楊 勇 ，肖成磊 ，郭 兵 ，楊 庭 ，王永林 ，王新新 ，白 鶴

（1.天津大學(xué)化工學(xué)院，天津 300072； 2.中海油能源發(fā)展股份有限公司安全環(huán)保分公司，天津 300457；3.中海石油環(huán)保服務(wù)（天津）有限公司，天津 300457）

0 引言

含油污泥是由水油、水油乳狀液和懸浮固體組成的一種復(fù)雜的復(fù)合物，包含各種烷烴、芳香烴、NSO化合物等，屬于危險(xiǎn)固體廢物[1-2]，直接排放會(huì)嚴(yán)重破壞生態(tài)環(huán)境[3]。含油污泥從來(lái)源上看，可分為原油開(kāi)采、油田集輸過(guò)程及煉油廠污水處理產(chǎn)生的含油污泥[4-5]。含油污泥組成各異，通常含油率在10%~50%之間，含水率在40%~90%之間[6-9]。含油污泥含有大量老化原油蠟質(zhì)、瀝青質(zhì)、膠體、固體懸浮物、細(xì)菌、鹽類、酸性氣體、腐蝕產(chǎn)物等，還包括生產(chǎn)過(guò)程中投加的大量絮凝劑、緩蝕劑、阻垢劑、殺菌劑等水處理劑[10-11]。若不能有效處理，會(huì)對(duì)生態(tài)環(huán)境造成嚴(yán)重破壞。由于含油污泥黏度高、脫水難，處理起來(lái)相當(dāng)困難，給油田企業(yè)廢物處置帶來(lái)了沉重的負(fù)擔(dān)。

現(xiàn)有含油污泥的處理方式包括物理處理、化學(xué)處理和生物處理（生物修復(fù)）等[12－13]。相對(duì)于物理處理和化學(xué)處理，生物處理因具有成本低、效率高，不會(huì)造成土壤二次污染等特點(diǎn)而得到廣泛應(yīng)用[14-17]。富集后的降解菌可利用本土強(qiáng)化技術(shù)對(duì)污泥進(jìn)行生物降解[18-19]?，F(xiàn)有的研究一方面僅限于考察不同種類微生物去除石油烴污染物的機(jī)制，而未考察所培育的微生物的現(xiàn)場(chǎng)應(yīng)用效果，因而難于在油泥砂修復(fù)過(guò)程獲得應(yīng)用；同時(shí)，現(xiàn)有的研究規(guī)模大都停留實(shí)驗(yàn)室模擬階段，尚未見(jiàn)油泥砂修復(fù)的現(xiàn)場(chǎng)示范應(yīng)用或大規(guī)模應(yīng)用。因此，筆者根據(jù)油泥砂的特點(diǎn)，研究了現(xiàn)場(chǎng)應(yīng)用修復(fù)作用，對(duì)改善和恢復(fù)生態(tài)環(huán)境質(zhì)量具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑

蛋白胨、大豆蛋白胨（北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司）；磷酸氫二鉀、氯化鈉、瓊脂粉（北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司）；葡萄糖、氫氧化鈉、鹽酸（天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司）；草酸銨結(jié)晶、碘-碘化鉀、冰乙酸、氯化鈉、乙酸鈉（天津市北方天醫(yī)化學(xué)試劑廠）；無(wú)水乙醇（天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司）。

1.1.2 主要儀器與設(shè)備

PCR 儀（powercycle，德國(guó)耶拿分析儀器股份公司）；生化培養(yǎng)箱（LRH-150，上海一恒科學(xué)儀器有限公司）；高速離心機(jī)（H1650-W，湘儀動(dòng)力測(cè)試儀器有限公司）；電子天平（ME204，梅特勒-托利多集團(tuán)）；超凈臺(tái)（SW-CJ-2FD，蘇州凈化設(shè)備有限公司）；顯微鏡（E200，株式會(huì)社尼康）；紫外分光光度計(jì)（UV-1200，上海美普達(dá)儀器有限公司）；搖床（HNY-211B，天津市歐諾儀器儀表有限公司）； 立式壓力蒸汽滅菌器（MLS-3750，上海一恒科學(xué)儀器有限公司）；旋渦混合儀（XW-80A，海門市其林貝爾儀器制造有限公司）；恒溫冰箱（BCD-539WL，青島海爾股份有限公司）。

1.1.3 培養(yǎng)基

BH（1 L）：NH4NO31 g；NaCl 1 g；KH2PO41 g；K2HPO41 g；MgSO4·7H2O 0.2 g；CaCl20.02 g；FeCl3（或 FeSO4）0.05 g，（pH 值 =7.2）。

石油降解培養(yǎng)基： 向BH 培養(yǎng)基中加入1%的原油，即100 mL BH 培養(yǎng)液中加1 g 原油。

1.2 方法

1.2.1 菌株篩選與馴化

采集礦井周圍有明顯溢油的石油污染土壤，采樣點(diǎn)6 處，采集土樣約100 g，用封口袋封裝留存；以石油為單一碳源，250 mL 搖瓶在 30 ℃，220 r/min 馴化培養(yǎng)石油污染處采集樣品；馴化約1 周后，棄上清液加經(jīng)高溫滅菌的加1%原油的BH 培養(yǎng)基100 mL，繼續(xù)在 30 ℃，220 r/min 下 250 mL 搖瓶培養(yǎng)；重復(fù)2~3 次；取轉(zhuǎn)接后經(jīng)降解的菌液1 mL 于1.5 mL移液管中，以十倍稀釋法稀釋成10-5，10-6，10-7，10-8，10-9 待用； 將牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基放入水浴中加熱至融化，待冷卻至50 ℃左右，倒平板（每個(gè)皿約15 mL)，平置，待凝固；將經(jīng)滅菌的培養(yǎng)基熔化后趁熱倒入無(wú)菌平板中，待凝固后編號(hào)，然后用移液器吸取0.1 mL 菌液對(duì)應(yīng)接種在不同稀釋度編號(hào)的瓊脂平板上（每個(gè)編號(hào)設(shè)3 個(gè)重復(fù)）；平板劃線法得單一菌落；恒溫培養(yǎng)，并觀察菌株形態(tài)，留圖保存，每菌預(yù)存斜面及甘油管各2 支。

1.2.2 降解率的估測(cè)

取250 mL 錐形瓶，稱取原油重量為1 g。重復(fù)操作約 50 次。配置 BH 培養(yǎng)液約 5 L，分裝 100 mL 于 250 mL 錐形瓶，得到含油質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%的油瓶；取對(duì)數(shù)期單菌母液3 mL，9 000 轉(zhuǎn)離心5 min，倒掉上清液，洗滌2~3 次后，用 3 mL 雙蒸水懸浮，接種 1 mL 至 50 mL 石油降解培養(yǎng)基，做3 個(gè)平行；將搖瓶在37 ℃，220 r/min轉(zhuǎn)速下培養(yǎng)菌株7 d，待油瓶適度降解后，停止培養(yǎng)并取樣測(cè)試；用正己烷萃取菌株降油后的培養(yǎng)液，留上層清液，放置待揮發(fā)后測(cè)定殘余油的質(zhì)量（m，單位g）。降解率的估算：菌株的降解率 = （1-m）/1。

1.2.3 氣質(zhì)分析（GC-MS）

選用正己烷，將萃取液做適當(dāng)稀釋，稀釋倍數(shù)為1 000 倍的體積比，將1 μL 樣品注入進(jìn)樣口進(jìn)行氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用分析。氣質(zhì)方法：氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用分析儀（Agilent 6890），HP-5MS 毛細(xì)管柱（最大承受溫度：325 ℃，行程長(zhǎng)度：30.0 m，標(biāo)稱內(nèi)徑：250.0 μm，標(biāo)準(zhǔn)膜厚度：0.25 μm，初始流速：1.0 mL/min，額定初始?jí)毫Γ?2.61 kPa，平均流速：36 cm/s），利用氮?dú)庾鳛檩d氣，載氣的流速是35.0 mL/min。初始柱溫設(shè)置為50 ℃，保持0.5 min后以10 ℃/min 的速度加溫到310 ℃。

1.2.4 油泥砂生物修復(fù)無(wú)害化處理小試

綜合應(yīng)用單因素實(shí)驗(yàn)法和響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)法，確定優(yōu)化菌株的發(fā)酵條件和磁絮凝條件。將菌體懸液分別與硅藻土、鋸末、秸稈、花生殼和活性炭等5 種吸附材料按1 ∶10 的比例混合均勻，放置10 d 后，稀釋平板涂布法進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，考察吸附材料對(duì)石油烴降解菌的吸附能力。采用生物修復(fù)方法，物料組成見(jiàn)表1。

表1 油泥砂生物修復(fù)物料比例

按表1 的比例將洗脫后的油泥砂與秸稈、有機(jī)肥、石油烴降解菌劑進(jìn)行充分混合、堆制，調(diào)節(jié)含水量至30%。定時(shí)取樣分析，監(jiān)測(cè)其含油量等參數(shù)變化。為了進(jìn)一步檢驗(yàn)生物修復(fù)后的殘?jiān)臍埩舳拘?，開(kāi)展植物試驗(yàn)。選取生長(zhǎng)快速，易于栽培且環(huán)境友好的黑麥草和苜蓿作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象[20]，分別用處理前的含油泥砂、生物修復(fù)后的含油泥砂和健康土壤種植黑麥草和苜蓿2 種植物，觀察記錄植物生長(zhǎng)狀況。

1.2.5 油泥砂生物修復(fù)無(wú)害化處理中試

建立150 m3油泥砂生物修復(fù)示范工程，該工程建立3 個(gè)生物堆，每堆50 m3油泥砂。為了獲得理想的處理效果，建立堆肥大棚，控制堆肥過(guò)程的溫度和釋放的VOC。測(cè)定含油量等參數(shù)。DGGE 用于分析自然環(huán)境中微生物群落變化。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中樣品采用MOBIO 公司的土壤基因組試劑盒PowerSoilRDNA Isolation Kit 進(jìn)行基因組DNA 的提取，先用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，之后進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，引物采用富含GC夾子的 338F 與 518R，酶使用 TransFastRTaq DNA Polymerase，放于4 ℃保存?zhèn)溆?。分別配置體積比為0%和80%的變性母液儲(chǔ)存，調(diào)配相應(yīng)梯度濃度的凝膠，確定合適的變性劑范圍為30%~60%。灌膠，而后放入40 ℃烘箱中約30 min。150 V 電壓下，電泳7 h后取出膠塊，EB 染色30 min，使用Tanon-1600 凝膠成像儀進(jìn)行成像分析，使用Tanon Gis 軟件對(duì)DGGE圖譜進(jìn)行凝膠圖譜分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 石油烴降解菌分析結(jié)果

石油降解菌分析結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 石油降解菌分析結(jié)果

2.2 油泥砂生物修復(fù)無(wú)害化小試、中試處理結(jié)果

2.2.1 含油量、重金屬等指標(biāo)測(cè)定

油泥砂生物修復(fù)無(wú)害化小試處理后，含油烴含量顯著降低，見(jiàn)圖1。經(jīng)過(guò)12 個(gè)月的生物修復(fù)，含油質(zhì)量比降至3 000 mg/kg 以下，經(jīng)過(guò)24 個(gè)月的生物修復(fù)，含油質(zhì)量比降至2 000 mg/kg 以下。對(duì)含水率、pH值、砷、鎘、鉻、銅、鎳、鉛、鋅、汞等指標(biāo)進(jìn)行匯總，見(jiàn)表3。通過(guò)分析上述指標(biāo)發(fā)現(xiàn)：油泥砂生物修復(fù)后滿足GB/T 23485—2009《城鎮(zhèn)污水處理廠污泥處置-混合填埋泥質(zhì)》標(biāo)準(zhǔn)。

圖1 油泥砂生物修復(fù)無(wú)害化處理含油量變化小試

油泥砂生物修復(fù)無(wú)害化中試處理后，含油量顯著降低，見(jiàn)圖2。經(jīng)過(guò)130 d 的生物修復(fù)，含油質(zhì)量比降至 3 000 mg/kg 以下，對(duì)含水率、pH 值、砷、鎘、鉻、銅、鎳、鉛、鋅、汞等指標(biāo)進(jìn)行匯總，見(jiàn)表3。通過(guò)分析上述指標(biāo)發(fā)現(xiàn)： 油泥砂生物修復(fù)后滿足GB/T 23485—2009《城鎮(zhèn)污水處理廠污泥處置-混合填埋泥質(zhì)》標(biāo)準(zhǔn)。

圖2 油泥砂生物修復(fù)無(wú)害化處理的含油量變化中試

表3 油泥砂生物修復(fù)后各指標(biāo)測(cè)試結(jié)果

2.2.2 植物試驗(yàn)結(jié)果

黑麥草和苜蓿在處理前的含油泥砂上不能生長(zhǎng)，但是在生物修復(fù)后的含油泥砂上生長(zhǎng)旺盛。盡管部分指標(biāo)與健康土壤有一定差距，但是生物修復(fù)后的含油泥砂中的黑麥草的根長(zhǎng)和莖長(zhǎng)這2 項(xiàng)指標(biāo)明顯高于健康土壤，苜蓿的莖重和根長(zhǎng)這2 項(xiàng)指標(biāo)明顯高于健康土壤。這說(shuō)明生物修復(fù)后的含油泥砂毒性已大大降低，適合植物生長(zhǎng)。油泥砂生物修復(fù)后植物生長(zhǎng)情況見(jiàn)表4。

表4 油泥砂生物修復(fù)后植物生長(zhǎng)情況

2.2.3 微生物群落變化

油泥砂生物修復(fù)無(wú)害化后的微生物群落變化、條帶回收二次DGGE 電泳圖譜、菌落PCR 的結(jié)果見(jiàn)圖3。從測(cè)序結(jié)果可以看出，菌落的種類主要集中在Alcanivorax，Pseudomonas，Marinobacter3 個(gè)屬，這 3 個(gè)屬的微生物均對(duì)石油烴有較好的降解效果，是土壤和水體等環(huán)境中關(guān)鍵的石油降解菌。油泥砂生物修復(fù)過(guò)程中出現(xiàn)了這些菌，說(shuō)明修復(fù)過(guò)程中出現(xiàn)了大量的石油降解菌，進(jìn)一步印證了油泥砂的生物降解。

圖3 微生物群落變化、條帶回收二次DGGE 電泳圖譜和菌落PCR 結(jié)果

2.2.4 滲濾液分析

生物處理后油泥砂的最終處理有填埋和作為綠植土2 種方式。目前，填埋是主要的處理方式。滲濾液是目前影響填埋的關(guān)鍵因素，為探討填埋的可行性，對(duì)生物處理后油泥砂的滲濾液進(jìn)行分析。對(duì)生物處理后油泥砂進(jìn)行取樣，按USEPA Method 5030 進(jìn)行前處理, 根據(jù) US EPA Method 8260C 用 GC/MS 儀分析, 根據(jù)NIST 譜庫(kù)對(duì)檢測(cè)出的主要化合物進(jìn)行定性檢索，并以內(nèi)標(biāo)1,4-Dichlorobenzene-d4 為參考物進(jìn)行半定量。堆肥滲濾液GC/MS 分析圖譜見(jiàn)圖4。

圖4 堆肥滲濾液GC/MS 分析圖譜

分析并未發(fā)現(xiàn)支鏈烷烴、直鏈烷烴、多環(huán)芳烴等油泥砂中的典型組分，從側(cè)面印證了生物處理降解了油泥砂中的石油烴。堆肥滲濾液中僅發(fā)現(xiàn)了低濃度的二氯甲烷、三氯甲烷、溴二氯甲烷等物質(zhì)。油泥砂生物處理后的滲濾液中二氯甲烷質(zhì)量濃度僅為6.7 μg/L，遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于日本滲濾液排放控制標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定二氯甲烷的0.2 mg/L，滿足該項(xiàng)的規(guī)定。

3 結(jié)論

從含油泥砂中分離篩選2 株石油烴降解菌，研究菌株對(duì)含油泥砂的降解能力及生物修復(fù)效果。

（1）綜合應(yīng)用單因素實(shí)驗(yàn)法和響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)法，確定優(yōu)化了菌株W25 和W33 的發(fā)酵條件和磁絮凝條件。實(shí)驗(yàn)室小試結(jié)果表明：油泥砂生物修復(fù)無(wú)害化處理后，含油量顯著降低。經(jīng)過(guò)12 個(gè)月的生物修復(fù)，含油質(zhì)量比降至3 000 mg/kg 以下，經(jīng)過(guò)24 個(gè)月的生物修復(fù)，含油質(zhì)量比降至2 000 mg/kg 以下，含水率、pH值、砷、鎘、鉻、銅、鎳、鉛、鋅、汞等指標(biāo)均達(dá)到GB/T 23485—2009 《城鎮(zhèn)污水處理廠污泥處置-混合填埋泥質(zhì)》標(biāo)準(zhǔn)要求。

（2）通過(guò)植物試驗(yàn)檢驗(yàn)生物修復(fù)后殘?jiān)臍埩舳拘?。分別對(duì)生物修復(fù)前、生物修復(fù)后的含油泥砂和健康土壤種植黑麥草和苜蓿2 種植物，觀察記錄植物生長(zhǎng)狀況，結(jié)果表明：生物修復(fù)后的含油泥砂毒性已大大降低，適合植物生長(zhǎng)。

（3）為進(jìn)一步推進(jìn)油泥沙生物修復(fù)的工程化應(yīng)用，建立了150 m3油泥砂生物修復(fù)示范工程，經(jīng)過(guò)130 d 的生物修復(fù)，含油質(zhì)量比降至3 000 mg/kg 以下，含水率、pH 值、砷、鎘、鉻、銅、鎳、鉛、鋅、汞等指標(biāo)均達(dá)到GB/T 23485—2009 《城鎮(zhèn)污水處理廠污泥處置-混合填埋泥質(zhì)》標(biāo)準(zhǔn)要求，在修復(fù)過(guò)程中出現(xiàn)了大量的石油降解菌，進(jìn)一步印證了含油泥砂的生物降解。對(duì)生物處理后油泥砂的滲濾液分析表明：滲濾液中二氯甲烷質(zhì)量濃度僅為6.7 μg/L，遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于日本滲濾液排放控制標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定二氯甲烷0.2 mg/L，滿足該項(xiàng)的規(guī)定。