石形成機制的探究［18］，而關于HAP 作為促進腎結石形成的機制的研究較少。

圖5 HAP 對HK-2 細胞線粒體功能和細胞溶酶體膜完整性的影響Fig.5 Effect of HAP on mitochondrial function and lysosomal membrane integrity of HK-2 cells

近年來國內外出現了關于HAP 對腎上皮細胞損傷的報道，余駿川等［19］研究了HAP 對HK-2 細胞的損傷作用，發(fā)現細胞存活率與HAP 的濃度呈負相關且通過上調細胞內的OPN 表達參與腎結石的形成。COHENA 等［20］將草酸，草酸鈣和HAP與犬腎細胞（MDCK）共培養(yǎng)，結果表明它們都引起MDCK 細胞中基質Gla 蛋白（MGP）表達增加，超氧化物歧化酶釋放，乳酸脫氫酶釋放，并促進細胞凋亡率，從而促進腎結石的形成。研究表明HAP 對腎上皮細胞造成損傷，但并未對其造成損傷的機制進一步研究。有研究表明當300 μg/mL的HAP 會對HK-2 細胞造成不可逆的損傷，造成大量細胞凋亡［21］，所以設計的最大濃度不高于200 μg/mL，本研究通過MTT 和活細胞/死細胞染色實驗，發(fā)現HAP 可以降低HK-2 細胞的存活率，抑制細胞增殖，表明對HK-2 細胞具有一定的損傷作用。

研究表明細胞內的氧化應激反應能引起細胞氧化炎癥損傷，過量的ROS 會引起氧化應激，導致正常的腎上皮細胞功能障礙、細胞凋亡甚至死亡［22］。目前主要凋亡途徑包括線粒體和溶酶體途徑［23］，ROS 是ΔΨm 降低的直接原因［24］。當細胞受損時，造成大量ROS 釋放可引起線粒體功能障礙，包括ΔΨm 下降、bcl-2 的降低以及bcl-2 相關bax 蛋白的釋放，同時線粒體通過釋放細胞色素c進一步活化Caspase-9，Caspase-9 又可激活下游的Caspase-3，導致細胞凋亡［25］。本研究通過流式細胞儀檢測HAP 可導致ΔΨm 明顯降低、Caspase-3 水平增加，與ROS 的上升趨勢一致。

溶酶體膜的完整性是細胞凋亡過程中的關鍵因素［26］，組織蛋白酶B 是一種存在于溶酶體內的凋亡介質［27］，當溶酶體膜完整性受損可導致組織蛋白酶B 釋放，從而導致細胞調亡。本研究通過共聚焦顯微鏡觀察HAP 主要分布在溶酶體內，溶酶體膜的通透性增加，組織蛋白酶B 釋放，導致細胞凋亡。

綜上，本研究對不同濃度的HAP 通過溶酶體-線粒體途徑誘導HK-2 細胞凋亡。其機制：（1）HK-2 細胞內的ROS 釋放增加導致線粒體膜電位降低，激活caspase-3 導致HK-2 細胞凋亡；（2）HAP主要定位于HK-2 細胞的溶酶體中導致溶酶體膜的通透性增加，凋亡因子釋放（組織蛋白酶B）引起細胞凋亡；（3）值得注意的是HAP 作用于HK-2細胞6 h 時沒有引起細胞凋亡，但有大量ROS 產生、線粒體膜電位降低、caspase-3 水平升高等改變。表明凋亡的因素的出現早于細胞的凋亡。本研究表明HAP 能明顯的抑制HK-2 細胞增殖，并通過溶酶體-線粒體通徑介導細胞的凋亡和壞死，從增加了結石形成的風險。