羅雅煊 李婷婷 王嘉悅 秦 波 金艾順

(重慶醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)教研室,重慶 400016)

WHO報(bào)道，全球大約有2.57億慢性HBV感染者[1]，中國(guó)是HBV感染的高發(fā)國(guó)家。HBV感染慢性化可導(dǎo)致肝硬化和肝癌，嚴(yán)重影響人們的身體健康[2]。CHI患者病程長(zhǎng)久，臨床癥狀多樣，根據(jù)目前的乙肝防治指南和臨床表現(xiàn)，慢性HBV感染被劃分為四個(gè)不同臨床階段：IT、IA、IC、RA[3-5]。病毒活躍情況與患者免疫狀態(tài)的關(guān)系密切復(fù)雜。機(jī)體對(duì)HBV免疫應(yīng)答的差異造成HBV感染的不同轉(zhuǎn)歸。HBV誘發(fā)肝損傷過程中，T細(xì)胞免疫應(yīng)答對(duì)病毒清除具有重要的作用[6,7]。雖然文獻(xiàn)已經(jīng)報(bào)道有關(guān)CHI不同臨床階段患者外周血T細(xì)胞亞群分布，但CHI不同臨床階段患者外周血T細(xì)胞亞型變化尚不清楚。因此，本研究對(duì)外周血CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞亞型與HBV復(fù)制狀態(tài)進(jìn)行綜合分析，同時(shí)分析CHI患者外周血CD8+T細(xì)胞表面抑制性分子PD-1的表達(dá)水平，探尋T細(xì)胞亞型變化，對(duì)CHI的臨床分期診斷以及預(yù)測(cè)預(yù)后和轉(zhuǎn)歸可能具有重要意義。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1研究對(duì)象 選擇2019年10月至2020年1月就診于重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院感染科的CHI患者28例，同時(shí)納入10名健康志愿者。納入標(biāo)準(zhǔn)：①所有入選患者均符合2019年《慢性乙型肝炎防治指南》[3]的慢性HBV感染診斷標(biāo)準(zhǔn)；②入選患者近六個(gè)月均未接受過任何抗HBV病毒藥物或保肝治療；③患者及家屬均知情同意。排除標(biāo)準(zhǔn)：①其他原因如甲乙丙丁和戊型肝炎，藥物、酒精等其他原因所致的肝損害；②患者依從性差者。在納入的28例CHI患者中，男性15例，平均年齡(36.33±12.36)歲；女性13例，平均年齡(37.38±10.91)歲；53.6%的患者檢測(cè)到超過7 log10 copies/ml的HBV DNA拷貝數(shù)，全部為HBeAg陽性；32.1%的患者的HBV DNA拷貝數(shù)低于3 log10 copies/ml，全部為HBeAg陰性。參考2019年《慢性乙型肝炎防治指南》、根據(jù)研究對(duì)象的臨床癥狀，將28例研究對(duì)象劃分到HBV感染的不同階段。IT組10例，IA組5例，IC組8例，RA組5例。

1.1.2實(shí)驗(yàn)試劑與儀器 流式抗體CD3-PE、CD4-PC5.5、CD8-FITC、CD45RA-APC、CCR7-BV421、CD25-BV650、CD127-APC、PD-1-BV421及同型對(duì)照抗體IgG2b-APC、IgG2b-BV421、IgG1-BV650、IgG1-APC、IgG1-BV421均購(gòu)自Biolegend公司，Lymphopre TM淋巴細(xì)胞分離液購(gòu)自Stemcell公司，RPMI1640培養(yǎng)液購(gòu)自Sigma公司，達(dá)優(yōu)細(xì)胞凍存液購(gòu)自達(dá)科為公司。流式細(xì)胞儀Celesta購(gòu)自BD公司。

1.2方法

1.2.1臨床資料的收集 收集患者的臨床資料，包括年齡、性別等，由重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院檢驗(yàn)科檢測(cè)血清ALT、AST、HBV DNA拷貝數(shù)、乙肝兩對(duì)半定量等。

1.2.2血液標(biāo)本的采集和PBMC的提取 采集研究對(duì)象靜脈血5 ml于抗凝管中，搖勻，250 g離心10 min，收集血漿，凍存于-80℃冰箱。采用密度梯度離心法提取PBMC。將PBS緩沖液與血細(xì)胞按1∶1 比例混合，取等量的淋巴細(xì)胞分離液加至混合液底部，400 g離心30 min，收集液面下位于第二層的白色絮狀物，即PBMC，PBS緩沖液洗滌，300 g離心5 min，收集細(xì)胞并計(jì)數(shù)，凍存于液氮罐中。

1.2.3流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè) 檢測(cè)T細(xì)胞亞型頻率，實(shí)驗(yàn)管加入CD3-PE/CD4-PC5.5/CD8-FITC/CD45RA-APC/CCR7-BV421，同型對(duì)照管加入CD3-PE/CD4-PC5.5/CD8-FITC/IgG2b-APC/IgG2b-BV421。檢測(cè)CD4+CD25+CD127-Treg頻率及CD8+T細(xì)胞表面PD-1的表達(dá)量，實(shí)驗(yàn)管加入CD3-PE/CD4-PC5.5/CD8-FITC/CD25-BV650/CD127-APC/PD-1-BV421，同型對(duì)照管加入CD3-PE/CD4-PC5.5/CD8-FITC/IgG1-BV650/IgG1-APC/IgG1-BV421。充分混勻，室溫避光孵育20 min，清洗重懸，上機(jī)檢測(cè)。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS20.0 軟件和GraphPad Prism 8.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。分類資料采用χ2檢驗(yàn)。兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析。相關(guān)性分析采用Pearson線性相關(guān)分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1CHI不同臨床階段患者外周血CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞亞群頻率分析 與HD相比，CHI中CD3+T細(xì)胞頻率呈減少趨勢(shì)，但無顯著性差異；CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞頻率以及CD4/CD8比值均無顯著性差異。RA組CD3+T細(xì)胞百分比顯著降低(P<0.05)，而其他組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表1)。提示：CHI中RA期，CD3+T細(xì)胞百分比降低，免疫功能低下狀態(tài)，可能對(duì)CHI疾病進(jìn)展與預(yù)后預(yù)測(cè)具有重要意義。與RA期不同，IA組CD3+T細(xì)胞無顯著變化，但CD4+T細(xì)胞百分比呈減少趨勢(shì)，而CD8+T細(xì)胞百分比呈增高趨勢(shì)，CD4/CD8比值降低，可能為區(qū)分不同免疫狀態(tài)提供參考價(jià)值。

2.2CHI不同臨床階段患者外周血T細(xì)胞亞型及其與病毒載量的相關(guān)性分析 按功能和分化狀態(tài)，通常將T細(xì)胞可分為Tn、Tcm、Tem和Te。圖A顯示T細(xì)胞各亞型的檢測(cè)和分析。對(duì)于CD4+T細(xì)胞亞型，與HD相比，CHI中IT和RA組CD4+Tcm細(xì)胞百分比明顯增高(P<0.05)(圖1B)。對(duì)于CD8+T細(xì)胞亞型，與HD相比，CHI中IC、RA組CD8+Tn百分比下降(P<0.05)；IT組CD8+Tem百分比下降(P<0.05)，而IC組CD8+Te百分比顯著增高(P<0.001)。CHI中，IT、IA、IC、RA組，兩兩之間比較，與IT組相比，IC組CD8+Tn百分比降低，CD8+Te百分比增高(P<0.05)(圖1C)。分析CD8+T細(xì)胞各亞型與HBV DNA載量的關(guān)系，結(jié)果顯示相較于高病毒載量組，低病毒載量組的CD8+Tn百分比降低，而CD8+Te百分比顯著增高(P<0.05)(圖2)；CD8+Tem百分比無顯著變化(結(jié)果未顯示)。提示：病毒載量影響CD8+T細(xì)胞亞型百分比。病毒載量結(jié)合CD8+T細(xì)胞亞型的檢測(cè)對(duì)CHI疾病的分期及預(yù)后有參考價(jià)值。

與HD相比，CHI中各組患者外周血Treg頻率均呈增高趨勢(shì)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。CHI中IA組Treg頻率顯著升高，與HD及IC組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)(圖3A)。分析Treg頻率與HBV DNA、ALT、AST的相關(guān)性，結(jié)果顯示CHI中Treg頻率與ALT、AST呈正相關(guān)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(表2)。

圖1 外周血T細(xì)胞亞型分析Fig.1 Analysis of T cell subsets in PBMCs

2.3CHI不同臨床階段患者外周血PD-1+CD8+T細(xì)胞百分比分析 與HD相比，CHI中各組PD-1+CD8+T細(xì)胞百分比均顯著增高(P<0.05)；CHI中IT、IA、IC、RA組，兩兩之間比較，IA、IC組PD-1+CD8+T細(xì)胞百分比升高最為明顯，其次是RA組，與HD相比，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖3B)。

圖2 CD8+T細(xì)胞亞型與HBV DNA載量的關(guān)系Fig.2 Correlation between CD8+T cell subsets and HBV DNA load

圖3 CHI不同臨床階段Treg頻率及PD-1+CD8+T細(xì)胞百分比分析Fig.3 Analysis of frequencies of Treg and PD-1+CD8+T cells persentage from patients with CHI in different clinical stages

表1 CHI不同臨床階段患者外周血T細(xì)胞亞群分析

表2 慢性HBV感染患者Treg頻率與HBV DNA、ALT、AST的相關(guān)性分析

3 討論

人體感染HBV后病情嚴(yán)重程度及預(yù)后差異與宿主的免疫狀態(tài)密切相關(guān)[8]。其中，T細(xì)胞免疫在抗HBV感染中發(fā)揮重要作用。受到抗原刺激時(shí)，T細(xì)胞遵循從Tn向Tcm、Tem、Te等T細(xì)胞群體分化的漸進(jìn)過程[9-11]?？乖愋汀⒖乖考俺掷m(xù)時(shí)間及炎癥細(xì)胞因子環(huán)境等多種變化都會(huì)影響T細(xì)胞的分化水平和效應(yīng)功能[12,13]。Treg細(xì)胞和免疫抑制性分子如PD-1的表達(dá)，在CHI中也發(fā)揮著重要的免疫調(diào)節(jié)作用。Treg是一群具有免疫負(fù)調(diào)節(jié)作用的細(xì)胞群，能抑制CD4+T細(xì)胞對(duì)CD8+T細(xì)胞的輔助作用，還能通過分泌抑制性細(xì)胞因子非特異性抑制CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞的活化和增殖[14,15]。PD-1是免疫細(xì)胞表面表達(dá)的一種抑制性分子。PD-1表達(dá)量的增加，一方面能抑制T淋巴細(xì)胞增殖和功能，對(duì)減輕肝臟的炎癥反應(yīng)，防止肝臟細(xì)胞被大量破壞而引起的肝功能衰竭具有積極的作用，另一方面高表達(dá)PD-1的CD8+T細(xì)胞處于耗竭狀態(tài)促使HBV感染的慢性化[16]。

與HD比較，CHI患者外周血T細(xì)胞亞群的變化，文獻(xiàn)報(bào)道不一致[17-19]。與Wang等報(bào)道一致，我們的研究結(jié)果顯示，與HD相比，CHI的T細(xì)胞亞群無顯著差異。因此，CD3+T細(xì)胞的百分比對(duì)CHI的免疫功能狀態(tài)評(píng)估和參考尚需要大樣本分析明確其價(jià)值和意義。而在CHI中的RA組CD3+T細(xì)胞百分比明顯下降，但CD4+T細(xì)胞呈上升趨勢(shì)，Treg頻率明顯升高；CD8+T細(xì)胞百分比變化不顯著，但PD-1+CD8+T細(xì)胞百分比明顯增加。這些提示RA期免疫功能處于抑制狀態(tài)。因此，CD3+T細(xì)胞百分比下降、Treg和PD-1+CD8+T細(xì)胞頻率升高，為CHI處于RA期診斷提供參考。同時(shí)RA期免疫功能處于低下狀態(tài)，預(yù)示疾病發(fā)展進(jìn)程及預(yù)后轉(zhuǎn)歸不良。

與Gu等[19]報(bào)道相符，結(jié)果顯示，IA組CD4+T細(xì)胞百分比呈下降趨勢(shì)，但Treg頻率明顯上升，且與ALT水平正相關(guān)；CD8+T細(xì)胞百分比呈上升趨勢(shì)，PD-1+CD8+T細(xì)胞百分比顯著上升；CD4/CD8比值明顯減小，提示機(jī)體細(xì)胞免疫功能處于活躍狀態(tài)，可能預(yù)測(cè)肝臟炎癥的嚴(yán)重程度。與RA期免疫功能狀態(tài)不同，IA期CD3+T細(xì)胞頻率沒有明顯減少，但是CD4/CD8比值變化明顯，這些表明RA期與IA期的免疫功能處于不同狀態(tài)，臨床疾病預(yù)后與轉(zhuǎn)歸不同。

IT組HBV DNA載量最高，與HD相比，CD8+Tem細(xì)胞百分比明顯下降。Tem是CHI患者病毒特異性CD8+T細(xì)胞的主要T細(xì)胞亞型[20]。CD8+Tem細(xì)胞百分比的降低提示T細(xì)胞免疫功能缺乏和(或)功能不足，是導(dǎo)致CHI患者發(fā)生免疫耐受(IT)的重要原因。因此，CD4+Tem和CD8+Tem細(xì)胞百分比下降和病毒載量異常升高提示CHI的免疫耐受狀態(tài)(IT)。我們結(jié)果發(fā)現(xiàn)低病毒載量的IC組CD8+Te百分比較高，提示CD8+Te清除病毒能力較強(qiáng)的免疫功能狀態(tài)。因此，低病毒載量結(jié)合Te升高提示CHI處于IC期，預(yù)測(cè)疾病良好的預(yù)后和轉(zhuǎn)歸。

通常T細(xì)胞高表達(dá)PD-1，一方面提示T細(xì)胞活化狀態(tài)，另一方面也提示T細(xì)胞走向耗竭趨勢(shì)即免疫功能耗竭。我們的研究顯示：CHI組的PD-1+CD8+T細(xì)胞頻率高于HD，提示病理狀態(tài)下的免疫功能處于活躍狀態(tài)清除病毒，病毒載量下降如IA和IC期；另一方面，免疫功能處于抑制狀態(tài)，病毒大量復(fù)制或持續(xù)波動(dòng)狀態(tài)如IT和RA期。所以，通過PD-1+CD8+T細(xì)胞的百分比結(jié)合病毒載量可能輔助預(yù)測(cè)臨床免疫狀態(tài)和臨床分期。

雖然，我們的研究未能追蹤同一個(gè)患者的慢性HBV感染不同臨床階段的免疫狀態(tài)，同時(shí)樣本量少尚有待擴(kuò)大樣本深入研究。但我們納入了CHI不同臨床階段患者，綜合分析了CHI患者外周血T細(xì)胞、Treg及PD-1的表達(dá)變化，在一定程度上能提示疾病進(jìn)展過程中的T細(xì)胞免疫分化情況，對(duì)臨床了解慢性HBV感染疾病的發(fā)展，開展合理的免疫治療具有重要意義。

總之，我們的研究指出CHI不同臨床階段患者外周血T細(xì)胞亞型有顯著性差異，低病毒載量的IC組CD8+Te細(xì)胞頻率顯著增高，提示疾病的良好預(yù)后轉(zhuǎn)歸。CHI中CD8+T細(xì)胞表面PD-1的表達(dá)量增加，提示機(jī)體兩種不同的免疫狀態(tài)，預(yù)測(cè)疾病不同的免疫轉(zhuǎn)歸。Treg頻率與機(jī)體ALT水平呈正相關(guān)，提示可用于預(yù)測(cè)肝炎疾病的嚴(yán)重程度。聯(lián)合檢測(cè)CHI患者T細(xì)胞免疫狀態(tài)，對(duì)慢性HBV感染疾病的分期診斷和治療以及預(yù)測(cè)預(yù)后轉(zhuǎn)歸具有重要參考意義。