劉劍剛 崔瑞昭 徐羽柔 蘇慶民
100091 北京,中國中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院/國家中醫(yī)心血管病臨床醫(yī)學(xué)研究中心(劉劍剛,崔瑞昭);300270 天津,天津醫(yī)科大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院(徐羽柔);100700 北京,中國中醫(yī)科學(xué)院中醫(yī)藥發(fā)展研究中心(崔瑞昭,蘇慶民)
IgA腎病(IgA nephropathy,IgAN)的發(fā)病原因有免疫、遺傳、基因和環(huán)境等多種因素,其病理機制是以腎小球系膜免疫球蛋白A(immunoglobulin A,IgA)為主的免疫復(fù)合物沉淀和腎小球系膜增生為主要病理特征的一種常見原發(fā)性腎小球疾病[1]。其臨床表現(xiàn)主要為血尿,可伴有不同程度的蛋白尿、高血壓和腎功能受損,是導(dǎo)致終末期腎病的常見原發(fā)性腎小球疾病之一。IgAN的發(fā)病原因及機制目前仍不十分明確,治療上仍無法從根本上阻止IgA沉積或?qū)gA移出系膜區(qū)[2]。
美國腎臟病基金會管理下的改善全球腎臟病預(yù)后組織(Kidney Disease:Improving Global Outcomes,KDIGO)協(xié)會推薦的臨床治療指南,強調(diào)采用控制血壓、減少尿蛋白、強化免疫抑制治療的方案對IgAN的患者進行干預(yù)[3],可見免疫損傷、尿蛋白和血壓波動仍是目前治療的靶點。因此,國內(nèi)外學(xué)者大多采用免疫誘導(dǎo)結(jié)合繼發(fā)性病變的方法多因素制作IgAN動物模型,模擬人類IgAN的發(fā)病特點。應(yīng)用口服牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)+注射脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)+皮下注射蓖麻油和四氯化碳(carbon tetrachloride,CCl4)多因素方法建立的實驗性大鼠模型是目前較為成熟且應(yīng)用廣泛的IgAN模型?,F(xiàn)有文獻對IgAN模型大鼠腎組織的病理結(jié)構(gòu)、炎癥因子和腎功能演變規(guī)律的進行了較多研究,但對于IgA沉積于腎小球的熒光表達和腎臟組織中炎癥表達的研究較少[4],本文從腎臟轉(zhuǎn)化生長因子β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)和T細胞免疫球蛋白黏蛋白-1(T cell immune globulin sticky protein 1,TIM-1)相關(guān)蛋白表達,探討IgAN的炎癥免疫機制,為臨床藥物應(yīng)用提供治療依據(jù)。
1.實驗動物 健康SPF級Sprague-Dauley(SD)大鼠,20只,雄性,體質(zhì)量160~180 g,購于斯貝福(北京)生物技術(shù)有限公司,動物合格證:SCXK(京)2015-0015,質(zhì)量合格證號:NO.11401500017003。飼養(yǎng)于中國中醫(yī)醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院屏障系統(tǒng)環(huán)境動物室,溫度控制在24~26 ℃,相對濕度55%~75%,以標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng),動物自由攝食及飲水,適應(yīng)性喂養(yǎng)后7 d進行實驗。
2.實驗試劑與藥品 牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA/V組分)(批號:20181022A)購于北京克爾慧科技有限公司;LPS(批號:181102N)購于默克生命科學(xué)(Sigma,上海)有限公司;蓖麻油(化學(xué)純)(批號:2018091212)購于北京化工廠;N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶(N-acetyl-β-D-glucosaminidase,NAG)試劑盒(批號:20181112)購于南京建成生物工程研究所;β2-微球蛋白ELISA試劑盒(批號:20181102)購于北京華英生物技術(shù)研究所;α1微球蛋白ELISA試劑盒(批號:20181106)購于北京華英生物技術(shù)研究所;白細胞介素-4(interleukin-4,IL-4)ELISA試劑盒(批號:20180910)、白細胞介素-6(interleukin-6,IL-6)ELISA試劑盒(批號:20180816)、干擾素-γ(interferon-γ,IFN-γ)ELISA試劑盒(批號:20180709)購于北京欣博盛生物科技有限公司。TGF-β1抗體、TIM-1抗體購于艾博抗(Abcam,上海)貿(mào)易有限公司。
1.模型制備及分組 將20只大鼠采用隨機數(shù)字表分為模型組和空白對照組。其中,模型組參照高明等[5]造模方法進行改良,采用“BSA+LPS+CCl4”復(fù)合法制作實驗性IgAN大鼠模型。從實驗開始之日起,模型組大鼠予以BSA溶液(400 mg/kg,1 mL/100g)隔日灌胃,持續(xù)6周,皮下注射蓖麻油0.5 mL+四氯化碳溶液0.1 mL,每周1次,持續(xù)9周,并聯(lián)合運用LPS溶液(0.05 mg/只),分別于第6、8周尾靜脈注射,共2次,造模時間為10周??瞻讓φ战M,從實驗開始之日起,以4 mL/kg純化水隔天灌胃,共持續(xù)8周;皮下注射0.9%氯化鈉溶液0.4 mL/只,每周1次,持續(xù)9周,于第6、8周尾靜脈注射0.9%氯化鈉溶液0.2 mL/只,持續(xù)時間為10周。第10周末,大鼠空腹12 h(正常飲水),腹腔麻醉(4%水合氯醛,0.9 mL/100g體質(zhì)量,)腹主動脈取血,然后取大鼠腎組織做病理檢測及免疫組化檢測,按照實驗動物倫理要求進行安死術(shù),實驗過程符合國家動物福利倫理規(guī)范和北京市實驗動物倫理規(guī)定的要求。
2.標(biāo)本采集及檢測
(1)尿液樣本采集及檢測:在實驗開始和第10周末,將兩組大鼠分別放入代謝籠中,收集實驗大鼠24 h尿液,記錄24 h尿量,收集后取適量(約10 mL)待檢。第10周末采用免疫比濁法檢測尿微量白蛋白(micro-albumin,mALB),采用免疫比濁法檢測24 h尿蛋白。
(2)血清樣本采集及檢測:第10周末,兩組大鼠禁食不禁水12 h,腹腔麻醉后腹主動脈采血,將血液注入真空管中,室溫放置一段時間后,采用低溫離心機3 000 r/min,離心15 min(3-18G型高速冷凍離心機,SIGMA(美國)公司生產(chǎn)),取上清液,分為3份,置于-70 ℃冰箱保存,待測。
(3)肝腎功能檢測:應(yīng)用比色法(A6型半自動生化儀,北京松上技術(shù)有限公司)進行檢測血清NAG含量;采用ELISA法(DR-200BS型全自動酶標(biāo)分析儀,無錫華衛(wèi)德朗儀器有限公司)測定血清β2-微球蛋白(β2-microglobulin,β2-MG)和α1-微球蛋白(α1-microglobulin,α1-MG)含量。
(4)細胞因子檢測:采用ELISA法測定血清中IL-4、IL-6、IFN-γ含量。
(5)免疫指標(biāo)檢測:用比色法測定血清中IgA含量,IgA與相應(yīng)特異性抗體在溶液中反應(yīng),形成的抗原-抗體復(fù)合物,并產(chǎn)生一定的濁度,根據(jù)濁度高低和血清中IgA的水平成正比的原理進行測定。
(6)腎組織病理檢測:麻醉后的大鼠取雙腎組織,分別置于液氮罐中(左腎5只)轉(zhuǎn)存于-70 ℃冰箱和10%多聚甲醛固定液中(右腎5只)做冰凍切片(LEICA AUTO STAINER-XL型自動染色封片工作站,徠卡(LEICA)顯微系統(tǒng)(上海)貿(mào)易有限公司)和石蠟切片(RM2245型半自動石蠟切片機,徠卡(LEICA)顯微系統(tǒng)(上海)貿(mào)易有限公司),進行IgA免疫熒光檢測和HE染色病理組織檢測。
對腎組織IgA免疫熒光進行檢測。冰凍切片(30 μm),常規(guī)操作,然后一抗(IgA抗體)4 ℃孵育,PBS緩沖液3次沖洗,熒光二抗37 ℃孵育,30 min,PBS緩沖液3次沖洗,二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色,10 min,使用含有異硫氰酸(fluorescein isothiocyanate,F(xiàn)ITC)熒光劑的封片劑封片,熒光顯微鏡讀片。免疫熒光強度分級半定量標(biāo)準(zhǔn)參照文獻[4]中的5級法:低倍鏡(BH-2型,日本OLYMPUS株式會社生產(chǎn))下不能顯示,高倍鏡下似乎可見,為-;低倍鏡下似乎可見,高倍鏡下可見,為+;低倍鏡下可見,高倍鏡下清晰可見,為++;低倍鏡下清晰可見,高倍鏡下耀眼,為+++;高倍鏡下刺眼,為++++。
(7)腎臟組織TGF-β1、TIM-1表達的檢測:免疫組織化學(xué)染色,石蠟切片(5 μm),常規(guī)操作,然后直接滴加一抗,依據(jù)預(yù)實驗確定的濃度(TGF-β1為1∶500,TIM-1為1∶800)滴加,4 ℃過夜。滴加二抗生物素化山羊抗小鼠IgG,37 ℃,30 min,滴加SABC復(fù)合物,PBS溶液沖洗,封片,顯微鏡觀察。計算機圖像采集系統(tǒng)(DP-200型,丹麥DpxView Pro公司生產(chǎn))觀察腎組織免疫組化染色,腎組織免疫組化半定量分析,每個標(biāo)本切片隨機觀察至少3個不重疊的視野進行觀察(計15個視野),以腎小球內(nèi)的染色為棕褐色為陽性標(biāo)志,采用Imagepro-Plus 6.0圖像分析系統(tǒng)測定每只大鼠腎臟組的積分光密度(integral opical density,IOD)值,根據(jù)累積IOD值的結(jié)果進行比較,比較陽性物質(zhì)的表達量。
動物造模后,第6周后出現(xiàn)不同程度的毛色灰暗、不光澤、活動減少、精神萎靡等,提示大鼠自我清潔能力和活動能力減弱。其次出現(xiàn)便溏、體質(zhì)量略有減輕等,反映大鼠出現(xiàn)應(yīng)激狀態(tài)體質(zhì)減弱??瞻捉M大鼠在整個實驗過程中一般狀態(tài)良好,體質(zhì)量增長明顯,二便正常,且反應(yīng)靈敏,毛色光澤,活動能力自如。
第10周末,鏡下觀察,模型組大鼠腎組織的腎小球增生、沉積、腫脹(圖1中箭頭所示),基底系膜增生和系膜基質(zhì)增寬,出現(xiàn)了不同程度的系膜細胞和毛細血管內(nèi)皮細胞增生,且腎小管間質(zhì)纖維化明顯,腎小管萎縮,間質(zhì)纖維化。空白對照組大鼠的腎小球和腎小管形態(tài)結(jié)構(gòu)正常,系膜和基底沒有增生,細胞形態(tài)和結(jié)構(gòu)正常。(圖1)
注:A.空白對照組;B.模型組圖1 兩組大鼠腎組織病理HE染色比較(HE,×150)
多因素造模后,模型組大鼠腎小球IgA熒光染色,可見有團塊狀或顆粒狀綠色熒光,熒光強度(++)~(+++),空白對照組大鼠腎小球組織無熒光反應(yīng),IgA免疫熒光極弱(圖2)。模型組高熒光強度的大鼠個數(shù)顯著多于空白對照組(P<0.05)。(表1)
注:A.空白對照組;B.模型組圖2 兩組大鼠腎組織IgA免疫熒光染色的比較(×400)
表1 兩組大鼠腎臟組織IgA免疫熒光染色的比較(只)
注:與空白對照組比較,aP<0.05
大鼠造模第10周末,尿微量白蛋白比較,模型組顯著高于空白對照組(P<0.05),24 h尿蛋白定量比較,模型組顯著高于空白組(P<0.01)。(表2)
表2 兩組大鼠尿微量白蛋白和24 h尿蛋白定量比較
注:與空白對照組比較,aP<0.05,bP<0.01
造模后,與空白對照組比較,模型組大鼠血清NAG、β2-MG、α1-MG均顯著升高(均P<0.05)。(表3)
表3 兩組大鼠血清的NAG、β2-MG和α1-MG含量比較
注:與空白對照組比較,aP<0.05,bP<0.01
造模后,與空白對照組比較,模型組大鼠血清IL-4、IL-6、IgA含量水平顯著升高(P<0.05),模型組大鼠血清IFN-γ有一定程度的降低,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。(表4)
表4 兩組大鼠血清的炎性因子水平和IgA含量的比較
注:與空白對照組比較,aP<0.05
造模后,空白對照組大鼠腎小球及基膜組織有少量的TGF-β1和TIM-1陽性表達,大多分布在腎小管上皮細胞上。模型組大鼠腎小球及基膜上TGF-β1和TIM-1的陽性表達明顯增加,大多分布在腎小球部位(圖3)。與空白對照組比較,模型組TGF-β1和TIM-1的表達均有顯著升高(P<0.01)。(表4)
表4 兩組腎組織 TGF-β1和TIM-1的免疫組化IOD值比較
注:與空白對照組比較,aP<0.05
目前,有關(guān)IgAN的發(fā)病原因及機制仍不明確,也是目前臨床治療和基礎(chǔ)研究面臨的重要課題。利用動物模型探索IgAN的發(fā)病機制、病情進展及藥物干預(yù)是研究熱點。采用多種因素聯(lián)合制造IgAN動物模型,仍然是國內(nèi)學(xué)者大多采用的方法,此類方法可以提高動物患病率,減少制作模型的時間,接近人類IgAN的發(fā)病特點。早期湯穎等[5]對以往IgAN模型的制作方法進行改良,建立了一種新的造模方法:隔日口服BSA 400 mg/kg,持續(xù)6周,皮下注射蓖麻油0.5 mL+四氯化碳溶液0.1 mL,每周1次,持續(xù)9周,并分別于第6、8周運用LPS 0.05 mg/只尾靜脈注射。陸慧瑜等[6]在湯穎文獻的基礎(chǔ)上,進一步改良:將隔日口服BSA延長到8周,蓖麻油改為0.3 mL,取消第8周LPS尾靜脈注射,此方法考慮到口服免疫原BSA安全,為了增強免疫原性,延長了兩周。孫紅旭等[17]在前人文獻的基礎(chǔ)上加以改進,采用口服BSA(600 mg/kg,隔天1次灌胃)+皮下注射蓖麻油0.3 mL+四氯化碳溶液0.10 mL(每周1次持續(xù)8周)+LPS尾靜脈注射,腎臟病理形態(tài)學(xué)改變明顯,腎組織IgA免疫熒光染色增強,熒光陽性面積和平均光密度值升高。
本課題在多因素造模的基礎(chǔ)上加以改進,造模時間延長至10周。結(jié)果表明,腎臟組織病理學(xué)改變明顯,腎組織IgA免疫熒光染色顯著增強。IgAN發(fā)病的重要因素之一就是多種細胞因子的分泌異常,T細胞亞群分化異常在多種自身免疫疾病發(fā)病中被闡明證實。IgAN患者血清和腎組織活檢中可檢出抗BSA多克隆基因型抗體,因此,口服BSA異體蛋白造成機體免疫系統(tǒng)的損傷,Th1/Th2失衡與IgAN的相關(guān)性逐漸被人們所接受,Nogaki等[8]由此提出Th1/Th2失衡與IgA的分泌水平相關(guān),當(dāng)Th2占據(jù)主導(dǎo)地位時,它可以分泌過量的IL-4、IL-6等細胞因子,而且IL-4、IL-6不僅能使Th2過度分化,還同時使B細胞活化,增殖分泌抗體。IFN-γ由Th1分泌,研究表明,IgAN患者中外周血中IFN-γ減少,而IL-4、IL-6升高[9],證實了IgAN患者存在著Th1/Th2失衡向Th2偏倚的現(xiàn)象。本實驗的動物模型結(jié)果顯示,IgAN大鼠中血清中IL-4、IL-6含量升高,IFN-γ含量明顯減少。
LPS為細菌壁成分,是一種免疫佐劑,可誘導(dǎo)IgA及C3在腎小球系膜區(qū)的沉積,早期研究證實其不易對動物機體造成損害[10-11]。蛋白尿是促進腎臟疾病進展的獨立危險因子之一,大量蛋白尿可導(dǎo)致腎小球硬化及腎間質(zhì)纖維化。本實驗大鼠經(jīng)過造模后出現(xiàn)了蛋白尿,24 h尿蛋白也顯著升高。整個實驗造模過程中無大鼠死亡,光鏡下的腎組織病理顯示腎小球系膜基質(zhì)增生和系膜基質(zhì)增厚,免疫熒光顯示腎小球有較強的IgA沉積。國內(nèi)文獻大多報道的IgAN動物模型制作是否成功,大多以血尿、蛋白尿、血肌酐等指標(biāo),結(jié)合病理免疫檢查為診斷依據(jù),缺少疾病的早期診斷和機制探討。因此,本研究選用了血清NAG、β2-MG和α1-MG指標(biāo)早期預(yù)測肝腎功能的損傷變化,結(jié)果顯示IgA模型大鼠這些指標(biāo)都明顯升高,說明在IgAN模型中這些指標(biāo)的異常更能反映肝腎功能早期的損傷變化。
TGF-β1是調(diào)節(jié)細胞生長和分化的TGF-β家族蛋白之一,近年來發(fā)現(xiàn)TGF-β1對細胞的生長、分化和免疫功能都有重要的調(diào)節(jié)作用。而TIM-1由Mcintire等[12]在分析人類染色體5q23-35基因與哮喘的易感性時首次發(fā)現(xiàn)并命名,1998年,Chimura等[13]又將其命名為腎損傷分子-1(kidney injury molecule-1,KIM-1),因在缺血再灌注大鼠模型中確定該分子的高度表達與腎小管損傷程度相關(guān)。近年來,有研究表明TIM-1可調(diào)節(jié)多種效應(yīng)性T細胞的表達,影響Th1/Th2細胞的平衡[14],而Th1/Th2失衡,Th0分化向Th2偏倚,在調(diào)節(jié)Th2中起重要作用。系膜區(qū)的IgA1免疫復(fù)合物沉積大致通過以下3種機制導(dǎo)致腎損傷[2]:(1)首先是IgA1對系膜細胞的損傷,異常糖基化IgA1免疫復(fù)合物被特異性識別后在系膜區(qū)沉積后引起促炎癥細胞因子,呈現(xiàn)為系膜細胞和系膜基質(zhì)的增生,腎小管間質(zhì)炎癥細胞浸潤,導(dǎo)致腎小管間質(zhì)纖維化,最終出現(xiàn)腎衰竭;(2)其次是IgAN足細胞損傷機制,系膜細胞與足細胞之間通過細胞因子進行“交互對話”,介導(dǎo)足細胞凋亡的發(fā)生,足細胞的凋亡是導(dǎo)致腎臟疾病的重要原因;(3)第三是IgAN腎小管間質(zhì)損傷機制,IgAN患者系膜細胞產(chǎn)生的TGF-β1通過腎小球濾過和血液運輸?shù)侥I小管間質(zhì),刺激腎小管上皮細胞局部炎癥反應(yīng)并呈現(xiàn)級聯(lián)式放大,引起腎小管上皮細胞損傷和細胞外基質(zhì)成分的過度生成,導(dǎo)致纖維化和腎衰竭[15]。本次實驗結(jié)果顯示,IgAN模型大鼠腎組織中TGF-β1表達明顯增強,腎小管的TIM-1表達亦顯著增加,可能是導(dǎo)致纖維化和腎功能不全的潛在信號。
綜上所述,BSA灌胃結(jié)合皮下注射蓖麻油與四氯化碳溶液和尾靜脈注射LPS多因素所致IgAN大鼠模型能夠較好體現(xiàn)IgAN患者的臨床和病理體征,血清中NAG、β2-MG和α1-MG的早期檢測更能反映肝腎功能的損傷程度,血清中IL-4、IL-6水平升高以及腎組織TGF-β1、TIM-1表達上調(diào)提示免疫和炎癥參與IgAN發(fā)病機制。