武瑞娜，王娜，羅世菊，李曉婕

（山東東方海洋科技股份有限公司，國家海藻與海參工程技術(shù)研究中心，山東省海藻遺傳育種與栽培技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 煙臺(tái)264003）

海帶配子體是海帶種質(zhì)資源的重要保存形式，海帶配子體在生長過程中常會(huì)受到細(xì)菌、真菌、等病原生物的危害，導(dǎo)致配子體發(fā)病死亡。海帶的雌配子體和雄配子體發(fā)病情況相類似，在顯微鏡下觀察，配子體在發(fā)病初期，細(xì)胞壁變厚變黑，色素體聚集顏色變暗，生長速度減慢甚至不再生長，之后產(chǎn)生質(zhì)壁分離，最后色素全部分解，只剩細(xì)胞壁空殼，從而導(dǎo)致配子體最后死亡[1]，因此防控細(xì)菌、真菌污染是海帶配子體克隆保存過程中需要解決的問題。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)材料：該實(shí)驗(yàn)室保存過程中發(fā)生污染的海帶配子體克隆。

固體培養(yǎng)基：液體增菌培養(yǎng)基，營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，馬鈴薯-葡萄糖-瓊脂（PDA）培養(yǎng)基由該實(shí)驗(yàn)室自行配制。

藥敏紙片：大部分由微生物試劑公司提供，個(gè)別如先鋒霉素藥敏紙片由研究室自制。

試劑：PCR試劑購于上海生工，PCR產(chǎn)物測(cè)序工作由上海桑尼生物科技有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 病原菌的分離純化 將污染的海帶配子體及培養(yǎng)液，在固體培養(yǎng)基上三區(qū)劃線，進(jìn)行培養(yǎng)，然后挑出單個(gè)菌落，最后獲得純培養(yǎng)。

1.2.2 DNA提取 取純培養(yǎng)的細(xì)菌和真菌接種于液體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)，收集細(xì)菌和真菌。細(xì)菌DNA提取采用SDS法，真菌采用CTAB法。提取的DNA加入100μL的雙蒸水溶解，-20℃保存。用核酸蛋白濃度測(cè)定儀測(cè)定DNA的濃度，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA的質(zhì)量。

1.2.3 PCR反應(yīng) 細(xì)菌PCR選用16s rDNA通用引物27F與1492R（由上海捷瑞公司合成），引物序列如下：27F：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’，1492r：5’-GGTTACCTTGTTA CGACTT-3’。PCR反應(yīng)體系（50μL）：10×PCR buffer 5μL，25 mM MgCl23μL，d NTP 1μL，上下游引物各1μL，2.5 U的TaqDNA polymerase（上海生工公司）0.5μL，DNA模板0.5μL，雙蒸水38μL。PCR反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性1 min，54.5℃退火1 min，72℃延伸1 min（30個(gè)循環(huán)）；72℃最后延伸10 min。

真菌PCR擴(kuò)增ITS片段，選用通用引物ITS1與ITS4(由上海捷瑞公司合成)，引物序列如下：ITS1：5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’，ITS4：5’-TCCTCCG CTTATTGATATGC-3’。PCR反應(yīng)體系（25 ul）：10×PCR bufer 2.5μL，25 mM MgCl22μL，d NTP 0.5μL，引物1TS1與ITS4各0.5 L，2.5 u的Taq DNA polymerase（上海生工公司）0.25 uL，DNA模板0.5μL，雙蒸水l8.25μL。PCR反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性1 min，54.5℃退火1 min，72℃延伸1 min（30個(gè)循環(huán)），72℃最后延伸10 min。取5μL PCR產(chǎn)物，進(jìn)行1%瓊脂凝膠電泳，紫外燈下檢測(cè)。

1.2.4 藥敏試驗(yàn) 將純培養(yǎng)得到的真菌、細(xì)菌接種在液體培養(yǎng)基中連續(xù)培養(yǎng)，制備合適濃度的菌液，均勻涂布于固體培養(yǎng)基表面，等待至表面無明顯菌液后，將藥敏紙片分別貼在培養(yǎng)基表面，分別放在35℃（細(xì)菌）和28℃（真菌）連續(xù)倒置培養(yǎng)。按照抑菌圈的大小判斷菌株對(duì)藥物的敏感度。設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)為：抑菌圈直徑小于10 mm，定為對(duì)此藥物不敏感；抑菌圈直徑在10~15 mm之間，定為對(duì)此藥物中度敏感；抑菌圈直徑大于15 mm，定為此對(duì)藥物高度敏感[2]。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌和真菌的培養(yǎng)特性

配子體克隆被微生物污染后，細(xì)菌（編號(hào)為01016XJ）附著在克隆體表面呈絮狀，見圖1E。真菌（編號(hào)為01016C和01016X）纏繞在克隆之間，見圖1B和1C。

細(xì)菌分離出的單個(gè)菌落（圖2）中等大小，圓形，灰白色，格蘭氏染色顯示為陰性桿菌。

真菌01016C長出的菌落（圖3-A，C）為白色棉絮狀，開始時(shí)菌絲放射狀生長明顯，后期匍匐生長，可以布滿整板，在液體培養(yǎng)基中成團(tuán)或絮狀生長。在倒置顯微鏡下（圖4-A，C），菌絲長且直，孢子長橢圓狀，有的略帶彎曲，形狀均一，內(nèi)有分隔，3~5個(gè)不等。

真菌01016X（圖3-B，D）菌落生長速度比粗絲慢，菌落小，不可以鋪滿整板，略帶淡黃綠色，在液體培養(yǎng)基中均勻渾濁生長。在倒置顯微鏡下（圖4-B，D），菌絲彎曲，分枝多。孢子呈啞鈴狀，長橢圓狀等多種形狀，有的可見2個(gè)分隔，其中可見長的散在的分枝。

圖1 被真菌和細(xì)菌污染的克?。?00×）

圖2 細(xì)菌單個(gè)菌落和革蘭氏染色

圖3 真菌的分離培養(yǎng)

2.2 PCR結(jié)果

圖4 兩株真菌顯微鏡下菌絲和孢子形態(tài)

利用真菌18 s rDNA通用引物和細(xì)菌16 s rDNA通用引物擴(kuò)增出來的目的條帶長度分別位于500~700 bp之間和1 600 bp左右（見圖5）與預(yù)期大小一致。

圖5 真菌01016C、真菌01016X和細(xì)菌01016XJPCR瓊脂糖凝膠電泳

2.3 序列比對(duì)結(jié)果

將所測(cè)的基因序列在GenBank中比對(duì)發(fā)現(xiàn)，與真菌01016C 18 s rDNA ITS序列同源性較高的都是鐮刀菌屬真菌（Fusarium），同源性為100%。與真菌01016X 18 s rDNA ITS序列同源性較高的是叢赤殼屬真菌（Nectria），同源性為99%。與細(xì)菌01016XJ 16 s rDNA序列同源性較高的是γ一變形菌綱鹽單胞菌屬（Halomonas），同源性為99%。

真菌通過ITS區(qū)域比對(duì)，序列相似性≥99%，判定為相同種；序列相似性≥95%且＜99%，判定為相同屬；序列相似性＜95%，判定為同科[3]。對(duì)于細(xì)菌一般認(rèn)為16 s rDNA序列相似性≥99%，可以認(rèn)為是同一個(gè)種；序列相似性≥95%且＜99%，判定為相同屬；序列相似性在93%～95%之間，可以認(rèn)為是不同的屬[4]。

因此，依據(jù)上述結(jié)果該試驗(yàn)所分離的真菌01016C為鐮刀菌屬真菌，真菌01016X為叢赤殼屬真菌，細(xì)菌01016XJ為鹽單胞菌屬細(xì)菌。

2.4 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

真菌藥敏試驗(yàn)的結(jié)果見表1。結(jié)果顯示真菌01016C對(duì)制霉菌素中度敏感；真菌01016X對(duì)制霉菌素中度敏感，對(duì)先鋒霉素則是高度敏感（表1），細(xì)菌菌株01016XJ的藥敏試驗(yàn)結(jié)果見表2。

表1 兩株真菌對(duì)6種藥物的藥敏試驗(yàn)結(jié)果

表2 細(xì)菌藥敏試驗(yàn)結(jié)果

3 討論

鐮刀菌屬（Fusarium）是真菌中的一屬。它在自然界中分布極廣，在土壤、淡水和海水中均有分布，而且分類系統(tǒng)極為復(fù)雜，形態(tài)變化差異很大。它可侵染多種植物，造成植物的葉片萎焉、根系腐爛、果穗腐爛等好多類型的腐爛病癥，從而引起產(chǎn)量嚴(yán)重下降，造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。鐮刀菌的有性時(shí)期分別屬于肉座菌科（Hypocreaceae）的赤霉屬（Gillerella）、叢赤殼屬（Nectria）、麗赤殼屬（Calonectria）和小赤殼屬（Micronectriella）等[5]。該試驗(yàn)中分離得到兩株真菌01016C和01016X雖然從形態(tài)上有較大差別，但仍然不排除是一種真菌的不同時(shí)期，要確定這兩株真菌是不是屬于一種真菌的不同的時(shí)期，屬于哪種時(shí)期，還有待進(jìn)一步的深入研究和探討。

鹽單胞菌（Halornonas）是一類能在NaC1質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0～5.13 mol/L條件下生長的嗜鹽鹽微生物，在鹽湖、鹽場(chǎng)、鹽堿地、海冰和海洋等環(huán)境中都有分布。嗜鹽微生物主要包括嗜鹽古菌和嗜鹽細(xì)菌。嗜鹽古菌在分類學(xué)上，主要屬于鹽桿菌科，嗜鹽細(xì)菌則廣泛分布在細(xì)菌域的分枝中[6]。該試驗(yàn)分離出的細(xì)菌從培養(yǎng)特性和16 s rDNA序列同源性比對(duì)結(jié)果都符合鹽單胞菌屬特性，后續(xù)可以進(jìn)行更多的實(shí)驗(yàn)，如生化試驗(yàn)、耐鹽度試驗(yàn)、溫度試驗(yàn)等，進(jìn)一步對(duì)此菌的特性和歸屬進(jìn)行更細(xì)致的研究。

目前還沒有海帶配子體克隆受多種微生物污染的相關(guān)報(bào)道，該試驗(yàn)中受上述微生物污染的海帶配子體克隆表現(xiàn)為生長緩慢，色素減少，甚至死亡的癥狀，這些癥狀是3種微生物共同作用的結(jié)果，還是其中一種或兩種作用的結(jié)果，是由于微生物分泌毒素，還是其他原因仍需進(jìn)一步研究。此外藥敏試驗(yàn)的結(jié)果也為配子體克隆的污染篩選出了最佳的治療藥物，為種質(zhì)保存工作中微生物污染的防治提供了一定的理論依據(jù)。