楊貴紅,黃 鷹

(南京師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,江蘇 南京 210023)

線(xiàn)粒體是細(xì)胞呼吸的主要場(chǎng)所,其主要作用是通過(guò)氧化磷酸化產(chǎn)生細(xì)胞活動(dòng)所需的能量[1],被稱(chēng)為細(xì)胞的“動(dòng)力車(chē)間”. 此外,線(xiàn)粒體還參與細(xì)胞氧化還原、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)以及細(xì)胞凋亡等生命活動(dòng)[2-4],因此深入研究線(xiàn)粒體各種特性對(duì)生命科學(xué)具有重要意義.

細(xì)胞色素c(Cyt c)是一種水溶性含鐵血紅素蛋白[5],它可以通過(guò)改變鐵離子的價(jià)態(tài)在呼吸鏈復(fù)合體之間傳遞電子,因此它是線(xiàn)粒體呼吸鏈的必要成分[5-6]. 人們發(fā)現(xiàn),在真菌、綠藻和動(dòng)物的線(xiàn)粒體中可以利用細(xì)胞色素c血紅素裂解酶(CCHL)將血紅素連接到脫輔基細(xì)胞色素c的半胱氨酸上,以完成細(xì)胞色素c的裝配[4-6]. 脫輔基細(xì)胞色素巰基和血紅素的還原狀態(tài)對(duì)于細(xì)胞色素c的裝配至關(guān)重要[6],控制血紅素與脫輔基細(xì)胞色素c連接的氧化還原因素在細(xì)菌和質(zhì)體中是已知的[1,5-6],而在芽殖酵母中,CYC2被認(rèn)為是細(xì)胞色素c的裝配因子,在c型細(xì)胞色素的成熟中具有氧化還原功能,在細(xì)胞色素c的組裝過(guò)程中發(fā)揮重要作用,對(duì)線(xiàn)粒體功能的發(fā)揮具有重要意義[7-11].

芽殖酵母的CYC2含有一個(gè)FAD結(jié)構(gòu)域,定位于線(xiàn)粒體內(nèi)膜[7],敲除該基因會(huì)使得脫輔基細(xì)胞色素c的線(xiàn)粒體輸入部分缺失從而使細(xì)胞色素c的表達(dá)水平降低約20%,導(dǎo)致線(xiàn)粒體功能缺陷[8-9,11-12]. 通過(guò)同源比對(duì)發(fā)現(xiàn)裂殖酵母Cyc2與芽殖酵母的CYC2相似性達(dá)到26.78%,目前為止,還尚未有關(guān)于Cyc2的研究. 因此本文旨在揭示粟酒裂殖酵母中Cyc2的定位及相關(guān)功能,為線(xiàn)粒體蛋白功能的研究提供一定的理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種與質(zhì)粒

實(shí)驗(yàn)所用菌種：粟酒裂殖酵母單倍體菌yHL6381、大腸桿菌DH5α;所用質(zhì)粒:pFA6a-hphMX、pJK148-myc-hphMX和pYJ19.

1.1.2 培養(yǎng)基

YES培養(yǎng)基(100 mL):酵母粉0.5 g,葡萄糖3 g,腺嘌呤、組氨酸、尿嘧啶、亮氨酸為22.5 mg;YES+6%、3%甘油: 培養(yǎng)基的碳源為不同濃度的甘油.

1.2 方法

1.2.1 生物信息學(xué)分析

蛋白序列比對(duì)分析使用AlignX;利用在線(xiàn)預(yù)測(cè)網(wǎng)站(http://ihg.gsf.de/ihg/mitoprot.html)分析蛋白是否有線(xiàn)粒體定位序列;利用在線(xiàn)預(yù)測(cè)網(wǎng)站(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)分析蛋白是否有跨膜結(jié)構(gòu)域.

1.2.2 菌種構(gòu)建

擴(kuò)增得到cyc2的上、下游同源臂后,將其構(gòu)建到pFa6a-hphMX質(zhì)粒上,然后將cyc2(up)-hph-cyc2(dw)片段轉(zhuǎn)化到y(tǒng)HL6381菌株內(nèi)得到Δcyc2菌株;擴(kuò)增cyc2基因片段,構(gòu)建到pYJ19質(zhì)粒上,使用NruI限制酶切割重組質(zhì)粒得到線(xiàn)性片段并轉(zhuǎn)入菌株Δcyc2中,得到Cyc2-GFP菌株. 將cyc2基因片段構(gòu)建到質(zhì)粒pJK148-myc-hphMX上得到重組質(zhì)粒pJK148-cyc2-myc-hphMX,使用NruI限制酶分別切割pJK148-myc-hphMX和pJK148-cyc2-myc-hphMX得到線(xiàn)性片段并轉(zhuǎn)入Δcyc2中,得到空載回補(bǔ)菌株pJK148和全長(zhǎng)回補(bǔ)菌株cyc2;將cyc2-myc-hph片段轉(zhuǎn)入Tom20-Flag菌株中得到菌株Tom20-Flag/Cyc2-Myc.

1.2.3 表型實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)前3 d在YES固體培養(yǎng)基上將菌種劃線(xiàn)活化. 將菌種接種至YES培養(yǎng)基內(nèi),初始OD600 調(diào)至0.2左右,32 ℃培養(yǎng)12 h. 將菌液OD600 均調(diào)至3左右,按10倍梯度依次進(jìn)行稀釋. 取3 μL菌液在固體培養(yǎng)基上點(diǎn)圈,32 ℃倒置培養(yǎng).

1.2.4 Western blot檢測(cè)線(xiàn)粒體蛋白表達(dá)量

分別提取菌株Δcyc2和yHL6381的線(xiàn)粒體,取等量的線(xiàn)粒體進(jìn)行處理得到所需的蛋白樣品后進(jìn)行Western blot檢測(cè).

1.2.5 熒光顯微鏡觀察Cyc2定位

將Cyc2-GFP菌株在固體培養(yǎng)基上進(jìn)行劃線(xiàn)活化后. 將菌株接種于液體培養(yǎng)基內(nèi),培養(yǎng)12 h后轉(zhuǎn)接至新鮮培養(yǎng)基并調(diào)整OD600=0.2后繼續(xù)培養(yǎng),大約培養(yǎng)4 h后,菌液OD600約為0.6,收菌,用PBS緩沖液洗一次后,向菌體內(nèi)加入Mitotracker染料進(jìn)行染色,時(shí)間為2.5 min,然后使用熒光顯微鏡進(jìn)行觀察.

1.2.6 線(xiàn)粒體定位實(shí)驗(yàn)

選取細(xì)胞核蛋白Sla1和線(xiàn)粒體基質(zhì)蛋白Hsp60為對(duì)照,通過(guò)Western blot檢測(cè)菌株Tom20-Flag/Cyc2-Myc的線(xiàn)粒體蛋白樣品以確定Cyc2是否定位于線(xiàn)粒體;以線(xiàn)粒體外膜蛋白Tom20和Hsp60為對(duì)照,分別用TritonX-100和Proteinase K處理菌株Tom20-Flag/Cyc2-Myc的線(xiàn)粒體,以檢測(cè)Cyc2是否定位于線(xiàn)粒體外膜;使用堿性碳酸鈉處理Tom20-Flag/Cyc2-Myc的線(xiàn)粒體,以線(xiàn)粒體內(nèi)膜蛋白Cox1和Hsp60為對(duì)照,碳酸鈉破壞線(xiàn)粒體膜,通過(guò)高速離心使位于基質(zhì)和膜間隙的蛋白分布于上清中,而線(xiàn)粒體膜蛋白則會(huì)留在沉淀內(nèi),以檢測(cè)Cyc2是否為膜結(jié)合蛋白.

2 結(jié)果與討論

2.1 粟酒裂殖酵母Cyc2生物信息學(xué)分析結(jié)果

通過(guò)在GeneDB和NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)的搜索,得到裂殖酵母cyc2基因序列,其系統(tǒng)名為SPAC17H9.12c. 該蛋白由266個(gè)氨基酸殘基組成,預(yù)測(cè)的分子量約為29.37 kD. 通過(guò)序列比對(duì)可知芽殖酵母的CYC2和裂殖酵母的Cyc2相似性達(dá)26.78%,比對(duì)結(jié)果如圖1.

2.2 Δcyc2菌株的表型研究

2.2.1 菌種的構(gòu)建

(1)Δcyc2的構(gòu)建和驗(yàn)證

cyc2上、下游同源臂擴(kuò)增結(jié)果如圖2A所示;轉(zhuǎn)化子的酶切驗(yàn)證結(jié)果如圖2B,C所示. 將含有同源臂及潮霉素基因的片段導(dǎo)入yHL6381內(nèi),選取幾個(gè)轉(zhuǎn)化子進(jìn)行驗(yàn)證,在上游同源臂的上游設(shè)計(jì)引物記為P1,在潮霉素基因上設(shè)計(jì)一對(duì)引物記為P2和P3,在下游同源臂的下游設(shè)計(jì)一個(gè)引物記為P4,使用P1+P2進(jìn)行PCR,結(jié)果如圖2D所示,使用P3+P4進(jìn)行PCR,結(jié)果如圖2E所示,使用P1+P4進(jìn)行PCR,結(jié)果如圖2F所示,結(jié)果顯示菌株構(gòu)建成功.

(2)全長(zhǎng)回補(bǔ)菌株cyc2的構(gòu)建和驗(yàn)證

PCR得到cyc2基因片段(圖2G);重組質(zhì)粒酶切驗(yàn)證(圖2H);得到片段cyc2-myc-hph-LEU(圖2I)導(dǎo)入Δcyc2內(nèi),挑選正確轉(zhuǎn)化子進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn).

2.2.2 點(diǎn)圈結(jié)果

為了探究Cyc2的功能,分別構(gòu)建了Δcyc2、pJK148及cyc2菌株并在YES和甘油培養(yǎng)基上進(jìn)行點(diǎn)圈,結(jié)果如圖3所示. 在甘油培養(yǎng)基上,Δcyc2和pJK148菌株生長(zhǎng)減緩,而全基因回補(bǔ)菌株cyc2與野生型生長(zhǎng)情況相同. 這說(shuō)明cyc2基因的敲除會(huì)使得菌株的線(xiàn)粒體呼吸功能受損,這與芽殖酵母中的CYC2的表型不一致,暗示該基因在兩種酵母中的功能可能不一樣.

2.3 Cyc2對(duì)線(xiàn)粒體呼吸鏈蛋白的影響

線(xiàn)粒體的呼吸作用主要依賴(lài)于內(nèi)膜上的呼吸鏈及氧化磷酸化[1,3,13-16]. 上述實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證明Cyc2缺失后會(huì)影響線(xiàn)粒體的呼吸功能,為了探究Cyc2在線(xiàn)粒體中是如何行使功能的,分別檢測(cè)了Δcyc2菌株中由mtDNA編碼的呼吸鏈蛋白Cob1、Cox1、Cox2、Cox3和Atp6的表達(dá)量,以Hsp60作為內(nèi)參. 結(jié)果如圖4所示,與野生型菌株相比,Δcyc2菌株內(nèi)線(xiàn)粒體蛋白Cob1、Cox1、Cox2、Cox3和Atp6表達(dá)量沒(méi)有明顯變化,這說(shuō)明Cyc2的缺失不會(huì)影響呼吸鏈蛋白的表達(dá),猜測(cè)Cyc2可能通過(guò)其他途徑影響了線(xiàn)粒體功能.

2.4 Cyc2的定位研究

2.4.1 生物信息學(xué)分析

(1)Cyc2線(xiàn)粒體定位序列(MTS)的分析

借助在線(xiàn)工具M(jìn)itoProt II對(duì)Cyc2序列進(jìn)行分析,Cyc2定位于線(xiàn)粒體的概率為70.68%. 根據(jù)預(yù)測(cè)結(jié)果(表1)可知,Cyc2蛋白N端的16aa殘基為線(xiàn)粒體信號(hào)肽,其中含有5 個(gè)堿性殘基.

(2)Cyc2跨膜結(jié)構(gòu)域的分析

借助在線(xiàn)預(yù)測(cè)網(wǎng)站對(duì)Cyc2的跨膜結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析,根據(jù)預(yù)測(cè)結(jié)果(表2及圖5)可知,Cyc2跨膜結(jié)構(gòu)域個(gè)數(shù)為0,N端為跨膜序列的可能性為47.911%,跨膜氨基酸個(gè)數(shù)預(yù)測(cè)為9.242 8,綜合結(jié)果可知,Cyc2沒(méi)有跨膜結(jié)構(gòu)域.

表2 Cyc2跨膜結(jié)構(gòu)域分析結(jié)果Table 2 Analysis results of transmembrane domain of Cyc2

表1 Cyc2線(xiàn)粒體定位序列(MTS)分析結(jié)果Table 1 Analysis results of mitochondrial localization sequence(MTS)of Cyc2

2.4.2 熒光顯微鏡觀察

通過(guò)給Cyc2蛋白加GFP標(biāo)簽來(lái)確定蛋白在細(xì)胞中的定位,Mitotracker染料可以將線(xiàn)粒體染成紅色,而GFP為綠色,若蛋白定位于線(xiàn)粒體,兩種顏色會(huì)重疊顯示為黃色. 結(jié)果如圖6所示,Cyc2定位于線(xiàn)粒體.

2.4.3 提取線(xiàn)粒體確定蛋白在細(xì)胞中的定位

熒光實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證明Cyc2定位于線(xiàn)粒體,為了進(jìn)一步驗(yàn)證這一結(jié)果,實(shí)驗(yàn)提取了菌株Tom20-Flag/Cyc2-Myc的線(xiàn)粒體,并保留全蛋白樣品T、線(xiàn)粒體蛋白樣品Mt以及除線(xiàn)粒體外其他組分蛋白PMS,選擇Sla1和Hsp60作為對(duì)照,結(jié)果如圖7所示,Cyc2確實(shí)定位于線(xiàn)粒體.

2.4.4 TritonX-100和蛋白酶K處理

已知Cyc2定位在線(xiàn)粒體,那么它具體定位于線(xiàn)粒體的哪一部分呢?為了進(jìn)一步確定Cyc2的定位,以Tom20和Hsp60為對(duì)照. 使用TritonX-100和Proteinase K處理菌株Tom20-Flag/Cyc2-Myc的線(xiàn)粒體,結(jié)果如圖8所示,Cyc2不是線(xiàn)粒體外膜蛋白,可能為線(xiàn)粒體基質(zhì)蛋白或者線(xiàn)粒體內(nèi)膜蛋白.

2.4.5 堿性碳酸鈉處理線(xiàn)粒體

上述實(shí)驗(yàn)證明Cyc2定位于線(xiàn)粒體基質(zhì)或內(nèi)膜,為進(jìn)一步確定其定位,使用NaCO3處理菌株Tom20-Flag/Cyc2-Myc的線(xiàn)粒體后高速離心,以Cox2和Hsp60作為對(duì)照. 結(jié)果顯示(圖9),Cyc2主要分布在沉淀P組分中,上清S組分中只有少量,與內(nèi)膜蛋白Cox2相似. 因此Cyc2與線(xiàn)粒體內(nèi)膜結(jié)合,結(jié)合跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果可以確定Cyc2為線(xiàn)粒體內(nèi)膜的外在膜蛋白.

3 結(jié)論

酵母作為一種模式生物參與基礎(chǔ)生物學(xué)研究已經(jīng)有兩百多年的歷史. 其中以釀酒酵母和粟酒裂殖酵母研究最多. 粟酒裂殖酵母的全基因組測(cè)序工作已經(jīng)完成,它含有4 284個(gè)可以編碼蛋白質(zhì)的基因,培養(yǎng)簡(jiǎn)單快速,在研究基因功能方面具有很大的優(yōu)勢(shì). 同時(shí)從進(jìn)化角度來(lái)看,粟酒裂殖酵母與人的親緣關(guān)系較親近,所以研究粟酒裂殖酵母的蛋白功能對(duì)于人類(lèi)的發(fā)展具有重要意義.

芽殖酵母的CYC2蛋白在細(xì)胞色素c的組裝過(guò)程中發(fā)揮重要作用,缺失后會(huì)影響細(xì)胞色素c的成熟[6,12],從而影響呼吸鏈電子的傳遞,使線(xiàn)粒體無(wú)法正常發(fā)揮功能. 通過(guò)序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)粟酒裂殖酵母中的Cyc2蛋白與芽殖酵母的CYC2蛋白相似性達(dá)26.78%,且都具有FAD結(jié)構(gòu)域,粟酒裂殖酵母的呼吸作用依賴(lài)于線(xiàn)粒體內(nèi)膜上的呼吸鏈和氧化磷酸化,電子通過(guò)呼吸鏈上的蛋白復(fù)合體進(jìn)行傳遞并通過(guò)氧化磷酸化產(chǎn)生ATP,呼吸鏈的蛋白復(fù)合體由各種亞基構(gòu)成,如果有一個(gè)或幾個(gè)亞基無(wú)法正常表達(dá),將會(huì)引起線(xiàn)粒體呼吸功能紊亂.

本文利用同源重組的方法構(gòu)建Δcyc2菌株,表型研究發(fā)現(xiàn)Δcyc2菌株在以甘油為唯一碳源的培養(yǎng)基上培養(yǎng)時(shí)生長(zhǎng)受到抑制,這與已報(bào)道的CYC2的表型不同,暗示Cyc2蛋白缺失后會(huì)影響線(xiàn)粒體的呼吸功能. 研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)Cyc2蛋白的缺失并不會(huì)影響線(xiàn)粒體呼吸鏈蛋白亞基Cox1、Cox2、Cox3、Cob1和Atp6的表達(dá),說(shuō)明Δcyc2菌株并不是通過(guò)影響呼吸鏈組分來(lái)影響線(xiàn)粒體呼吸功能的. 為了解析Cyc2的功能,利用熒光觀察和生化方法并結(jié)合生物信息學(xué)分析來(lái)確定該蛋白在細(xì)胞中的詳細(xì)定位. 熒光觀察結(jié)果表明Cyc2定位于線(xiàn)粒體,隨后的生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)它定位于線(xiàn)粒體的內(nèi)膜,最后生物信息學(xué)分析結(jié)果表明它沒(méi)有跨膜區(qū)域,最終確定該蛋白定位于線(xiàn)粒體內(nèi)膜,且為外在膜蛋白. 研究認(rèn)為線(xiàn)粒體內(nèi)膜外周蛋白Cyc2對(duì)于粟酒裂殖酵母線(xiàn)粒體的呼吸是必不可少的,但是其具體的影響途徑需要后續(xù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究.