程艷 余曉紅

鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院婦科 鄭州 450052

靶向基因治療是使正?；蛲ㄟ^(guò)分子生物工程或治療在腫瘤細(xì)胞中借Yinte遠(yuǎn)程作用的手段，抑制致瘤基因或修復(fù)有缺陷的基因，使腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)受到抑制，而不影響正常細(xì)胞。國(guó)內(nèi)外研究表明，孕酮受體膜成分(PGRMC1)和惡性腫瘤關(guān)系密切，在卵巢癌、乳腺癌、結(jié)腸癌、肺癌、子宮頸癌和其他惡性腫瘤中呈高表達(dá)，但確切的作用機(jī)制尚不清楚[1-3]。我們通過(guò)構(gòu)建靶向PGRMC1基因shRNA 真核表達(dá)載體,以期抑制PGRMC1基因表達(dá)而使PGRMC1基因表達(dá)下調(diào)，為PGRMC1開(kāi)展卵巢癌基因治療奠定基礎(chǔ)和提供實(shí)驗(yàn)工具。

1 材料與方法

1.1材料與試劑人卵巢癌細(xì)胞株SKOV3細(xì)胞系購(gòu)自上海研究所。RPMI1640培養(yǎng)基，新生小牛血清，逆轉(zhuǎn)錄(RT)-PCR試劑盒購(gòu)自美國(guó)Gibco公司。限制性內(nèi)切酶， DNA連接酶購(gòu)自上海生工有限公司。脂質(zhì)體Lipofectamine2000 ， TRIzol試劑的產(chǎn)品，空載體pcDNA3.1A購(gòu)自美國(guó)Introvigen公司 。四氮唑藍(lán)(MTT)，氨基糖苷類(lèi)抗生素G418購(gòu)自Sigma公司。

1.2PGRMC1基因的設(shè)計(jì)和合成從GenBank獲取PGRMC1 mRNA 的完整序列。根據(jù)Tuschl設(shè)計(jì)原則[4],設(shè)計(jì)3條shRNA (short hairp in RNA),特異性干擾PGRMC1基因3段不同序列。設(shè)計(jì)另1條shRNA 干擾選中的shRNA 中的堿基序列作為陰性對(duì)照,經(jīng)BLAST檢索確定且與PGRMC1 mRNA 及其他基因編碼序列無(wú)同源性。按照該試劑盒的使用說(shuō)明，用TRIzoL 試劑提取RNA。其中1μg總RNA 在SuperScrip tTM Ⅱ逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生cDNA。PCR 引物用于擴(kuò)增靶向和對(duì)照序列產(chǎn)物(引物序列PGRMC1正義鏈5'-GCTCTGGCTTTGCATTTGATGCA-3 ' ，反義鏈5'- AGGAGCAGAAGTTTGAAC -3')。轉(zhuǎn)染48 h后，收集細(xì)胞，漂洗2次，用冷PBS后，將細(xì)胞裂解，提取總蛋白。該產(chǎn)品12%的SDS-PAGE ，以蛋白質(zhì)電泳轉(zhuǎn)移儀將產(chǎn)物轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上,加入孕酮受體膜成分的抗體(1∶ 1000～1200)，4℃反應(yīng)過(guò)夜，PBST洗膜，和1∶ 4000山羊抗兔IgG / HRP室溫下攪拌12 h，用化學(xué)發(fā)光試劑反應(yīng)5 min，用發(fā)光成像儀成像。

2 結(jié)果

2.1PCR擴(kuò)增PGRMC1基因的開(kāi)放閱讀框結(jié)果RT-PCR擴(kuò)增的PGRMC1產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析, 發(fā)現(xiàn)所擴(kuò)增的條帶特異性強(qiáng), 大小為2000 bp, 與預(yù)期的大小一致。見(jiàn)圖1。

1. PGRMC1 PCR 產(chǎn)物 M: DNA Marker

圖1 PGRMC1基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果

2.2組件的構(gòu)建和鑒定重組質(zhì)粒pcDNA3.1 (-)/PGRMC1 PRGMC1測(cè)序克隆pcDNA3.1 (-)/PGRMC1的表達(dá)載體，所述重組質(zhì)粒pcDNA3.1 (-)/PGRMC1。PCR實(shí)驗(yàn)陽(yáng)性的菌落提取質(zhì)粒DNA，用限制性酶MsqI酶切位點(diǎn)的酶和Smo I雙重消化，結(jié)果顯示，PGRMC1成功地建立到pcDNA3.1 (-)的真核表達(dá)載體中。

2.3篩選的細(xì)胞系和鑒定穩(wěn)定轉(zhuǎn)染將pcDNA3.1 (-)/孕酮受體膜成分質(zhì)粒轉(zhuǎn)染卵巢癌細(xì)胞系SKOV3，培養(yǎng)4周后，將孕酮受體膜成分陽(yáng)性細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)株。通過(guò)RT-PCR和轉(zhuǎn)染的pcDNA3.1的Western印跡分析(-)/孕酮受體膜成分SKOV3細(xì)胞與SKOV3細(xì)胞轉(zhuǎn)染空載體相比，表達(dá)的兩個(gè)內(nèi)部基準(zhǔn)電平基本上是相同的；而前者孕酮受體膜成分-基因表達(dá)水平顯著增加，表明重組質(zhì)粒已經(jīng)成功傳遞到表達(dá)(圖3，圖4)和SKOV3細(xì)胞系。

1: 未酶切的pcDNA3.1(-)/PGRMC1

Undigestion of pcDNA3.1(-)/PGRMC1

2: MspI 和SmoI雙酶切后的pcDNA3.1(-)/PGRMC1

MspI and SmoI digestion of pcDNA3.1(-)/PGRMC1

3: PGRMC1 PCR 產(chǎn)物product M: DNA marker

圖2 pcDNA3.1(-)/PGRMC1 雙酶切鑒定結(jié)果

圖3 通過(guò)RT-PCR檢測(cè)在PGRMC1的表達(dá) 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染SKOV3細(xì)胞系

圖4 免疫印跡檢測(cè)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染前，后SKOV3細(xì)胞系中的PGRMC1基因表達(dá)

3 討論

PGRMC1是一類(lèi)小分子蛋白，含有194個(gè)氨基酸，包括1個(gè)N端跨膜結(jié)構(gòu)域，1個(gè)細(xì)胞色素b5樣或亞鐵血紅/類(lèi)固醇結(jié)合域。PGRMC1主要分布在后期卵黃的卵巢、肝臟和頭腎。研究發(fā)現(xiàn)，PGRMC1在乳腺癌、結(jié)腸癌、肺癌、宮頸癌等惡性腫瘤組織中呈過(guò)度表達(dá)，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)PGRMC1在卵巢中含量比較大[4-5]。且PGRMC1在卵巢癌組織中普遍呈過(guò)度表達(dá)，可促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞的增殖。PGRMC1不僅與孕激素結(jié)合，還可以與其他甾體和非甾體類(lèi)物質(zhì)結(jié)合。有研究發(fā)現(xiàn)，PGRMC1可以促進(jìn)卵巢癌的發(fā)生，敲除此基因后，卵巢癌細(xì)胞的增殖受到抑制，順鉑的敏感性會(huì)增加。提出削弱PGRMC1的作用，有望作為卵巢癌靶向治療及輔助化療的一部分[6-8]。

在此研究中，我們成功構(gòu)建PGRMC1到真核表達(dá)載體pcDNA3.1(-)中，通過(guò)限制性內(nèi)切酶鑒定，測(cè)序，證實(shí)了靶基因的PRGMC1的正確序列，成功地建立了穩(wěn)定整合在基因組中的DNA染pcDNA3.1(-)/PGRMC1-SKOV3細(xì)胞克隆時(shí)，細(xì)胞克隆的細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，用RT-PCR和Western blot檢測(cè)PRGMC1高表達(dá)的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染卵巢癌細(xì)胞。

本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建的載體經(jīng)PCR電泳圖譜和測(cè)序證實(shí)了克隆RNAi打靶序列完全正確, 合成的寡核苷酸已成功載入載體。通過(guò)構(gòu)建shRNA真核表達(dá)載體,成功地阻抑了PGRMC1基因在人卵巢癌細(xì)胞SKOV3中的表達(dá),成功構(gòu)建的pcDNA3.1(-) / PGRMC1 質(zhì)粒 SKOV3細(xì)胞系為研究PGRMC1調(diào)節(jié)卵巢癌的分子機(jī)制及下游基因奠定了基礎(chǔ)，為進(jìn)一步研究PGRMC1基因在腫瘤細(xì)胞發(fā)生和惡性進(jìn)展的作用及探討卵巢癌基因治療新方法提供了可能。