張國秀,鄭晨晨,趙智輝

(南京師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,生物化學(xué)與生物制品研究所,江蘇省分子與醫(yī)學(xué)生物技術(shù)重點實驗室,江蘇 南京 210023)

2018年GLOBOCAN數(shù)據(jù)統(tǒng)計表明全球乳腺癌(Breast Cancer,BC)和結(jié)直腸癌(ColoRectal Cancer,CRC)的發(fā)病率及死亡率都位居前列[1]. 三大傳統(tǒng)療法治愈率低且存在嚴(yán)重毒副作用,免疫治療越來越受到重視,成為腫瘤治療史上的重大突破[2]. 在免疫治療中,腫瘤疫苗具有耐受性好、低毒性和易于注射等優(yōu)點而受到專門研究,但存在疫苗免疫原性低、腫瘤異質(zhì)性、腫瘤免疫逃避及抑制性腫瘤微環(huán)境等問題[3-5],使其尚未表現(xiàn)出顯著的臨床益處,這就亟需探索更有效的腫瘤疫苗制備方法.

目前,制備腫瘤疫苗的方法主要有以下幾種:反復(fù)凍融法獲取的腫瘤細(xì)胞全蛋白作為腫瘤疫苗;合成已經(jīng)明確的腫瘤抗原肽作為腫瘤疫苗;特定腫瘤抗原肽與特定激活性受體結(jié)合(如HER2與Fc的融合蛋白)[6]制備腫瘤疫苗;深度測序法鑒定腫瘤特異性新抗原(Tumor Specific neo-Antigen,TSnA)后進行抗原合成[7]制備腫瘤疫苗;將腫瘤抗原基因?qū)脒m當(dāng)?shù)募?xì)胞內(nèi),以表達該基因的腫瘤細(xì)胞作為腫瘤疫苗使用;以及負(fù)載腫瘤抗原的樹突狀細(xì)胞(Dendritic Cells,DCs)[8]作為腫瘤疫苗等等. 根據(jù)以上方法制備的腫瘤疫苗形式多樣,包括肽疫苗、DNA或RNA疫苗、DC疫苗和全細(xì)胞疫苗等,但是每種疫苗應(yīng)用時存在一定的弊端,比如肽疫苗需要合適的免疫佐劑,且具有HLA限制;DNA/RNA疫苗有毒副作用、裸露的DNA或者質(zhì)粒效果微弱、較難發(fā)現(xiàn)合適的載體;DC疫苗的制備成本高且DCs的分離、擴增、刺激成熟等過程仍具有技術(shù)挑戰(zhàn)[9];全細(xì)胞疫苗可能會引發(fā)自身免疫,并且難以監(jiān)測未知TAA產(chǎn)生的免疫應(yīng)答. 這些方法在臨床試驗中未能展現(xiàn)出良好的治療效果,可能的根本原因之一是尚無法做到將廣譜腫瘤抗原通過特定激活性吞噬受體途徑遞送給APCs.

目前,真正能誘發(fā)機體產(chǎn)生抗腫瘤免疫應(yīng)答的是TSnA,而TSnA的鑒定非常耗時耗財. 因此,經(jīng)濟快捷地制備覆蓋盡可能多TSnA的廣譜腫瘤抗原,并使其通過激活性內(nèi)吞受體遞送從而激活免疫系統(tǒng)是一個可行的策略.

本研究利用糖代謝摻入[10]和生物正交反應(yīng)[11],將腫瘤細(xì)胞表面唾液酸化腫瘤抗原與特定激活性吞噬受體的配體進行橋接,嘗試制備一種能夠有效激活機體體液免疫和細(xì)胞免疫的腫瘤疫苗.

1 材料與方法

1.1 主要試劑

四乙酰疊氮甘露糖胺(Tetraacetylated N-Azidoacetyl-D-Mannosainem,Ac4ManNAz)、Alexa Fluor 488 DIBO Alkyne、Click-iT DIBO-biotin和ProLong? Gold Antifade Reagent購自Thermo Fisher公司;唾液酸(N-Acetylneuraminic acid)購自Sigma公司;Anti-biotin,HRP-linked Antibody購自CST公司;IgG Fraction Monoclonal Mouse Anti-Biotin購自Jackson ImmunoResearch公司;BCA蛋白定量試劑盒、Protein G Beads和Protein G 磁珠購自Bioworld公司;無酶細(xì)胞消化液、D-PBS購自Gibco公司;蛋白酶抑制劑混合物購自Bimike公司;蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)購自Thermo公司;多聚甲醛購自上海凌峰化學(xué)試劑有限公司;無水乙醇購自廣東光華科技股份有限公司;RIPA Lysis Buffer、苯甲基磺酰氟(PMSF)由本實驗室配制.

細(xì)胞培養(yǎng)所使用的青霉素、鏈霉素、0.25%胰蛋白酶和RPMI 1640培養(yǎng)基購自WISENT公司;胎牛血清(Fetal Bovine Serum,FBS)購自康源公司.

1.2 主要儀器

D-37520臺式離心機、BB5060UV細(xì)胞培養(yǎng)箱、HEAL FORCE生物安全柜、ELx 808酶標(biāo)儀、SS-325高壓蒸汽滅菌鍋、DC1010恒溫水浴鍋、IX51倒置熒光顯微鏡、PB-20酸度計、SIM-F124雪花狀制冰機、PowerPac 200/HC/3000電泳儀、Guava EasyCyte Mini System流式細(xì)胞儀等.

1.3 細(xì)胞與細(xì)胞培養(yǎng)

小鼠4T1乳腺癌細(xì)胞和CT26.WT結(jié)直腸癌細(xì)胞(購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫)在37 ℃、5% CO2的條件下,用含10% FBS和抗生素(100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素)的RMPI 1640完全培養(yǎng)液培養(yǎng).

1.4 流式細(xì)胞術(shù)

收集對數(shù)生長期的4T1和CT26.WT細(xì)胞,計數(shù),鋪2×104細(xì)胞于96孔板培養(yǎng)24 h,共14孔. 吸去 7個孔上清后,不同濃度Ac4ManNAz培液(0、0.1、0.25、0.5、1、2、3)mmol/L繼續(xù)共培養(yǎng)24 h. 棄剩余7個孔上清,3 mmol/L Ac4ManNAz培液繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞指定時間(0、4、8、12、16、20、24)h. 用含1% FBS的 D-PBS 洗3次. 無酶消化液收集細(xì)胞,與含1% FBS、50 μmol/L Alexa Fluor 488 DIBO Alkyne的D-PBS混合,輕輕吹打混勻,室溫、避光孵育60 min. 用含1% FBS 的D-PBS洗4次. 用含4%多聚甲醛的D-PBS固定細(xì)胞 15 min. 用D-PBS洗細(xì)胞3次. 用0.5mL D-PBS重懸細(xì)胞. 流式細(xì)胞儀檢測.

1.5 免疫熒光技術(shù)

收集對數(shù)生長期的4T1和CT26.WT細(xì)胞,計數(shù),2×104細(xì)胞分別與2 mmol/L Ac4ManNAz和2 mmol/L Sia培液混勻,加入腔室培養(yǎng)室(各2個復(fù)孔),培養(yǎng)24 h. 用含1% FBS 的D-PBS洗3次. 50 μmol/L Alexa Fluor 488 DIBO Alkyne的D-PBS與細(xì)胞混合,室溫、避光孵育60 min. 用3% BSA的D-PBS洗3次. 用4%多聚甲醛固定細(xì)胞15 min,0.25% Triton? X-100的D-PBS打孔細(xì)胞,室溫15 min. 用含1% BSA的 D-PBS 洗3次. 室溫下干片(至無明顯液體),將培養(yǎng)玻片與腔體分離. 在培養(yǎng)細(xì)胞處滴加ProLong? Gold Antifade Reagent 1滴,使其覆蓋載玻片上的細(xì)胞;加蓋清潔的蓋玻片(片下不能有氣泡),室溫下水平擱置、避光干燥24 h,使封片劑固化. 熒光顯微鏡觀察、采集圖像.

1.6 生物正交反應(yīng)

2 mmol/L Ac4ManNAz培液于10 cm皿中培養(yǎng)4T1和CT26.WT細(xì)胞24 h. 用1×PBS清洗細(xì)胞2次. 1 mL冷RIPA裂解液(裂解液∶蛋白酶抑制劑∶PMSF=100∶1∶1)裂解細(xì)胞,晃動培養(yǎng)皿使裂解液覆蓋整個皿底,放置冰上30 min,每隔10 min晃動一次. 刮下細(xì)胞,將細(xì)胞裂解液吸至1.5 mL EP管. 4 ℃,12 500 rpm,離心10 min. 轉(zhuǎn)移上清至1.5 mL EP管,99 ℃加熱6 min,置于冰上10 min. 加入150 μL 2 mmol/L DIBO-Biotin 充分混勻,室溫孵育2 h. 孵育結(jié)束后,取適量樣品進行BCA蛋白定量和Western Blot分析.

1.7 冰乙醇沉淀蛋白

取100 μL 生物素化蛋白溶液于1.5 mL EP管,沿管壁分次、緩慢加入1 mL冰乙醇(v/v=1/10),邊加邊渦旋,-80 ℃靜置過夜.

1.8 免疫沉淀

取-80 ℃醇沉生物素化蛋白,4 ℃,12 500 rpm,離心10 min. 棄上清,用1 mL冰乙醇清洗蛋白沉淀 2次. 將EP管置于冰上,待殘留乙醇揮發(fā)干凈. 用50 μL～100 μL PBS溶解蛋白沉淀. 完全溶解后,取適量樣品進行BCA蛋白定量. 根據(jù)蛋白定量結(jié)果,取含200 μg生物素化蛋白溶液于1.5 mL EP管,加入10 μL 1.3 μg/μL anti-Biotin抗體,渦旋混勻. 4 ℃震蕩孵育過夜.

取100 μL Protein G Beads于0.5 mL EP管. 4 ℃,300 rpm,離心1 min. 棄上清,用500 μL 1×PBS清洗Protein G Bead 3次,每次需靜置5 min. Protein G Beads與上述抗原抗體孵育物充分混合,4 ℃震蕩孵育過夜. 4 ℃,300 rpm,離心1 min. 轉(zhuǎn)移上清至0.5 mL EP管. 用200 μL 1×PBS清洗Protein G Beads 3次,保留洗液. 用50 μL 1×Loading buffer重懸Protein G Beads,99 ℃,煮樣5 min. 4 ℃,12 500 rpm,離心1 min. 分別取上清、洗液和Protein G Beads樣品進行Western Blot分析.

1.9 生物素化抗原與anti-Biotin抗體最佳結(jié)合比例

4管200 μg醇沉生物素化蛋白(4T1和CT26.WT細(xì)胞)與不同量anti-Biotin抗體(1、2.5、5、10)μg混勻,4 ℃孵育過夜. 取200 μL磁珠G于0.5 mL EP管,4 ℃,4000 rpm,離心3 min. 棄上清,用500 μL 1×PBS清洗磁珠G 3次,每次需靜置5 min. 用200 μL 1×PBS重懸磁珠G,將其平分為4管,50 μL/管. 4 ℃,4 000 rpm,離心3 min. 棄上清,磁珠G與上述抗原抗體孵育物混勻,室溫孵育2 h. 4 ℃,4000 rpm,離心3 min,轉(zhuǎn)移上清至EP管. 用200 μL 1×PBS清洗磁珠G 3次,保留洗液. 用50 μL 1×Loading buffer重懸磁珠G,99 ℃,煮樣5 min. 4 ℃,12 500 rpm,1 min. 分別取上清、洗液和磁珠G樣品進行Western Blot分析.

1.10 腫瘤疫苗的制備

細(xì)胞傳代時用0.5 mmol/L Ac4ManNAz培液培養(yǎng)4T1和CT26.WT細(xì)胞24 h后,2 mmol/L Ac4ManNAz培液再培養(yǎng)細(xì)胞24 h. 收集細(xì)胞進行裂解獲得蛋白裂解液,加熱變性后進行生物正交反應(yīng). 用冰乙醇沉淀法除去蛋白溶液中未反應(yīng)的生物素. 用適量PBS復(fù)溶生物素化蛋白,并與適量anti-Biotin抗體混合,4 ℃震蕩孵育過夜.

1.11 統(tǒng)計學(xué)分析

實驗數(shù)據(jù)采用均值±標(biāo)準(zhǔn)差(Means±SD)表示,用One-way ANOVA或t檢驗來分析數(shù)據(jù)間的差異顯著性,圖由 GraphPad5.0 軟件完成. 實驗重復(fù)3次以上,P<0.05,則具有統(tǒng)計學(xué)顯著差異.

2 結(jié)果與討論

2.1 Ac4ManNAz代謝摻入到細(xì)胞的最佳摻入?yún)?shù)

流式細(xì)胞分析Ac4ManNAz代謝摻入條件參數(shù),結(jié)果如圖1所示. 從圖A和C可以看出,隨著Ac4ManNAz濃度的增加,4T1和CT26.WT細(xì)胞的平均熒光強度逐漸增強,兩者成正相關(guān). 從圖B和D可以看出,3 mmol/L Ac4ManNAz培養(yǎng)細(xì)胞不同時間,隨著培養(yǎng)時間的延長,4T1和CT26.WT細(xì)胞的平均熒光強度先增加后降低再增加,呈折線形變化,且相鄰培養(yǎng)濃度(時間)間具有顯著性差異(**P<0.01,***P<0.001). 通過對總熒強度的分析,選擇Ac4ManNAz最佳摻入濃度是2 mmol/L,最佳培養(yǎng)時間是24 h.

2.2 Ac4ManNAz通過糖代謝摻入到細(xì)胞

用免疫熒光技術(shù)直觀考察Ac4ManNAz代謝摻入情況,結(jié)果如圖2所示(A代表4T1細(xì)胞、B代表CT26.WT細(xì)胞),兩種細(xì)胞的Ac4ManNAz實驗組有熒光且非常強烈,而Sia對照組沒有熒光. 這表明Ac4ManNAz能通過細(xì)胞糖代謝途徑摻入到4T1和CT26.WT細(xì)胞表面含唾液酸的糖蛋白中,使糖蛋白帶上疊氮基團.

2.3 Biotin-DIBO使疊氮化蛋白生物素化

收集Ac4ManNAz和Sia代謝摻入的腫瘤細(xì)胞蛋白溶液,變性后與Biotin-DIBO進行生物正交反應(yīng),Western blot檢測疊氮化蛋白的生物素化情況,結(jié)果如圖3所示. 從圖A和B可以看出,Ac4ManNAz實驗組有目的條帶,且比Sia對照組條帶明顯,說明Biotin-DIBO能高效地使疊氮修飾的糖蛋白生物素化.

2.4 生物素化蛋白與anti-Biotin抗體交聯(lián)成免疫復(fù)合物

醇沉生物素化蛋白與anti-Biotin抗體混勻,4 ℃震蕩孵育過夜,Protein G Beads富集交聯(lián)復(fù)合物進行Western blot分析,結(jié)果如圖4所示. Protein G Beads樣品有生物素化蛋白條帶,而上清、一洗和二洗樣品中幾乎沒有目的條帶,從而證明生物素化蛋白能與anti-Biotin抗體交聯(lián)成免疫復(fù)合物,且是高效的.

2.5 生物素化蛋白與anti-Biotin抗體的最佳結(jié)合比例

100 μg醇沉生物素化蛋白與不同量的anti-Biotin抗體混合,4 ℃震蕩孵育過夜后,磁珠G負(fù)載交聯(lián)復(fù)合物進行Western blot分析,結(jié)果如圖5所示(A代表4T1細(xì)胞、B代表CT26.WT細(xì)胞). 從圖A和圖B可以看出,隨著anti-Biotin抗體量的增加,交聯(lián)復(fù)合物的量也增加,兩者成正相關(guān);但對于CT26.WT細(xì)胞,當(dāng)抗體量為2.5 μg和5 μg時,交聯(lián)復(fù)合物條帶幾乎一致,說明2.5 μg anti-Biotin抗體幾乎已達到飽和. 綜合考慮,4T1細(xì)胞的抗原抗體最佳孵育比例是20∶1,而CT26.WT細(xì)胞的孵育比例是25∶1.

2.6 腫瘤疫苗制備的檢測

蛋白免疫印跡及免疫沉淀技術(shù)對制備疫苗的各步驟進行檢測,確保疊氮糖的代謝摻入、生物正交反應(yīng)以及抗原抗體反應(yīng)等步驟的有序進行,保證疫苗組成成分的均一性及疫苗的有效性,結(jié)果如圖6所示(A代表4T1細(xì)胞、B代表CT26.WT細(xì)胞). 從圖A和B可以看出,用于免疫的腫瘤抗原都高度均一地進行了生物素化標(biāo)記,并能與Anti-Biotin抗體高效地交聯(lián)成免疫復(fù)合物.

3 結(jié)論

腫瘤是世界范圍內(nèi)導(dǎo)致死亡的常見疾病,諸如乳腺癌、結(jié)直腸癌等難治性腫瘤,三大傳統(tǒng)療法尚且無法顯著改善患者存活率,因此,治療重心轉(zhuǎn)向腫瘤免疫治療. 在過去的幾十年里,腫瘤疫苗一直被專門研究,并在腫瘤治療方面取得卓越成就. 迄今為止,用于治療BC和CRC的腫瘤疫苗雖能誘發(fā)機體產(chǎn)生免疫應(yīng)答,但是應(yīng)答持續(xù)時間短且強度弱. 目前,還未有FDA批準(zhǔn)的用于治療BC的疫苗[12],也沒有一種治療CRC的腫瘤疫苗在大型III期試驗中顯示出臨床益處[13-14].

本研究結(jié)果顯示,利用化學(xué)生物學(xué)方法,可將4T1和CT26.WT細(xì)胞廣譜腫瘤抗原與IgG1亞型Anti-Biotin抗體橋接成免疫復(fù)合物(疫苗),使廣譜抗原通過特定激活性吞噬受體(Fc Recetor,FcR)途徑遞送給APCs. 這種疫苗制備方法簡單、快速且經(jīng)濟. 理論上,疊氮化修飾封閉了腫瘤抗原上的唾液酸位點,避免了唾液酸化抗原介導(dǎo)的免疫耐受[15];多種抗原通過FcR被APCs攝取后,能通過下游激活性信號基序誘發(fā)機體產(chǎn)生激活性抗腫瘤免疫應(yīng)答,而非抑制性抗腫瘤免疫應(yīng)答[16-17],但是缺乏動物實驗對疫苗的有效性進行驗證. 因此,在后續(xù)研究中,擬進行細(xì)胞學(xué)實驗和動物實驗以評估疫苗的免疫效果. 在細(xì)胞水平上,分離、培養(yǎng)小鼠骨髓DCs,檢測腫瘤抗原對DCs 表面分子及細(xì)胞因子表達的影響,包括MHCⅠ、MHCⅡ、CD45、CD80、CD86、IFN-γ、IL12等;在動物水平上,以BALB/c小鼠為材料,建立預(yù)防性和治療性小鼠異位移植瘤模型,檢測小鼠腫瘤生長速率、存活率、外周血中不同類型淋巴細(xì)胞的數(shù)量如CD8+T、CD4+T、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞和特異性抗體. 在建立動物模型時采用鼠源性細(xì)胞系而非個性化人源腫瘤細(xì)胞,因此,在驗證鼠源腫瘤細(xì)胞抗原疫苗的有效性后,還需采用人源腫瘤細(xì)胞抗原對小鼠進行免疫以評估其有效性,且人源腫瘤細(xì)胞對人的抗原效果仍存在相應(yīng)的不確定性. 此外,免疫佐劑的選擇、免疫劑量和時序等問題也有待研究[18].

總之,本研究利用化學(xué)生物學(xué)方法將特定激活性吞噬受體的配體與廣譜腫瘤抗原橋接成免疫復(fù)合物,這只是實現(xiàn)相應(yīng)目標(biāo)的第一步,后續(xù)還需通過動物實驗來評估疫苗的療效,但也為臨床上乳腺癌、結(jié)直腸癌乃至其他癌癥的治療提供了借鑒和參考,為腫瘤免疫治療提供了新的方法和新的研究理論.