劉珂杭,宗西翠,張慧丹,完顏楊珂,陳玉清

(1.南京師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,生物化學(xué)與生物制品研究所,江蘇 南京 210023) (2.南京中醫(yī)藥大學(xué)翰林學(xué)院,醫(yī)學(xué)院西醫(yī)基礎(chǔ)教研室,江蘇 泰州 225300)

抗菌肽是廣泛存在于生物界的先天免疫小肽,具有抗細菌、抗真菌、抗病毒、抗炎、抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)等多種生物學(xué)功能[1-3]. Bovine lactoferricin(LfcinB)是一種陽離子抗菌肽,它是牛乳中的乳鐵蛋白在酸性條件下經(jīng)胃蛋白酶水解后,從N端釋放的由25個氨基酸殘基組成的生物活性多肽[4]. LfcinB的氨基酸序列為FKCRRWQWRMKKLGAPSITCVRRAF,結(jié)構(gòu)中的2個半胱氨酸通過形成分子內(nèi)二硫鍵使LfcinB呈現(xiàn)不完全的桶狀結(jié)構(gòu). 研究發(fā)現(xiàn)二硫鍵在LfcinB生物活性中的作用不大,被破壞后抗菌活性并不減弱[5].

LfcinB具有多種生物學(xué)功能. 不同細菌對LfcinB的敏感性有所不同;LfcinB濃度在0.1 μg/mL時,對敏感細菌的生長就有明顯的抑制作用[4]. LfcinB和某些抗生素之間存在協(xié)同作用,鹽酸二甲胺四環(huán)素和LfcinB聯(lián)合使用能夠顯著提高對抗生素敏感的耐藥金黃色葡萄球菌的抑菌作用[6]. 另外,Yan等發(fā)現(xiàn)LfcinB對人類關(guān)節(jié)軟骨和滑膜產(chǎn)生有效的抗分解代謝和抗炎作用[7]. Mader等研究發(fā)現(xiàn)LfcinB對人類白血病細胞有細胞毒性,但對正常人類淋巴細胞、成纖維細胞或內(nèi)皮細胞沒有任何不良影響,LfcinB可以通過誘導(dǎo)活性氧的產(chǎn)生誘導(dǎo)線粒體依賴的凋亡途徑殺死癌細胞[8].

抗菌肽分子量小、分子中含有堿性氨基酸使得對一些蛋白酶敏感,并且也存在表達產(chǎn)物對宿主細胞的潛在毒性. 因此,為避免抗菌肽對宿主細胞的潛在毒性,降低蛋白酶的水解作用以及方便純化和制備,通常采用大腸桿菌融合表達系統(tǒng)[9]. 目前已報道多種可成功用于抗菌肽的原核表達和純化的融合標(biāo)簽,包括GST、MBP、DAMP21、Trx等[10]. 泛素化相關(guān)小分子蛋白(SUMO)標(biāo)簽是一種已被用于大腸桿菌融合表達系統(tǒng),與SUMO融合可以增強目的蛋白的可溶性表達,切割SUMO標(biāo)簽的SUMO蛋白酶也具有高度的特異性和高效的切割效率,并且當(dāng)目標(biāo)蛋白直接融合到SUMO的C端時,SUMO蛋白酶裂解后不會在目標(biāo)蛋白的N端留下多余的氨基酸殘基[11]. 鑒于SUMO標(biāo)簽的促進融合蛋白的可溶性表達、保護融合的蛋白免受蛋白酶水解的作用、標(biāo)簽容易切除的優(yōu)點,近年來廣泛應(yīng)用于多種蛋白質(zhì)的融合表達. 抗菌肽分子量小,融合表達時通常產(chǎn)量很低,多基因串聯(lián)表達被認為是提高小分子肽表達產(chǎn)量的有效方法[12]. 因此,本研究首次嘗試以SUMO作為LfcinB融合標(biāo)簽,采取LfcinB基因串聯(lián)表達的策略,以期獲得較高得率且有生物學(xué)活性的LfcinB,為發(fā)展更有效的重組抗菌肽制備技術(shù)提供實驗依據(jù).

1 材料方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與試劑

大腸桿菌EscherichiacoliBL21(DE3)、DH5α和金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)購自中國菌種保藏中心;大鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤細胞株P(guān)C12由本實驗室保藏. 表達載體pSUMO為本實驗室保存;HindⅢ、XbaⅠ、BamHⅠ、BglⅡ以及Taq酶和DNA Marker、蛋白質(zhì)Marker、T4 DNA Ligase均購自TaKaRa生物公司;DNA膠純化試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒購自諾唯贊公司;Ni2+chelating Sepharose Fast Flow購自Pharmacia Biotech公司;鼠抗anti-6×His一抗,山羊抗鼠IgG(FITC)購自日本W(wǎng)ako公司;IPTG購自Promega公司. Annexin V-FITC/PI購自南京凱基生物公司.

1.2 方法

1.2.1 表達載體pSUMO-(LfcinB)n的構(gòu)建

根據(jù)抗菌肽LfcinB的核苷酸序列和載體pSUMO多克隆位點,設(shè)計合成pSUMO-F和pSUMO-R兩條引物. 兩引物中除了引入克隆位點(BamHⅠ和Hind Ⅲ)以外還引入了BamHⅠ的同尾酶BglⅡ以及羥氨的識別序列等位點. 引物序列如下(紅色字體表示BamHⅠ酶切位點,藍色字體表示Hind Ⅲ酶切位點,黃色字體表示BglⅡ酶切位點,劃線部分為羥胺切割位點):

pSUMO-F:5′ CGGGATCCAACGGCTTTAAATGCCGCCGCTGGCAGTGGC 3′,

該電子版多媒體雜志雖與傳統(tǒng)紙質(zhì)期刊一樣具有中國標(biāo)準(zhǔn)連續(xù)出版物號，即ISSN號和CN號，但由于載體不同，電子版多媒體雜志屬于“連續(xù)型電子期刊”，所以，在期刊查詢時，依次進入“辦事服務(wù)”→“便民查詢”→“新聞出版機構(gòu)查詢”→“連續(xù)型電子期刊”中輸入一項或多項期刊對應(yīng)信息可以檢索到中國醫(yī)藥科技出版社電子版系列雜志。

pSUMO-R:5′ CCAAGCTTAGATCTGCCGTTGCCACTGCCAGCGGCGGCATTTAAA 3′.

以實驗室構(gòu)建的載體pET32a-LfcinB為模板合成含有LfcinB的核苷酸序列,BamHⅠ和Hind Ⅲ雙酶切pSUMO質(zhì)粒和LfcinB基因的PCR產(chǎn)物,經(jīng)T4 DNA ligase連接后轉(zhuǎn)化至E.coliDH5α. 轉(zhuǎn)化液涂布到氨芐抗性的LB平板上,37 ℃倒置培養(yǎng),待長出單菌落. 提取單菌落中的質(zhì)粒進行測序,獲得正確的重組質(zhì)粒pSUMO-LfcinB.

1.2.2 表達載體pSUMO-(LfcinB)2和表達載體pSUMO-(LfcinB)3的構(gòu)建

用BamHⅠ和XbaⅠ以及BglⅡ和XbaⅠ分別雙酶切質(zhì)粒pSUMO-LfcinB,純化后回收酶切片段,16 ℃下用 T4 DNA Ligase連接上述雙酶切的載體和片段,連接液轉(zhuǎn)化至E.coliDH5α,涂布于含有50 μg/mL卡那霉素的LB平板上,37 ℃,12 h～16 h進行倒置培養(yǎng)待其長出單菌落. 提取單菌落的質(zhì)粒,獲得pSUMO-(LfcinB)2并測序鑒定. 進一步將得到的pSUMO-(LfcinB)2用BamHⅠ和XbaⅠ以及BglⅡ和XbaⅠ分別雙酶切,回收雙酶切產(chǎn)物后經(jīng)T4 DNA Ligase連接過夜,轉(zhuǎn)化至E.coliDH5α. 涂布固體LB平板上(50 μg/mL 卡那霉素)于37 ℃倒置培養(yǎng)12 h～16 h,挑選陽性克隆提取質(zhì)粒,獲得pSUMO-(LfcinB)3,測序鑒定.

1.2.3 表達宿主菌的構(gòu)建

將以上序列鑒定正確的pSUMO-LfcinB、pSUMO-(LfcinB)2、pSUMO-(LfcinB)3質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化至宿主菌E.coliBL21(DE3),涂布固體LB平板上(50 μg/mL卡那霉素),于37 ℃倒置培養(yǎng)12 h～16 h,挑選單個克隆培養(yǎng),提取質(zhì)粒進行測序鑒定,獲得重組表達菌E.coliBL21-pSUMO-(LfcinB)1、E.coliBL21-pSUMO-(LfcinB)2和E.coliBL21-pSUMO-(LfcinB)3.

1.2.4 SUMO-(LfcinB)n重組蛋白的誘導(dǎo)表達與純化

重組蛋白質(zhì)量的計算方法:使用考馬斯亮藍試劑盒測定各個拷貝菌株中上清蛋白的濃度,并利用Bandscan 5.0軟件對凝膠圖片中的電泳條帶進行光密度分析,計算重組蛋白質(zhì)量.

1.2.5 LfcinB的純化

每50 μg SUMO-(LfcinB)n融合蛋白加入1 U SUMO酶,30 ℃反應(yīng)30 min. 再用1M羥氨切割2 h,切割產(chǎn)物用PBS緩沖液透析去除羥氨,再通過Ni2+-IDA-Sepharose CL-6B層析分離純化,收集穿透峰對應(yīng)流出液,用PBS緩沖液進行透析. 最后將樣品上樣于半制備分離柱Bechman C18,在 Agilent HPLC 1100層析儀上進行反相分離,用含0.1%的三氟乙酸的15%～75%乙腈進行梯度洗脫,收集洗脫峰樣品,透析后冷凍干燥保存. 保存的凍干樣品取少量溶解測濃度,并計算回收率.

重組蛋白純化回收率(%)=回收重組蛋白的質(zhì)量/切割融合蛋白質(zhì)量×100%.

1.2.6 Tricine-SDS-PAGE電泳

凍干樣品溶于無菌水后考馬斯亮藍試劑盒測定濃度,然后取樣品進行Tricine-SDS-PAGE,濃縮膠濃度 4%,夾層膠濃度 10%,分離膠濃度16.5%,按常規(guī)方法進行.

1.2.7 抗細菌活性的測定

采用瓊脂糖孔穴擴散法測定重組LfcinB對金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)的抗菌活性. 對數(shù)生長期細菌按1%加入瓊脂糖 LB 培養(yǎng),凝固后用滅菌槍頭打孔,在孔中加入待測樣品液,于37 ℃ 倒置培養(yǎng)過夜,觀察抑菌活性.

1.2.8 抗腫瘤毒性檢測

1×106/mL鼠嗜鉻細胞瘤PC12細胞1 mL培養(yǎng)于6孔板,分別用不同濃度重組LfcinB肽孵育16 h;收集細胞加入凋亡檢測染色液 Annexin V-FITC和PI,室溫避光反應(yīng)15 min,分別進行熒光顯微鏡觀察和流式細胞儀檢測,激發(fā)波長Ex=488 nm;發(fā)射波長Em=530 nm.

1.2.9 統(tǒng)計分析

使用Origin 8軟件進行統(tǒng)計,獲得至少3次獨立實驗的所有數(shù)據(jù)并表示為(平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差)(S.D.). 使用單因素方差分析(ANOVA)分析數(shù)據(jù)以確定不同組之間的顯著差異.P<0.05被認為具有統(tǒng)計學(xué)意義.

2 結(jié)果與討論

2.1 pSUMO-(LfcinB)n表達質(zhì)粒的構(gòu)建

為提高抗菌肽的表達產(chǎn)量,通常采用串聯(lián)多聚體形式來代替單體形式進行抗菌肽的融合表達[9,13]. pSUMO是本實驗室前期構(gòu)建的一個帶有SUMO標(biāo)簽的原核表達質(zhì)粒,具有BamHⅠ、XbaⅠ、BglⅡ等多克隆酶切位點. 將擴增得到的LfcinB基因片段和pSUMO經(jīng)BamHⅠ和Hind Ⅲ雙酶切后連接獲得pSUMO-LfcinB. 將得到的質(zhì)粒pSUMO-LfcinB利用同尾酶技術(shù),對pSUMO-LfcinB分別用BamHⅠ和XbaⅠ以及BglⅡ和XbaⅠ兩個雙酶切體系進行切割,然后對兩個體系分別回收大、小片段,用T4 DNA Ligase連接大小片段后即可得到雙拷貝表達載體pSUMO-(LfcinB)2. 用同尾酶技術(shù)進一步對pSUMO-(LfcinB)2進行切割和連接,得到3個串聯(lián)拷貝數(shù)的重組質(zhì)粒pSUMO-(LfcinB)3. 構(gòu)建的大體流程如圖1所示. 同尾酶是指具切割不同的DNA片段但產(chǎn)生相同的粘性末端的一類限制性內(nèi)切酶,利用同尾酶技術(shù)可以構(gòu)建多拷貝串聯(lián)基因重組質(zhì)粒[14]. 本研究中利用同尾酶BamHⅠ和BglⅡ酶切連接后形成新序列GGATCT,并結(jié)合非同尾酶XhoⅠ使得LfcinB基因片段能夠定向連續(xù)插入載體,成功構(gòu)建出pSUMO-(LfcinB)n(n=2,3),經(jīng)測定序列構(gòu)建正確.

2.2 SUMO-(LfcinB)n重組蛋白的表達

pSUMO-(LfcinB)n轉(zhuǎn)化至宿主大腸桿菌E.coliBL21(DE3)細胞,得到重組菌株E.coliBL21/pSUMO-(LfcinB)n(n=1,2,3). 重組菌株加入IPTG誘導(dǎo)不同時間,測定SUMO-(LfcinB)n表達產(chǎn)物對宿主細胞的毒性,結(jié)果如圖2a所示. 各重組菌株的生長速度比較如下:E.coli/pSUMO-(LfcinB)3

由于抗菌肽自身的抗菌性,通常采用融合表達策略以降低潛在的宿主細胞毒性. 然而,并非所有的融合標(biāo)簽都能有效避免宿主細胞毒性,例如GST標(biāo)簽并不能有效避免宿主細胞毒性[15]. 本研究發(fā)現(xiàn)SUMO標(biāo)簽融合能在一定程度上避免(LfcinB)n宿主細胞毒性,并且影響的程度與串聯(lián)拷貝數(shù)有關(guān). SUMO-(LfcinB)3表達的宿主細胞毒性最大,SUMO-(LfcinB)2表達的宿主毒性最低,推測原因可能在于不同拷貝數(shù)串聯(lián)(LfcinB)n與SUMO在空間上的相互影響不同,SUMO能較好屏蔽(LfcinB)2,因此僅產(chǎn)生較弱的宿主細胞毒性. SUMO標(biāo)簽已廣泛用于抗菌肽的E.coli表達而避免了宿主細胞毒性,例如Cecropin A-LL37和Plectasin等抗菌肽[16-17]. 有研究認為,SUMO標(biāo)簽?zāi)芡ㄟ^周圍親水和中心疏水核心結(jié)構(gòu)顯著提高融合抗菌肽的可溶性表達[18]. SUMO標(biāo)簽?zāi)苡行椭鞍踪|(zhì)折疊,顯著提高包括抗菌肽在內(nèi)的多種蛋白的可溶性表達[19-20]. 本研究也發(fā)現(xiàn),即使是2個LfcinB的串聯(lián)抗菌肽,SUMO標(biāo)簽也能實現(xiàn)90%的可溶性表達.

2.3 SUMO-(LfcinB)n和LfcinB的蛋白純化

E.coli/pSUMO-(LfcinB)n經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達重組蛋白,將超聲波破碎細胞的細胞上清液進行Ni2+-NTA親和層析,收集蛋白質(zhì)峰對應(yīng)樣品,SDS-PAGE電泳分析如圖3所示. 在SUMO-(LfcinB)n對應(yīng)分子量處均有一條明顯而單一的條帶. 因為SUMO的N端有6×His-tag,經(jīng)His抗體的Western blotting分析進一步證實純化產(chǎn)物為SUMO-(LfcinB)n融合蛋白. 在1 L的培養(yǎng)體系中,純化得到的SUMO-LfcinB、SUMO-(LfcinB)2和SUMO-(LfcinB)3的產(chǎn)量分別為69.1 mg、150 mg和57 mg. 用SUMO標(biāo)簽融合表達設(shè)計時通常在SUMO的N端添加(His)6-tag,以便于親和純化和檢測[21-22]. 本研究用(His)6-tag高效純化出SUMO-(LfcinB)n,以用于后續(xù)進一步的切割與純化. 盡管多聚體串聯(lián)表達時隨著肽與載體的質(zhì)量比的增加,可能提高肽的產(chǎn)量和穩(wěn)定性. 本研究卻發(fā)現(xiàn),2個LfcinB串聯(lián)表達得到的產(chǎn)量高于單拷貝LfcinB和3拷貝 LfcinB 串聯(lián)表達的產(chǎn)量,可見SUMO融合蛋白的表達量與串聯(lián)拷貝數(shù)間并無線性正相關(guān). 有報道通過重疊延伸PCR(SOE-PCR)將蟹MT基因的2個和3個拷貝的串聯(lián)重復(fù)序列整合在一起,采用SUMO融合表達系統(tǒng)在大腸桿菌中表達,增加了重組MT蛋白的穩(wěn)定性和溶解性,并且顯著增強了Cu,Cd或Zn的耐受性和生物積累[23]. 因此,串聯(lián)表達是提高產(chǎn)量的有效方式. 然而,對于不同的分子,串聯(lián)數(shù)并非越多越好,最佳串聯(lián)數(shù)取決于融合標(biāo)簽和串聯(lián)肽的相互影響.

經(jīng)親和層析純化得到的SUMO-(LfcinB)n融合蛋白用SUMO酶在30 ℃酶切30 min,以釋放抗菌肽(LfcinB)n. Tricine-SDS-PAGE測定SUMO酶的酶切作用,結(jié)果如圖4所示. 可見SUMO酶能高效切割 SUMO-(LfcinB)n融合蛋白,釋放(LfcinB)n. 將SUMO-(LfcinB)2的SUMO酶切反應(yīng)體系用Ni2+-NTA進行第二次親和純化,收集不能被Ni2+-NTA吸附的穿透峰樣品,再用羥氨切割釋放LfcinB,透析處理去除羥胺等小分子成分得到純化的樣品,經(jīng)電泳檢測為分子量約3.4 kDa的重組LfcinB,且在1 L的培養(yǎng)基中能得到約15 mg的重組LfcinB. SUMO酶是一種識別SUMO空間結(jié)構(gòu)并切除SUMO的特異性酶,無需添加任何酶切位點,因此切割產(chǎn)物中無額外的氨基酸序列[24]. SUMO酶獨特的切割方式對表達小分子多肽非常有利,因為額外的氨基酸序列對小肽的功能影響可能比大分子蛋白更為顯著. 大量的研究顯示,SUMO酶切割釋放的抗菌肽具有很好的生物學(xué)活性[9],進一步顯示SUMO融合表達系統(tǒng)在抗菌肽基因工程領(lǐng)域的優(yōu)勢.

2.4 檢測重組LfcinB的抗菌活性

已有研究表明,天然LfcinB對金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)具有抗菌作用[4]. 本研究對純化得到的重組LfcinB進行抗Staphylococcusaureus活性鑒定,結(jié)果如圖5 所示. 瓊脂糖孔穴擴散法檢測結(jié)果顯示,15 μmol/L 的重組LfcinB處理觀察到抑菌圈,25 μmol/L重組LfcinB處理的抑菌圈更為明顯,表明重組LfcinB具有對Staphylococcusaureus的抗菌活性. 已有多個研究報道,SUMO標(biāo)簽可溶性表達獲得的重組抗菌肽具有較好的抗菌活性[22,25]. 本研究采用SUMO融合2個拷貝的LfcinB串聯(lián)表達,經(jīng)SUMO酶和羥胺切割后得到了具有抗菌活性的重組LfcinB,表明SUMO融合與串聯(lián)表達相結(jié)合的策略,可以得到具有生物學(xué)活性的重組抗菌肽.

2.5 重組LfcinB對腫瘤細胞PC12作用的分析

天然LfcinB對多種惡性腫瘤細胞具有抗癌活性[26]. 本研究選用大鼠PC12嗜鉻細胞瘤細胞,評價重組LfcinB對PC12細胞的殺傷活性. 不同濃度的重組 LfcinB 對腫瘤細胞PC12 處理12 h后分別進行形態(tài)學(xué)觀察和流式細胞分析,結(jié)果如圖6所示. PBS對照組的PC12細胞形態(tài)完好,25 μmol/L重組LfcinB處理12 h的PC12細胞形態(tài)模糊;而當(dāng)濃度提高到50 μmol/L,PC12發(fā)生碎片化,表明大部分細胞死亡. Annexin V/PI染色結(jié)合流式細胞術(shù)進一步揭示重組 LfcinB 對腫瘤細胞PC12的殺傷作用. 25 μmol/L重組LfcinB誘導(dǎo)11.77 %的PC12細胞凋亡,50 μmol/L的重組LfcinB可以誘導(dǎo)27.68 %的PC12細胞凋亡和23.67 %的PC12細胞壞死. 可見重組LfcinB對PC12細胞具有殺傷活性,能夠誘導(dǎo)PC12細胞凋亡,高濃度的重組LfcinB還可以誘導(dǎo)PC12細胞壞死. 近年來越來越多的研究揭示LfcinB可以通過多種機制發(fā)揮對多種惡性腫瘤細胞的抗癌作用,LfcinB可以靶向V-H+-ATPase選擇性地殺傷高轉(zhuǎn)移性乳腺癌細胞和高轉(zhuǎn)移性前列腺癌細胞[27-28];LfcinB可以通過提高抑癌基因的表達、誘導(dǎo)凋亡、抑制血管生成等多種途徑發(fā)揮對結(jié)直腸癌的選擇性抗癌作用[29]. LfcinB對多種惡性腫瘤的選擇性殺傷作用顯示出其在抗癌領(lǐng)域的潛在應(yīng)用價值. 本研究利用大腸桿菌表達系統(tǒng)獲得具有抗癌活性的重組LfcinB,將推動LfcinB在抗癌領(lǐng)域的應(yīng)用.

3 結(jié)論

本研究首次將SUMO標(biāo)簽融合和串聯(lián)表達相結(jié)合,利用同尾酶技術(shù)成功構(gòu)建出重組質(zhì)粒pSUMO-(LfcinB)n(n=1,2,3). 通過在LfcinB串聯(lián)序列間設(shè)計羥氨切割位點,利用SUMO酶和羥氨成功從SUMO-(LfcinB)n融合蛋白釋放出重組LfcinB單體. 研究認為SUMO標(biāo)簽?zāi)茱@著促進SUMO-(LfcinB)n的可溶性表達,并能在一定程度上避免(LfcinB)n的宿主細胞毒性,其中2個拷貝基因串聯(lián)的宿主細胞毒性最低,產(chǎn)量最高. 獲得的重組LfcinB對金黃色葡萄球菌表現(xiàn)出一定的抑菌作用,對大鼠PC12嗜鉻細胞瘤細胞具有促凋亡和壞死效應(yīng). 2個拷貝的基因串聯(lián)對采用pSUMO-(LfcinB)n系統(tǒng)原核表達LfcinB優(yōu)于單拷貝和3拷貝串聯(lián). 多拷貝表達策略能在一定程度上提高目的蛋白的表達量,但不是絕對的,即表達量和拷貝數(shù)不成正比,其具體原因和機理有待于進一步探討和研究. 本研究首次將SUMO融合與串連表達策略用于抗菌肽LfcinB的大腸桿菌基因工程,為生產(chǎn)具有抗菌和抗癌活性的抗菌肽應(yīng)用于臨床提供了有效的方法.