鄧俊杰 ABDUL MAJEED BALOCH 侯雪月 李嘉哲 茶新有 張榮沭

(東北林業(yè)大學(xué)園林學(xué)院，哈爾濱 150040)

近年來(lái)我國(guó)的土壤退化現(xiàn)象十分嚴(yán)重，相關(guān)部門及政策都要求降低化學(xué)農(nóng)藥和肥料的使用量，大力支持和鼓勵(lì)生物肥料的開(kāi)發(fā)和利用，其中就包括木霉菌(Trichodermaspp.)。木霉菌屬真菌門(Eumycota；Mycobionta)，半知菌亞門(Deuteromycotina)，絲孢綱(Hyphomycetes)，絲孢目(Hyphomycetales)，叢梗孢科(Moniliaceae)，木霉屬(Trichoderma)，是自由生活的真菌，常見(jiàn)于各種生態(tài)系統(tǒng)的土壤、腐爛的木材和葉凋落物等分解材料中[1]。木霉菌主要通過(guò)寄生作用對(duì)植物產(chǎn)生影響。木霉菌有很強(qiáng)的根部定植能力，在植物的根基部位能分泌一些抑制病原真菌的生長(zhǎng)或者為植物生長(zhǎng)提供養(yǎng)分的物質(zhì)[2]，還能通過(guò)調(diào)節(jié)植物體內(nèi)激素水平[3～4]、固定大氣中的氮[5]、提高植物對(duì)磷的吸收[6]以及通過(guò)產(chǎn)生鐵載體提高植物對(duì)礦物質(zhì)的吸收[7]，從而促進(jìn)植物的生長(zhǎng)。

月季(Rosachinensis‘Shi-Jie-Mei’)作為一種集觀賞、食用和藥用等多用途的木本花卉植物[8]，具有很高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，近年來(lái)其栽培面積逐年上升，運(yùn)用生態(tài)環(huán)保的肥料促進(jìn)其生長(zhǎng)和有效抑制其生長(zhǎng)過(guò)程中的病害發(fā)生是十分必要的。木霉在月季根部定植后，可以產(chǎn)生抗生素和植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，抑制或降解根際有害物質(zhì)、增加養(yǎng)分利用率，從而促進(jìn)月季生長(zhǎng)。筆者將盆栽月季根施哈茨木霉T6，并系統(tǒng)分析月季硬枝出芽率；枝條和葉片性狀；內(nèi)源激素水平和防御酶活性的變化，以期為月季繁殖提供新的方法，并為研制促進(jìn)月季生長(zhǎng)的生防木霉菌肥提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

木霉菌：從黑龍江省牡丹江火山巖臺(tái)地生長(zhǎng)的蒙古櫟根際土壤樣本中分離純化獲得寒地習(xí)居哈茨木霉T6(Trichodermaharzianum)菌株[9]，菌種由東北林業(yè)大學(xué)園林植物應(yīng)用實(shí)驗(yàn)室保存。

月季：月季硬枝條，購(gòu)于黑龍江省佳木斯市南崗苗木專業(yè)合作社。

1.2 木霉菌分生孢子培養(yǎng)方法

1.3 木霉菌施入方法

2017年2月末將越冬后約15 cm長(zhǎng)的月季硬枝條在溫室進(jìn)行盆土扦插培養(yǎng)，土壤為大田土∶細(xì)砂土=3∶1，處理組每盆土壤中拌入100 mL木霉分生孢子懸浮液，以未施用木霉的實(shí)驗(yàn)組為對(duì)照，每實(shí)驗(yàn)組5株苗，3個(gè)重復(fù)。在保持相對(duì)濕度高于80%條件下培養(yǎng)，從出芽開(kāi)始統(tǒng)計(jì)出芽數(shù)，每天統(tǒng)計(jì)1次，第25天統(tǒng)計(jì)后計(jì)算出芽率(出芽率=總出芽數(shù)量/硬枝數(shù)量)。

待硬枝條葉腋上發(fā)出嫩芽大于2 cm時(shí)(見(jiàn)圖1B)，連同莖段一起剪下埋入盆土中繼續(xù)保濕培養(yǎng)。5月15日將幼芽(見(jiàn)圖1C)移入東北林業(yè)大學(xué)園林學(xué)院苗圃進(jìn)行自然條件下盆栽培養(yǎng)，此時(shí)處理組不加木霉菌。為了觀察木霉菌對(duì)月季生長(zhǎng)的影響，暫未作剪枝處理。并于6月15日、7月15日和8月15日，處理組分別施入100 mL木霉分生孢子懸浮液，根據(jù)天氣情況進(jìn)行澆水和除草管理。

1.4 月季枝條數(shù)量和長(zhǎng)度測(cè)量方法

9月15日記錄每株月季苗的枝條數(shù)，并用卷尺測(cè)量枝條長(zhǎng)度。

1.5 月季莖和葉片生物量測(cè)量方法

摘取每株月季最高枝條頂端第3節(jié)間的葉片，稱重后置于液氮中速凍，帶回實(shí)驗(yàn)室，-80℃保存，用于酶活性和激素水平測(cè)定。在距土表面15 cm處，將月季苗所有枝條剪下，放入冰盒中帶回實(shí)驗(yàn)室。將采集的月季樣本的枝條和葉片分開(kāi)，用電子秤分別稱量，得出鮮重。再將枝條和葉片用烘干箱105℃殺青30 min，然后80℃烘干至恒重，再次稱量得出干重。

1.6 月季葉片防御酶活性檢測(cè)方法

酶液提取：取超低溫保存的月季葉片0.5 g，按照李合生的方法制備防御酶粗提液。參照李合生等[10]的氮藍(lán)四唑(NBT)法測(cè)定超氧化物歧化酶(SOD)的活性、愈創(chuàng)木酚法測(cè)定過(guò)氧化物酶(POD)的活性、紫外吸收法測(cè)定過(guò)氧化氫酶(CAT)的活性。

1.7 月季葉片內(nèi)源激素水平檢測(cè)方法

(1)內(nèi)源激素提取方法：根本Zhai T T等的方法[11]提取月季內(nèi)源激素。

(2)LC-MS條件：色譜條件：流速：1 mL·min-1；柱溫25℃；進(jìn)樣量10 μL；進(jìn)樣延遲5 min。流動(dòng)相由甲醇(A)和0.1%甲酸水溶液(B)組成，梯度洗脫條件參照文獻(xiàn)Zhang等[12～14]和Zhai等進(jìn)行。質(zhì)譜條件：采用API3000三重四極桿質(zhì)譜儀在負(fù)離子模式下進(jìn)行操作。電噴霧離子源(ESI)條件及CID-MS/MS參數(shù)優(yōu)化結(jié)果與文獻(xiàn)Zhang等和Zhai等相同(見(jiàn)表1)。用Analyst software(1.4版本)進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

1.8 數(shù)據(jù)處理方法

采用Microsoft office excel 2007軟件進(jìn)行繪制圖表，利用SPSS對(duì)不同處理間的差異顯著性進(jìn)行ANOVA分析，在P=0.05下比較差異性。

圖1 哈茨木霉對(duì)月季生長(zhǎng)的影響 A.月季發(fā)芽率；B.硬枝幼芽；C.月季幼苗；D.采樣前的生長(zhǎng)狀態(tài)；E.月季枝條數(shù)量和長(zhǎng)度Fig.1 Effect of T.harzianum T6 on rose growth A.Germination rate of rose; B.Hard branches budlet; C.Rose seedlings of CK and T group; D.Growth status before harvest; E.The number and length of rose branches

表1 用于激素檢測(cè)的質(zhì)譜參數(shù)

2 試驗(yàn)結(jié)果

2.1 哈茨木霉T6對(duì)月季苗生長(zhǎng)的影響

由圖1A～B可見(jiàn)：木霉菌處理有利于硬枝幼芽的發(fā)育，扦插的月季硬枝在第10天開(kāi)始出芽，處理組3個(gè)，對(duì)照組2個(gè)；統(tǒng)計(jì)到第25天時(shí)硬枝不再出芽。結(jié)果發(fā)現(xiàn)木霉菌處理的硬枝出芽快、數(shù)量多，是對(duì)照組出芽率的1.4倍(P<0.05)。并且，月季硬枝早期接種木霉菌有利于幼苗后期的生長(zhǎng)(見(jiàn)圖1C)。月季枝條長(zhǎng)度和數(shù)量測(cè)量結(jié)果表明，與對(duì)照組(CK)相比，處理組(T6)月季苗的平均長(zhǎng)度為71.7 cm，比CK組增加81.84%，生長(zhǎng)速度顯著提高(P<0.05)；此外，T6組月季苗平均新生枝條數(shù)為1.4條，比CK組增加7.69%，但差異不顯著(P>0.05)(見(jiàn)圖1D～E)。生物量測(cè)量的結(jié)果表明，與CK組相比，T6組月季苗枝條的平均鮮重為15.3 g，增加了41.67%(P<0.05)；平均干重為7.5 g，增加了33.93%(P<0.05)。T6組葉片的平均鮮重為18.0 g，增加了59.29%(P<0.05)；

1.3.3 加強(qiáng)田間管理 發(fā)病初期及時(shí)拔除病株，并在田外銷毀。施足有機(jī)肥，增施磷、鉀肥，提高植株自身的抗病性，減輕病害；栽培前期及時(shí)供水，澆水后及時(shí)松土，提高地溫，促進(jìn)發(fā)根；栽培中期注意通風(fēng)，防止徒長(zhǎng)，促花保果。

表2 哈茨木霉菌對(duì)月季苗生物量的影響

Table 2 Effects ofT.harzianumT6 on the biomass in branches and leaves of rose

鮮重Fresh weight(g)干重Dry weight(g)枝條Branch葉Leaf枝條Branch葉LeafCK10.8±1.4b11.3±2.1b5.6±0.6b5.5±0.9bT615.3±2.6a18.0±3.2a7.5±1.2a7.8±1.4a

平均干重為7.8 g，增加了41.82%(P<0.05)。說(shuō)明施用木霉菌能顯著提高月季苗枝條和葉片的生物量產(chǎn)量(見(jiàn)表2)。

2.2 哈茨木霉T6對(duì)月季苗防御酶活性的影響

分析結(jié)果表明，T6組SOD活性比CK組提高了24.44%(P<0.05)(見(jiàn)圖2A)；T6組葉片中POD活性比CK組提高了76.23%(P<0.05)(見(jiàn)圖2B)；T6組葉片中SOD活性比CK組提高了19.95%(P<0.05)(見(jiàn)圖2C)。因此，施用木霉菌能使月季苗葉片中SOD、POD和CAT的活性均顯著提升。

圖2 月季苗的防御性酶活性Fig.2 Defense enzyme activity of rose

圖3 月季葉片中激素水平Fig.3 Hormon levels in the leaves of rose

2.3 哈茨木霉T6對(duì)月季葉片內(nèi)源激素水平的影響

分析結(jié)果表明，T6組月季苗葉中IAA，GA3和ZT的水平均有增高。IAA水平提高最顯著，為220.0 ng·g-1FW，與CK相比增加了135.47%(P<0.05)(見(jiàn)圖3A)。GA3和ZT的激素水平分別為16.4 ng·g-1FW和0.9 ng·g-1FW，與CK組相比分別提高26.51%和45.24%(見(jiàn)圖3B～C)。T6組月季苗葉中ABA含量為2 709.1 ng·g-1FW，比CK組提高了78.08%(見(jiàn)圖3D)(P<0.05)。JA和SA的含量分別為465.1 ng·g-1FW和5 845.0 ng·g-1FW，分別比CK提高了44.64%和53.51%(見(jiàn)圖3E～F)(P<0.05)。說(shuō)明施用哈茨木霉T6能提高月季苗葉中激素的含量，從而促進(jìn)月季的生長(zhǎng)。

3 討論

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，哈茨木霉T6顯著提高了月季硬枝的發(fā)芽率，能夠使獲得的月季幼苗比未接種木霉菌的長(zhǎng)勢(shì)強(qiáng)壯。將獲得的月季苗從溫室移至自然條件下生長(zhǎng)4個(gè)月，發(fā)現(xiàn)木霉菌誘導(dǎo)能顯著提高月季幼苗的枝條長(zhǎng)度和枝條數(shù)目，并且對(duì)枝條和葉片的生物量的積累及葉片的保水能力也有促進(jìn)作用。其中月季葉片生物量受哈茨木霉影響最顯著，葉片鮮重與CK組相比增加了59.29%(P<0.05)。此外，處理組月季苗葉片中的防御酶活性也顯著提高，其中POD的活性增加最大，提升了76.23%，其次為SOD，最后為CAT。而且，處理組的月季葉片中內(nèi)源激素IAA、GA3、ZT、ABA、JA、SA的水平均有提高，其中IAA的水平比CK增加最顯著，提升了135.47%(P<0.05)。

木霉菌是一種能夠促進(jìn)植物生長(zhǎng)，誘導(dǎo)植物提高抗性，同時(shí)抑制病原菌生長(zhǎng)的環(huán)境友好型生防真菌，具有改良土壤和預(yù)防植物病害發(fā)生的作用[2～7]。近代植物病理學(xué)認(rèn)為，利用生物或理化因子處理植株后所產(chǎn)生的抗病性稱為誘導(dǎo)抗病性[15]，改變植物對(duì)病害的反應(yīng)產(chǎn)生局部或系統(tǒng)的抗性，能誘導(dǎo)植物產(chǎn)生抗性的物質(zhì)稱為激發(fā)子[16]。Bailey和Lumsden的研究[17]揭示了木霉菌的木聚糖酶或其他的激發(fā)子能夠誘導(dǎo)植物的抗病性，Elad[18]等利用哈茨木霉接種根部或葉子后，認(rèn)為木霉菌促進(jìn)植物生長(zhǎng)的重要機(jī)制之一是誘導(dǎo)植物產(chǎn)生系統(tǒng)抗性。Windham[19]在固定的悉生環(huán)境下，進(jìn)行了哈茨木霉和康寧木霉刺激植物生長(zhǎng)的實(shí)驗(yàn)，在玉米、馬鈴薯、煙草和紅蘿卜上均表現(xiàn)出了高發(fā)芽率、高出苗率及植物干重增加的結(jié)果。這與本研究的結(jié)果：哈茨木霉T6能提高月季硬枝發(fā)芽率、促進(jìn)月季生長(zhǎng)、提高月季對(duì)有機(jī)物質(zhì)的積累結(jié)果一致。

超氧化物歧化酶SOD是生物體內(nèi)重要的抗氧化酶，廣泛分布于各種生物體內(nèi)，如動(dòng)物、植物、微生物等[20]。SOD具有特殊的生理活性，是生物體內(nèi)清除自由基的首要物質(zhì)。SOD在生物體內(nèi)的水平高低意味著衰老與死亡的直觀指標(biāo)；它可對(duì)抗與阻斷因氧自由基對(duì)細(xì)胞造成的損害，并及時(shí)修復(fù)受損細(xì)胞，復(fù)原因自由基造成的對(duì)細(xì)胞的傷害。過(guò)氧化物酶POD具有氧濃度的調(diào)節(jié)作用，同時(shí)能使毒性物質(zhì)失活。過(guò)氧化氫酶CAT是一種重要的保護(hù)酶類，它能促使過(guò)氧化氫分解為分子氧和水，清除體內(nèi)的過(guò)氧化氫，從而使細(xì)胞免于遭受過(guò)氧化氫的毒害，是生物防御體系的關(guān)鍵酶之一。我們的研究結(jié)果表明木霉T6能提高月季苗中SOD、POD和CAT的活性，增強(qiáng)對(duì)自然條件下不良環(huán)境的抵抗能力，從而促進(jìn)月季的生長(zhǎng)。

激素在植物的生長(zhǎng)發(fā)育中起著重要的調(diào)控作用，它作為信號(hào)分子在時(shí)間和空間上調(diào)控植物發(fā)育的許多過(guò)程。IAA為促生長(zhǎng)類激素，對(duì)植物的生長(zhǎng)發(fā)育主要起促進(jìn)作用[21]。王進(jìn)等[22]在梨樹(shù)上的研究表明，IAA的含量多少與新梢抽發(fā)和快速生長(zhǎng)存在一定的相關(guān)性，本研究發(fā)現(xiàn)T6組月季葉片中IAA的水平較CK組顯著提高(P<0.05)，T6組較快的生長(zhǎng)量和較大的生物量可能與高水平的IAA相關(guān)?，F(xiàn)在多數(shù)研究表明GA有促進(jìn)破眠的作用。閆海霞等[23]發(fā)現(xiàn)，把低溫層積處理的月季種子置于100 mg·L-1GA3中浸蘸，可有效提高其萌發(fā)率。ZT可以促進(jìn)細(xì)胞分裂，抑制不定根和側(cè)根生長(zhǎng)，延緩葉片衰老，與植物抗逆性密切相關(guān)[24]。湯章城[25]認(rèn)為ZT可以降低根系對(duì)水分的透性，減少氣孔阻力，因此脅迫期間ZT含量的降低，減少了細(xì)胞分裂，不利于葉片的伸長(zhǎng)，但有利于植物保持較高的水分狀態(tài)，是一種保護(hù)性的生理反應(yīng)[26]。盡管檢測(cè)的GA3和ZT水平均高于CK組，但都沒(méi)有達(dá)到顯著差異，木霉處理提高了葉片含水率是否與ZT調(diào)控有關(guān)，其機(jī)理有待于進(jìn)一步研究。ABA在種子的發(fā)育、休眠、萌發(fā)以及植物的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)、環(huán)境脅迫響應(yīng)等過(guò)程中具有重要作用，ABA和JA是植物應(yīng)答生物脅迫與非生物脅迫的重要信號(hào)分子，許多逆境條件下植物體內(nèi)ABA或JA含量升高，植物的抗逆性增強(qiáng)[27～28]。SA是植物體內(nèi)自身合成的酚類化合物，它能夠激活植物過(guò)敏反應(yīng)和系統(tǒng)獲得性抗性[29]。本研究發(fā)現(xiàn)T6組月季葉片中ABA、JA和SA水平均顯著高于CK組，并且與抗性相關(guān)的活性酶含量均顯著高于對(duì)照組，這些或許與處理組較快的生長(zhǎng)速度使其強(qiáng)壯，從而增強(qiáng)了對(duì)生長(zhǎng)過(guò)程中自然條件下的各種脅迫的抵抗能力。

姚志紅等[30]認(rèn)為山新楊根際接種木霉菌能降低葉片上侵染病原菌對(duì)植株的危害，通過(guò)調(diào)整植物內(nèi)源激素水平使之趨于未受病原菌侵染時(shí)的狀態(tài)，以此來(lái)維持植物正常生長(zhǎng)。Ying[31]等人在土壤中篩選出58株木霉，用它們分別培養(yǎng)番茄植株發(fā)現(xiàn)，木霉顯示出促進(jìn)植物生長(zhǎng)的作用，包括提高IAA的激素水平。Christmann結(jié)論得出[32]，木霉菌增加了激素對(duì)植物內(nèi)部防御的反應(yīng)水平。由于本研究材料是硬枝扦插獲得的幼芽長(zhǎng)大的月季苗，自然條件下生長(zhǎng)的第一年并沒(méi)有開(kāi)花，木霉菌對(duì)月季開(kāi)花的影響有待于進(jìn)一步驗(yàn)證。

化肥和農(nóng)藥在增加作物產(chǎn)量的同時(shí)，也同樣帶來(lái)了負(fù)面影響，因此，微生物菌肥得到了人們的青睞。如今國(guó)內(nèi)有關(guān)于生防菌肥對(duì)月季生長(zhǎng)促進(jìn)的相關(guān)研究較少，實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明木霉菌具有促進(jìn)月季生長(zhǎng)、提高其防御酶活性和激素水平的作用，研究結(jié)果為研制促進(jìn)月季生長(zhǎng)的生物菌肥以及針對(duì)木霉對(duì)月季開(kāi)花的促進(jìn)作用的研究提供理論依據(jù)。