趙玉霞 劉迎春 張細元 梅 紅

(華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院附屬武漢兒童醫(yī)院消化內(nèi)科，武漢 430016)

潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis，UC)是炎癥性腸病的一種類型，近年來，國內(nèi)兒童UC的患病率逐年上升，引起兒科臨床的高度重視。UC的發(fā)病機制目前尚不清楚，病理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)結(jié)腸黏膜中單核細胞深度浸潤，Th2細胞分泌過量的促炎細胞因子，如腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)、IL-17、IL-4、IL-5 和IL-13等，與UC的嚴重程度密切相關(guān)[1]。免疫失調(diào)是炎癥性腸病的重要致病因素[2]，其中Th2或Th17活化在UC的發(fā)病機制中起關(guān)鍵性作用[3]。但其在腸道中介導(dǎo)Th2活化的機制目前尚未清楚。有研究發(fā)現(xiàn)Bcl2樣蛋白12(Bcl2 like protein 12，Bcl2L12)在免疫失調(diào)發(fā)病過程中起到重要作用[4]。Bcl2L12屬于Bcl2家族，是抗凋亡分子之一[5]，能夠抑制P53并促進細胞存活[6]。但Bcl2L12蛋白在小兒UC發(fā)病中的作用目前尚無報道。因此本研究主要探討CD4+T細胞分泌的Bcl2L12在介導(dǎo)Th2活化過程中的機制。

1 資料與方法

1.1資料

1.1.1研究對象 按照《兒童炎癥性腸病診斷規(guī)范共識意見》診斷標(biāo)準(zhǔn)[7]，納入2015年1月～2017年12月于我院初診的20例UC患兒，并以同期20例性別、年齡匹配的健康兒童作為對照組。UC組和對照組均符合以下標(biāo)準(zhǔn)：①無自身免疫性疾??；②近3個月內(nèi)無感染史；③近3月內(nèi)無激素、免疫抑制劑及生物制劑用藥史。本研究經(jīng)本院倫理委員會審核通過，所有患兒及對照組親屬知情同意。UC患兒及對照組的一般資料見表1。

表1 UC組和健康對照組的臨床資料

1.1.2實驗動物 CD4+T細胞中Bcl2L12特異性敲除小鼠(Bcl2L12-KO)及其對照C57BL/6J野生型小鼠(WT)均購自武漢大學(xué)實驗動物中心，并飼養(yǎng)于無菌動物飼養(yǎng)室。

1.2方法

1.2.1外周血標(biāo)本收集及血清、PBMC分離 在無菌條件下抽取外周靜脈血10 ml，其中2 ml置于離心管中，靜置30 min后以500 r/min離心5 min，取上清儲存于-80℃冰箱中；另外8 ml經(jīng)肝素抗凝后于2 h內(nèi)通過密度梯度離心法收集外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)。

1.2.2血清炎癥因子檢測 ELISA法分別檢測的血清中Th2細胞活化因子IL-4、IL-5和IL-13及Bcl2L12水平(試劑盒購自BD公司)。

1.2.3流式細胞術(shù)檢測Th2細胞 在PBMC懸液中加入異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記的抗CD4抗體和PE標(biāo)記的抗IL-4抗體測定Th2細胞，CD4+IL-4+雙陽性細胞即為Th2細胞。

1.2.4UC造模 取4周齡WT和Bcl2L12-KO各20只，每組選取10只小鼠自由飲用3%的硫酸葡聚糖(dextran sulphate sodium，DSS)連續(xù)7 d，作為UC模型組；其余10只小鼠正常飲用水，無DSS添加，作為對照組。第8天時處死小鼠，進行后續(xù)實驗。

1.2.5小鼠體重測定 在造模期間，每日觀察小鼠的精神狀態(tài)、毛色、進食及糞便情況，并記錄體重。

1.2.6結(jié)腸長度測定 實驗第8天，處死小鼠后取結(jié)腸至肛門直腸段，測量并記錄自然長度。

1.2.7結(jié)腸HE染色及病變評分 取小鼠結(jié)腸組織，用生理鹽水沖洗后，置于4%多聚甲醛中，于室溫下固定12 h以上，經(jīng)脫水、石蠟包埋后連續(xù)切片，進行蘇木素-伊紅(HE)染色。結(jié)腸組織的炎癥病理評分標(biāo)準(zhǔn)如下：腸壁炎癥嚴重程度分為輕度1分、中度2分、重度3分；病變嚴重程度分為病變位于黏膜層1分、黏膜和黏膜下層2分、透壁性損害3分；隱窩損害程度分為輕度1分、中度2分、隱窩缺失但上皮完整3分、隱窩表面上皮都缺失4分。將上述3項指標(biāo)相加即為最后得分。

1.2.8血清炎癥因子和Th2細胞比例測定 血清炎癥因子測定同1.2.2；外周血PBMC中Th2細胞比例測定同1.2.3。

1.2.9結(jié)腸組織中Th2凋亡細胞檢測 取病變所在部位結(jié)腸，經(jīng)膠原酶Ⅳ水解單細胞化后，加入FITC標(biāo)記的抗CD4抗體和PE標(biāo)記的抗IL-4抗體測定Th2細胞，APC標(biāo)記的Annexin V和PI染料，通過流式細胞術(shù)檢測病變結(jié)腸組織中Th2凋亡細胞(以Annexin V+PI-為特征)占總Th2細胞的比例。

1.2.10Western blot檢測Th2細胞中Bcl2L12蛋白水平 分離Bcl2L12-KO和WT小鼠脾臟中的Th2細胞，加入細胞裂解液，離心10 min后取上清，沸水浴3 min使蛋白充分變性，Western blot法檢測Bcl2l12-KO和WT小鼠Th2細胞中Bcl2L12蛋白的表達，從而驗證Bcl2L12敲除效率。以β-actin作為參照。

2 結(jié)果

2.1UC患兒血清中Th2相關(guān)炎癥因子水平 UC患兒血清中IL-4水平[(20.67±3.55)μg/ml vs (4.78±1.38)μg/ml，P<0.001]、IL-5水平[6.95 μg/ml vs (2.71±1.27)μg/ml，P<0.05]和IL-13水平[(49.73±13.57)μg/ml vs (21.50±4.81)μg/ml，P<0.01]均明顯高于對照組(圖1A-C)。通過流式細胞數(shù)分析外周PBMC中Th2細胞比例發(fā)現(xiàn)，UC患兒PBMC中Th2細胞比例顯著高于對照組[(4.39±2.04)% vs (1.05±0.62)%,P<0.01](圖1D)。

2.2UC患兒血清BCL2L12蛋白水平 UC患兒血清中BCL2L12蛋白水平顯著高于對照組[(46.04±13.42)μg/ml vs (12.44±4.88)μg/ml，P<0.01](圖1E)。

圖1 UC患兒與對照組的血清Th2相關(guān)炎癥因子及BCL2L12蛋白水平比較Fig.1 Serum Th2-related inflammatory factors and BCL2L12 protein levels in children with UC and controls

2.3Bcl2L12對UC進展的影響 Bcl2L12-KO小鼠的外周血Th2細胞不表達Bcl2L12蛋白(圖2A)。通過DSS誘導(dǎo)UC后發(fā)現(xiàn)，Bcl2L12-KO小鼠的結(jié)腸炎癥程度弱于WT小鼠(圖2B)。進一步通過炎癥評分證實Bcl2L12-KO小鼠經(jīng)DSS誘導(dǎo)后的炎癥評分顯著低于WT小鼠[(2.4±0.8 )vs (8.4±1.4)，P<0.01](圖2C)。此外，Bcl2L12-KO小鼠在DSS誘導(dǎo)后體重降低程度明顯低于WT小鼠(P<0.01)(圖2D)，且結(jié)腸長度長于WT小鼠(P<0.01)(圖2E)。

2.4Bcl2L12對Th2細胞炎癥因子分泌的影響 Bcl2L12-KO小鼠經(jīng)DSS誘導(dǎo)后，外周血中的Th2細胞比例顯著低于WT小鼠[(10.1±2.9)% vs (23.2±3.8)%，P<0.01](圖3A)。 同時， Bcl2L12-KO小鼠血清中IL-4[(5.39±1.42)μg/ml vs (18.44±4.21)μg/ml，P<0.001]、IL-5[(2.41±0.92)μg/ml vs (8.73±1.40)μg/ml，P<0.01]、IL-13[(12.59±4.31)μg/ml vs (43.52±12.40)μg/ml，P<0.05]和Bcl2L12蛋白水平[(0.32±0.19)μg/ml vs (58.21±12.42)μg/ml，P<0.001]均顯著低于WT小鼠(圖3B～E)。未經(jīng)DSS誘導(dǎo)的Bcl2L12-KO和WT小鼠外周血中Th2細胞比例、IL-4、IL-5、IL-13水平無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)(圖3A～D)。

圖2 Bcl2L12-KO與WT小鼠的UC造模Fig.2 UC model in Bcl2L12-KO and WT mice

圖3 Bcl2L12-KO與WT小鼠的血清Th2相關(guān)炎癥因子及BCl2L12蛋白水平比較Fig.3 Comparison of serum Th2-related inflammatory factors and BCl2L12 protein levels in Bcl2L12-KO and WT mice

圖4 Bcl2l12-KO與WT小鼠結(jié)腸組織中Th2細胞凋亡情況Fig.4 Apoptosis of Th2 cells in colon tissues of Bcl2l12-KO and WT mice

2.5Bcl2L12對Th2細胞凋亡的影響 經(jīng)DSS誘導(dǎo)后，Bcl2L12-KO小鼠的Th2凋亡細胞比例顯著高于WT小鼠[(29.1±4.3)% vs (8.4±2.3)%，P<0.001]，但未經(jīng)DSS誘導(dǎo)的Bcl2L12-KO和WT小鼠的結(jié)腸組織中Th2凋亡細胞比例無統(tǒng)計學(xué)差異(圖4)。

3 討論

UC是發(fā)生于結(jié)腸黏膜中的慢性炎癥，其致病因素目前仍無定論。有研究發(fā)現(xiàn)結(jié)腸中對食物過敏源的偏態(tài)反應(yīng)，而這種反應(yīng)被認為是食物蛋白誘導(dǎo)的腸道炎癥綜合征或非IgE介導(dǎo)的食物過敏[8]。也有研究表明，合并有IgE介導(dǎo)的食物過敏的UC患者對過敏原特異性免疫治療反應(yīng)良好[9]。而目前的理論認為Th2偏向性炎癥反應(yīng)是過敏性疾病的主要特征之一。而本研究也發(fā)現(xiàn)了UC患兒外周血中Th2細胞比例增多，提示了UC患兒處于Th2偏向性炎癥反應(yīng)狀態(tài)。

Th2活化介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)以Th2細胞深度浸潤和局部組織中高水平的Th2細胞因子的分泌為主要特征，包括IL-4、IL-5和IL-13，其中IL-4是Th2細胞分子的特征性因子[10]。IL-4介導(dǎo)B細胞中的IgE同型轉(zhuǎn)換而促進IgE的分泌[11]。目前有多項研究探討了Th2炎癥反應(yīng)在UC發(fā)病機制中的作用。Melgar等[12]發(fā)現(xiàn)UC患者的結(jié)腸黏膜中Th2細胞比例降低，但Rosen等[13]則發(fā)現(xiàn)UC患者的血清中Th2細胞因子(IL-5和IL-13)的水平顯著升高，并且與UC的結(jié)腸黏膜愈合密切相關(guān)。盡管目前認為Th2細胞因子對機體本身具有適當(dāng)?shù)谋Ｗo性作用，但Th2細胞因子的過量分泌也將介導(dǎo)多種疾病的發(fā)生和進展[14]。本研究也發(fā)現(xiàn)UC患兒血清Th2細胞因子水平顯著高于對照組兒童，這與Rosen等[13]的結(jié)論一致。

盡管Th2細胞因子參與慢性炎癥疾病的發(fā)生已被充分認可，但驅(qū)動Th2細胞因子過量分泌的機制目前尚不清楚。本研究結(jié)果表明，CD4+T細胞合成并分泌的Bcl2L12蛋白在介導(dǎo)Th2偏向性的炎癥反應(yīng)中起重要作用，提示Bcl2L12蛋白與UC的發(fā)生相關(guān)。Bcl2L12是BCL2家族成員之一，參與細胞凋亡的調(diào)節(jié)。早期研究表明膠質(zhì)瘤細胞、肝臟和血管內(nèi)皮細胞等均可合成并分泌Bcl2L12蛋白[15]。本研究發(fā)現(xiàn)CD4+T細胞可以合成和釋放Bcl2L12蛋白。Bcl2L12的表達能夠抑制抑癌基因P53、胱天蛋白酶3和胱天蛋白酶7的表達從而抑制細胞凋亡[16]。本研究發(fā)現(xiàn)Bcl2L12敲除小鼠在UC造模后結(jié)腸組織中凋亡的Th2細胞比例顯著低于野生型小鼠，這也提示了Bcl2L12蛋白在抑制Th2細胞凋亡方面的作用。本研究還發(fā)現(xiàn)Bcl2L12敲除小鼠經(jīng)UC造模后，其體重下降程度、結(jié)腸縮短程度均明顯低于野生型小鼠，且Bcl2L12敲除小鼠結(jié)腸組織的炎癥嚴重程度和炎癥評分均明顯低于野生型小鼠，血清中Th2細胞因子水平和Th2細胞比例也顯著低于野生型小鼠。由于本研究采用的是CD4+T特異條件性Bcl2L12敲除的小鼠模型，直接提示了CD4+T細胞分泌的Bcl2L12在參與Th2細胞活化從而促進UC進展中的作用。

綜上所述，本研究證實了小兒UC患兒血清中Bcl2L12和Th2細胞因子水平顯著升高，處于Th2偏向性炎癥反應(yīng)狀態(tài)。通過小鼠模型證實了CD4+T細胞分泌的Bcl2L12蛋白能夠抑制Th2細胞的凋亡，從而促進Th2細胞的活化、刺激Th2細胞因子的分泌并促進UC疾病的進展，為UC的治療提供新的靶點。