姜艷梅 王 晶 吳金明 張洪斌 林愛(ài)蓮 王 楠

(大連醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院檢驗(yàn)科，大連 116011)

惡性腫瘤是一類嚴(yán)重威脅人類身體健康的常見(jiàn)病，早期發(fā)現(xiàn)、及時(shí)診斷是該病治療及判斷預(yù)后的關(guān)鍵，也是降低死亡率的最有效方法。腫瘤標(biāo)志物(tumor marker，TM)是指在惡性腫瘤的發(fā)生和增殖過(guò)程中，由腫瘤細(xì)胞合成分泌的或由機(jī)體對(duì)腫瘤反應(yīng)而異常產(chǎn)生的/或升高的，反映腫瘤存在和生長(zhǎng)的一類物質(zhì)，對(duì)腫瘤的輔助診斷、鑒別診斷、療效觀察、監(jiān)測(cè)復(fù)發(fā)及預(yù)后評(píng)價(jià)具有一定價(jià)值。目前TM除前列腺特異性抗原(prostate specific antigen,PSA)有相對(duì)較好的特異性外，其他均無(wú)嚴(yán)格的組織器官特異性，部分TM因受多因素影響在健康人群中也會(huì)異常表達(dá)，在惡性腫瘤的診斷和鑒別中受到一定限制。因此，建議多種TM聯(lián)合檢測(cè)，以達(dá)到提高惡性腫瘤診斷率的目的[1]。

蛋白芯片技術(shù)的發(fā)展為多TM聯(lián)合檢測(cè)提供了理想的工具，TM蛋白芯片分析技術(shù)是一門由生命科學(xué)和微電子學(xué)科相交叉的技術(shù)，通過(guò)該技術(shù)可以高靈敏、高通量及高特異性地進(jìn)行蛋白質(zhì)的微量分析[2]。本文將對(duì)比蛋白芯片多TM檢測(cè)系統(tǒng)與電化學(xué)發(fā)光方法檢測(cè)TM的結(jié)果，同時(shí)分析我院健康體檢人群篩查結(jié)果，并對(duì)陽(yáng)性個(gè)體追蹤隨訪，探討健康體檢人群中蛋白芯片法多腫瘤標(biāo)志物篩查對(duì)惡性腫瘤早期診斷的臨床意義。

1 資料與方法

1.1資料

1.1.1研究對(duì)象 2017年6月～2018年5月大連醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院體檢中心健康體檢者7 339例，其中分別進(jìn)行C6和C12A檢測(cè)的體檢者為5 944例和1 395例，年齡25～86歲，平均年齡為45.5歲。

1.1.2試劑和儀器 HD-2001A/LU-07型系列生物芯片檢測(cè)儀和多腫瘤標(biāo)志物蛋白芯片檢測(cè)C6和C12A試劑盒購(gòu)自上海銘源數(shù)康生物科技有限公司,C6的檢測(cè)項(xiàng)目為癌胚抗原(carcinoembryonic antigen，CEA)、甲胎蛋白(alpha-fetoprotein，AFP)、糖鏈抗原125(carbohydrate antigen 125，CA125)、糖類抗原19-9(carbohydrate antigen 19-9，CA19-9)、細(xì)胞角蛋白19片段(cytokeratin 19 fragment，CK19)和鱗癌抗原(squamous cell carcinoma antigen，SCC)，C12A在C6的基礎(chǔ)上又添加了神經(jīng)元特異性烯醇化酶(neuron-specific enolase，NSE)、β人絨毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotropin β subunit，β-HCG)、結(jié)合型前列腺特異性抗原(combined-Prostate specific antigen，c-PSA)、糖類抗原15-3(carbohydrate antigen 15-3，CA15-3)、CA72-4和CA242；本實(shí)驗(yàn)通過(guò)本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，CobasE601電化學(xué)發(fā)光免疫分析儀及其配套試劑盒購(gòu)自羅氏；i2000化學(xué)發(fā)光免疫分析儀及其配套試劑盒購(gòu)自雅培公司(用于檢測(cè)SCC)。

1.2方法

1.2.1比對(duì)實(shí)驗(yàn) 根據(jù)芯片檢測(cè)范圍，選取18例患者血清標(biāo)本及2個(gè)水平羅氏質(zhì)控血清分別應(yīng)用多腫瘤標(biāo)志物蛋白芯片檢測(cè)儀及羅氏電化學(xué)發(fā)光分析儀進(jìn)行檢測(cè)，具體操作步驟參照儀器及試劑說(shuō)明書(shū)，將所得結(jié)果進(jìn)行比對(duì)分析。

1.2.2標(biāo)本檢測(cè) 空腹采集外周血3.5 ml離心分離血清，4℃冰箱保存且在4 d內(nèi)檢測(cè)完畢。對(duì)于檢測(cè)結(jié)果異常者采用CobasE601電化學(xué)發(fā)光免疫分析儀(SCC采用雅培i2000化學(xué)發(fā)光免疫分析儀)進(jìn)行單個(gè)項(xiàng)目TM檢測(cè)復(fù)查，并與芯片法結(jié)果進(jìn)行比對(duì)分析。對(duì)高度疑似病例隨訪調(diào)查，通過(guò)病理學(xué)和影像學(xué)等進(jìn)一步檢查以明確診斷。

1.2.3結(jié)果判斷 兩種方法檢測(cè)12項(xiàng)腫瘤標(biāo)志物正常參考區(qū)間，見(jiàn)表1。TM指標(biāo)檢測(cè)超過(guò)正常參考區(qū)間即診斷為陽(yáng)性。以電化學(xué)發(fā)光法為標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)蛋白芯片法進(jìn)行方法學(xué)評(píng)價(jià)(真/假陽(yáng)性、真/假陰性的判斷)。對(duì)于經(jīng)蛋白芯片法檢測(cè)升高的標(biāo)本，經(jīng)電化學(xué)發(fā)光法復(fù)查后據(jù)此出具結(jié)果。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用GraphPad Prism 5軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，定性變量統(tǒng)計(jì)描述采用百分比和頻數(shù)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1芯片法與電化學(xué)發(fā)光法結(jié)果比對(duì)分析 根據(jù)CANS-CL02-A003文件，使用不同參考區(qū)間的檢測(cè)系統(tǒng)間不宜進(jìn)行結(jié)果比對(duì)。CEA、CA19-9、CA125、CK19、CA72-4、CA15-3采用定量結(jié)果比對(duì)分析，而AFP、NSE、 β-HCG則根據(jù)各自的參考區(qū)間判斷是否為陽(yáng)性，按定性結(jié)果比對(duì)分析。定量比對(duì)分析的結(jié)果如圖1所示，兩種檢測(cè)方法相關(guān)性較好(P<0.001)，總體K值大于1，CEA線性最好，r2>0.95，CA125和CA15-3，r2<0.90，其余三項(xiàng)r2在0.90～0.95之間，具有很好的線性。定性比對(duì)分析的三個(gè)項(xiàng)目，采用配對(duì)資料的卡方檢驗(yàn)，兩種方法無(wú)顯著性差異(P>0.05)，且不符合以化學(xué)發(fā)光法為準(zhǔn)：AFP假陰性1例、假陽(yáng)性1例，NSE假陽(yáng)性1例，β-HCG 2例均為假陰性。

表1 蛋白芯片法和化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)TM的參考區(qū)間

圖1 蛋白芯片法與電化學(xué)發(fā)光法方法學(xué)比較分析結(jié)果Fig.1 Comparative analysis of tumor markers detecded by protein chip and chemiluminescence

2.2蛋白芯片法檢測(cè)健康體檢人群TM結(jié)果 自2017年6月1日～2018年5月31日，共有7 339例健康體檢者利用蛋白芯片法檢測(cè)了多項(xiàng)TM，TM檢出結(jié)果異常的標(biāo)本601例，共637個(gè)項(xiàng)目，其中單項(xiàng)指標(biāo)異常571例，組合指標(biāo)(以兩項(xiàng)指標(biāo)同時(shí)異常為主)異常30例，有6例體檢者以上3項(xiàng)均異常，總陽(yáng)性率為8.18%，其中男性檢出率為8.62%(383/4 442)，女性檢出率為7.52%(218/2 897)。本團(tuán)隊(duì)對(duì)結(jié)果異常的體檢者進(jìn)行了6～18個(gè)月的跟蹤隨訪，601例陽(yáng)性標(biāo)本中有13例經(jīng)臨床診斷為腫瘤病人，腫瘤檢出率為0.2%，2例在體檢前已經(jīng)接受過(guò)腫瘤相關(guān)治療；有81例存在良性甲狀腺結(jié)節(jié)、肺結(jié)節(jié)、膽囊炎、膽囊結(jié)石、男性有前列腺增生或肥大等；169例由于生理變化及不良生活習(xí)慣引發(fā)TM升高，有28例3到12個(gè)月后異常項(xiàng)目恢復(fù)正常；其余均為不明原因TM異常，該組病人有待于繼續(xù)追蹤隨訪研究。

表2 健康體檢者蛋白芯片法腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)結(jié)果

表3 蛋白芯片法檢出腫瘤標(biāo)志物異常結(jié)果與應(yīng)用化學(xué)發(fā)光法復(fù)檢結(jié)果比較

表4 嗜異性抗體血清異常結(jié)果復(fù)查前后對(duì)比

601例健康體檢標(biāo)本中，各個(gè)檢測(cè)項(xiàng)目的異常例數(shù)和檢出率如表2所示，CA72-4、CEA、CA242的檢出率較高，依次為7.12%、2.49%、2.44%；β-HCG、CA15-3、AFP檢出率較低，依次為0.43%、0.36%、0.11%。除與性別有關(guān)的TM外，男女人群中，CEA、CA125、CA242檢出率差別較大。

2.3蛋白芯片法檢測(cè)異常結(jié)果與化學(xué)發(fā)光法結(jié)果比較分析 蛋白芯片法檢測(cè)超出正常參考值范圍的項(xiàng)目選用電化學(xué)發(fā)光法進(jìn)行單個(gè)項(xiàng)目TM復(fù)查(SCC使用化學(xué)發(fā)光法進(jìn)行復(fù)檢)，根據(jù)年齡、升高程度以及是否為多項(xiàng)目異常等指標(biāo)，共復(fù)查196 例，不包括污染和嗜異性抗體15例。在復(fù)查的196例標(biāo)本中，兩種方法結(jié)果一致，即真陽(yáng)性者為151例(77.04%)，有47個(gè)項(xiàng)目的45例標(biāo)本芯片法與化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)結(jié)果存在顯著性差異，其中39例標(biāo)本進(jìn)行了SCC復(fù)查，只有9例結(jié)果一致，除去SCC后，真陽(yáng)性率為90.44%。蛋白芯片法檢出異常結(jié)果與化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)具體結(jié)果見(jiàn)表3。蛋白芯片法讀取結(jié)果時(shí)根據(jù)是否顯色均勻明亮判斷患者是否存在嗜異性抗體，將懷疑標(biāo)本應(yīng)用化學(xué)發(fā)光法復(fù)檢，結(jié)果如表4。

3 討論

近年來(lái)，腫瘤的發(fā)生率逐年升高，在腫瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，早期癥狀隱匿，多數(shù)患者就診時(shí)已發(fā)展為晚期，因此早期診斷對(duì)腫瘤的治療和預(yù)后有十分重要的意義。目前，TM檢測(cè)已成為繼影像學(xué)和病理學(xué)診斷之后臨床最常用的腫瘤診斷方法，在腫瘤普查、早期診斷、判斷預(yù)后和轉(zhuǎn)歸以及評(píng)價(jià)療效等方面具有較高的應(yīng)用價(jià)值。與酶聯(lián)免疫分析、放射免疫分析等傳統(tǒng)的TM檢測(cè)方法相比，蛋白芯片法以微陣列原理為基礎(chǔ)，與化學(xué)發(fā)光免疫膜技術(shù)結(jié)合，應(yīng)用計(jì)算機(jī)圖像分析方法聯(lián)合檢測(cè)血清中的TM，具有樣本用量少[3，4]、檢測(cè)通量大等優(yōu)點(diǎn)。隨著人們對(duì)腫瘤的了解越來(lái)越多，高危人群對(duì)自己健康的關(guān)注日益增加，這種方便、多項(xiàng)目聯(lián)合的檢測(cè)方式越來(lái)越受到體檢人群尤其是高危人群的歡迎。

蛋白芯片法檢測(cè)TM利用抗原抗體特異性結(jié)合原理，采用雙抗體夾心法，固相基質(zhì)上包被的TM特異性單克隆抗體，捕獲被檢血清中對(duì)應(yīng)的TM，然后結(jié)合第2代抗體(攜帶示蹤標(biāo)記物)，通過(guò)特定的化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生光信號(hào)，用配套的生物芯片閱讀儀讀取光信號(hào)，以已知TM濃度做標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)未知血清進(jìn)行定量檢測(cè)[5]。盡管蛋白芯片檢測(cè)有諸多優(yōu)點(diǎn)，但蛋白芯片法的應(yīng)用也存在一些爭(zhēng)議，有研究者表示其與單個(gè)血清TM檢測(cè)比較存在一定的假陽(yáng)性[6]。本研究收集了2017年6月～2018年5月期間到大連醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院體檢患者的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

本研究首先對(duì)蛋白芯片法和電化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)TM進(jìn)行了方法學(xué)的比較分析，六項(xiàng)定量分析項(xiàng)目結(jié)果顯示兩種方法間有明顯的相關(guān)性，r2分布在0.77～0.96之間，其中CA15-3因?yàn)楦咧灯x，造成r2值較低，其余都呈良好的線性，兩種方法沒(méi)有顯著性差異；由于AFP、NSE、β-HCG芯片法與電化學(xué)發(fā)光法采用的參考區(qū)間不同，故采用定性的方法進(jìn)行比較分析，結(jié)果顯示兩種方法無(wú)顯著性差異，僅有個(gè)別標(biāo)本存在差異，以電化學(xué)發(fā)光法為標(biāo)準(zhǔn)判斷，AFP有1例假陽(yáng)性，1例假陰性，AFP有1例假陰性，1例假陽(yáng)性，β-HCG 2例則均為假陰性，與比對(duì)結(jié)果相同，在后續(xù)的工作中也遇到了AFP假陰性結(jié)果，因此在應(yīng)用芯片法做健康人群腫瘤篩查時(shí)需注意結(jié)合臨床，必要時(shí)應(yīng)采取其他方法復(fù)檢。

本研究根據(jù)患者的需求分別采用了6項(xiàng)或12項(xiàng)蛋白芯片分析了7 339例健康體檢者血清中多項(xiàng)TM，結(jié)果顯示7 339例樣本應(yīng)用蛋白芯片法檢測(cè)共601例標(biāo)本結(jié)果異常，總檢出率為8.18%，男性高于女性，CA72-4檢出率最高，AFP檢出率最低，CEA和CA242在男性和女性群體中檢出率存在較大差別，可能與男性吸煙、喝酒等不良生活習(xí)慣有關(guān)。本研究中總檢出率高于國(guó)內(nèi)的其他同類研究[6-8]，這些研究的檢出率在2.2%-3.8%之間，但也有報(bào)道檢出率和本文相近[9]。原因可能是由于在芯片C12A中包括CA72-4和SCC，而這兩個(gè)項(xiàng)目檢出率較高，其中有39例標(biāo)本進(jìn)行了SCC復(fù)查，只有9例結(jié)果一致，假陽(yáng)性率較高，可能與操作過(guò)程中污染有關(guān)。SCC在人的唾液和皮膚中含量很高，而芯片法所需操作步驟較多，容易被污染，根據(jù)這個(gè)數(shù)據(jù)，擴(kuò)大復(fù)查率的同時(shí)也要求檢驗(yàn)人員在生物安全柜內(nèi)操作，避免污染。

對(duì)于研究過(guò)程中的異常結(jié)果，本研究組應(yīng)用了臨床認(rèn)可的方法進(jìn)行了復(fù)查[6-7,10]。在檢測(cè)體檢者標(biāo)本時(shí)，對(duì)蛋白芯片法檢測(cè)結(jié)果異常的標(biāo)本結(jié)合體檢者其它情況，應(yīng)用化學(xué)發(fā)光法對(duì)196例標(biāo)本進(jìn)行復(fù)查，除去SCC以外有9例為假陽(yáng)性，與方法學(xué)比較結(jié)果相近，真陽(yáng)性率為90.44%，假陽(yáng)性的分別為CEA 6例、CA125 3例、CA19-9 5例，AFP、NSE、CA72-4分別1例，可能由于不同抗體反應(yīng)需要的時(shí)間不同，而蛋白芯片法將多種抗體置于同一基質(zhì)片上采用相同的反應(yīng)時(shí)間，會(huì)影響檢測(cè)的結(jié)果[10]。這一研究結(jié)果與其他國(guó)內(nèi)研究結(jié)果基本一致，龔倩等[6]應(yīng)用雅培I2000化學(xué)發(fā)光免疫分析儀對(duì)190例陽(yáng)性標(biāo)本進(jìn)行復(fù)查，只有9例不符合前期結(jié)果，包括2例CA19-9、1例PSA、2例CEA、1例β-HCG；韓偉平等[7]應(yīng)用CobasE411電化學(xué)發(fā)光免疫分析儀復(fù)查結(jié)果陽(yáng)性233例，真陽(yáng)性率95%。與其他國(guó)內(nèi)研究相比，本研究的12項(xiàng)蛋白芯片采用的是C12A，將兩項(xiàng)PSA整合為c-PSA，HCG變?yōu)棣?HCG，增加了SCC，敏感性也有所提高。另外在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，有15例標(biāo)本因顯色異常判斷為含有嗜異性抗體(人抗鼠抗體)，從而導(dǎo)致單項(xiàng)或多項(xiàng)結(jié)果異常[11]。應(yīng)用蛋白芯片法測(cè)定TM時(shí)，檢測(cè)試劑中與TM反應(yīng)的是2種不同的鼠單克隆抗體，如果病人血清中存在嗜異性抗體，它可在2種抗體間起“橋梁”作用，導(dǎo)致在無(wú)抗原的情況下，抗體與抗體直接結(jié)合而呈陽(yáng)性反應(yīng)，進(jìn)而造成TM濃度增高的假象。

另外，對(duì)復(fù)檢后兩種方法檢測(cè)結(jié)果相符合的體檢者進(jìn)行跟蹤隨訪，利用病理學(xué)、影像學(xué)等檢測(cè)手段對(duì)于高度疑似病例做進(jìn)一步確診，其中有2例體檢時(shí)已確診癌癥，13例體檢后不同時(shí)間經(jīng)臨床確診罹患腫瘤，腫瘤檢出率為0.2%，其中有11例為多TM異常，因此多項(xiàng)TM聯(lián)合檢測(cè)對(duì)于健康體檢人群惡性腫瘤篩查相對(duì)單項(xiàng)篩查更有意義[12-13]；有部分健康體檢者是由于良性疾病引起的TM異常，以甲狀腺結(jié)節(jié)居多，這與該疾病在大連地區(qū)多發(fā)有關(guān)；也有部分體檢者幾個(gè)月后復(fù)查恢復(fù)正常。半數(shù)體檢者為TM不明原因的升高，該部分患者值得我們長(zhǎng)時(shí)間的跟蹤。

綜上所述，蛋白芯片法檢測(cè)多TM具有創(chuàng)傷小、成本低、靈敏度高等特點(diǎn)，一次最多可同時(shí)檢測(cè)12種常見(jiàn)的TM，操作方法簡(jiǎn)單，提高了檢測(cè)效率。與其他方法相比，這種聯(lián)合檢測(cè)系統(tǒng)更適宜于健康體和無(wú)癥狀人群篩查，尤其對(duì)高危人群的腫瘤普查具有很高的早期診斷價(jià)值。經(jīng)過(guò)對(duì)7339名健康體檢者的篩查，至文章撰寫結(jié)束時(shí)，隨訪半年到一年時(shí)間，有13例新發(fā)病例，這些病例的診斷與TM的異常是分不開(kāi)的。但同時(shí)也要注意，一些良性疾病、吸煙、飲酒、嗜異性抗體等均可影響檢測(cè)結(jié)果[14]。鑒于有部分結(jié)果異常的體檢者，經(jīng)過(guò)復(fù)查后正?；虍惓Ｔ虿幻鳎瑧?yīng)用蛋白芯片法對(duì)于健康體檢人群進(jìn)行多TM檢測(cè)時(shí)，更換結(jié)果異常者復(fù)檢方法的同時(shí)，需聯(lián)合CT、B 超、病理檢查等手段進(jìn)行綜合判斷，并且要定期復(fù)查、隨訪等，從而更好的達(dá)到早期發(fā)現(xiàn)、早期治療的目的。