朱茜文 安海燕 張亞平

(平頂山市第二人民醫(yī)院呼吸內(nèi)科,平頂山 467000)

肺癌是世界范圍內(nèi)患病率較高的癌癥之一，根據(jù)腫瘤細胞微觀形態(tài)， 可分為小細胞肺癌(small cell lung cancer,SCLC)和非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)。NSCLC是肺癌最主要的類型，占比超過85%[1]。盡管NSCLC治療取得了一定進展，但很多NSCLC患者確診時已是晚期，只有不到18%患者存活超過5年[2]。miRNA是一類短鏈非編碼RNA，通過轉錄后調(diào)控，在細胞增殖、分化、凋亡等生物學過程中扮演重要角色，在人類疾病中起重要作用，已有研究報道不同miRNA在包括NSCLC在內(nèi)的各種癌癥中起促癌或抑癌的作用，具有作為癌癥生物標志物和治療靶點的應用前景[3-5]。miR-363-3p是近年鑒定出的腫瘤抑制基因，在包括肝癌、乳腺癌、胃癌、直腸結腸癌等諸多癌癥中均報道其通過靶向作用于關鍵基因調(diào)控腫瘤生長和轉移。文獻報道m(xù)iR-363-3p在肺癌中可通過靶向作用于增殖細胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)抑制腫瘤生長，但作用機制尚不明確[6]。本研究通過培養(yǎng)人NSCLC細胞A549，并轉染miR-363-3p和磷脂酰肌醇激酶-3催化亞單位(phosphatidylinositol 3-kinase catalytic alpha polypeptide gene,PIK3CA)過表達載體，從細胞水平初步探究NSCLC細胞中miR-363-3p與PIK3CA的調(diào)控關系及作用機制。

1 材料與方法

1.1材料 DMEM細胞培養(yǎng)液、胎牛血清購自美國Hyclone公司，lipofectamine 2000購自美國Thermo Fisher公司，青鏈霉素、Trizol試劑、RIPA試劑、CCK8試劑購自上海碧云天生物技術研究所，BCA試劑盒購自北京全式金生物技術有限公司，miR-363-3p mimic、陰性對照mimic、PIK3CA重組表達載體(pcDNA 3.1-PIK3CA,pc-PIK3CA)由上海吉瑪制藥技術有限公司合成，所用引物由上海生工生物公司合成，反轉錄試劑盒和SYBR Green PCR Master Mix購自日本Takara公司，熒光素酶報告系統(tǒng)購自美國Promega公司，PIK3CA、E-cadherin、N-cadherin、Cyclin D1蛋白、AKT、p-AKT抗體購自英國Abcam公司。人NSCLC細胞A549細胞株購自美國ATCC公司。

1.2方法

1.2.1細胞培養(yǎng) 在加入10%胎牛血清、100 mg/ml鏈霉素、100 U/ml青霉素的DMEM細胞培養(yǎng)液中培養(yǎng)細胞，培養(yǎng)條件為5%CO2、37℃。

1.2.2分組及處理方法 細胞分為mimic NC、miR-363-3p、pc-PIK3CA、miR-363-3p+pc-PIK3CA組，根據(jù)lipofectamine 2000說明書，陰性對照mimic轉染mimic NC組細胞，miR-363-3p轉染miR-363-3p組細胞，pc-PIK3CA轉染pc-PIK3CA組細胞，miR-363-3p和pc-PIK3CA共轉染miR-363-3p+pc-PIK3CA組細胞，轉染24 h，用于后續(xù)實驗。

1.2.3RT-PCR檢測 Trizol試劑提取細胞或組織RNA，反轉錄獲得cDNA，按照SYBR Green PCR Master Mix試劑盒說明書檢測mRNA及miRNA水平，擴增條件為95℃預變性2 min，95℃ 5 s、60℃ 10 s，40個循環(huán)，2-ΔΔCt法計算RNA相對表達水平。

1.2.4熒光素酶報告基因?qū)嶒?根據(jù)生物信息學預測，擴增PIK3CA 3′-UTR區(qū)域，構建pGL3 luciferase promoter野生型(WT)和突變型(MUT)載體，載體和miR-363-3p或陰性對照mimic成功轉染HEK293細胞，轉染48 h后按照雙熒光素酶報告分析試劑盒說明書檢測熒光素酶活性。

1.2.5Western blot檢測 RIPA試劑提取細胞總蛋白并通過BCA試劑盒定量，30 μg/孔點樣，10 % SDS-PAGE電泳分離蛋白，半干轉膜法轉膜，5%脫脂牛奶室溫封閉2 h，加入適量一抗4℃孵育過夜，PBS清洗后加入二抗室溫孵育2 h，ECL顯影。

1.2.6CCK8法檢測細胞增殖 常規(guī)條件培養(yǎng)細胞，每隔1 d CCK8試劑測定細胞增殖倍數(shù)，連續(xù)3 d。將細胞接種于96孔板，10 μl/孔加入CCK8試劑處理4 h，酶標儀測定450 nm吸光值。

1.2.7劃痕愈合法檢測細胞遷移 細胞接種于6孔板，培養(yǎng)細胞至鋪滿板底80%后，中槍頭對細胞垂直水平畫線并通過PBS清洗，常規(guī)培養(yǎng)環(huán)境下繼續(xù)培養(yǎng)24 h后觀察拍照。

1.2.8Transwell法檢測細胞侵襲 Transwell小室加入50 μl基質(zhì)膠并于37℃凝固，上室加入無血清培養(yǎng)液，下室加入完全培養(yǎng)液，將細胞接種于小室上室，常規(guī)條件下培養(yǎng)48 h，清洗掉未過膜的細胞，多聚甲醛固定剩余細胞，結晶紫染色觀察拍照。

2 結果

2.1腫瘤組織中miR-363-3p表達量下調(diào) 對20例正常肺組織和NSCLC組織臨床樣本進行檢測，與正常肺組織相比，NSCLC組織中miR-363-3p表達水平顯著降低(P<0.01)，提示miR-363-3p可能參與NSCLC發(fā)展進程，見圖1A。

2.2腫瘤組織中PIK3CA和miR-363-3p表達相關性 與正常肺組織相比，NSCLC組織PIK3CA mRNA水平顯著升高(P<0.01)，見圖1B。Spearman相關分析表明miR-363-3p和PIK3CA基因表達水平呈負相關，見圖2。

2.3miR-363-3p靶向作用于PIK3CA 根據(jù)生物信息學分析預測miR-363-3p和PIK3CA靶向作用位點，與WT PIK3CA+mimic NC組相比，WT PIK3CA+miR-363-3p組熒光素酶活性顯著降低(P<0.01)，MUT PIK3CA+mimic NC組和MUT PIK3CA+miR-363-3p組差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見圖3。

2.4miR-363-3p抑制PIK3CA基因表達 與A549空白對照組比較，mimic NC組中miR-363-3p表達差異無統(tǒng)計學意義，與mimic NC組相比，miR-363-3p組miR-363-3p表達水平顯著升高(P<0.01)，表明A549細胞成功轉染miR-363-3p。與mimic NC組比較，miR-363-3p組細胞PIK3CA基因表達顯著降低(P<0.01)，pc-PIK3CA組細胞PIK3CA基因表達顯著升高(P<0.01)；與pc-PIK3CA組相比，miR-363-3p+pc-PIK3CA組細胞PIK3CA基因表達顯著降低(P<0.01)，見圖4。與mimic NC組相比，miR-363-3p組PIK3CA蛋白表達顯著降低(P<0.01)，pc-PIK3CA組PIK3CA蛋白表達顯著升高(P<0.01)；與pc-PIK3CA組相比，miR-363-3p+pc-PIK3CA組PIK3CA蛋白表達顯著降低(P<0.01),見圖5。

圖1 RT-PCR檢測正常肺組織、NSCLC組織miR-363-3p、PIK3CA表達Fig.1 Expressions of miR-363-3p and PIK3CA in normal tissues and NSCLC tissues by RT-PCR

圖2 NSCLC組織miR-363-3p和PIK3CA基因表達相關性分析Fig.2 Correlation analysis of miR-363-3p and PIK3CA gene expressions in NSCLC tissues

2.5miR-363-3p抑制腫瘤細胞增殖 與mimic NC組相比，miR-363-3p組A549細胞增殖水平顯著降低，pc-PIK3CA組細胞增殖水平顯著升高(P<0.01)；與pc-PIK3CA組相比，miR-363-3p+pc-PIK3CA組細胞增殖水平顯著降低(P<0.01)，見圖6。

圖3 熒光素酶報告實驗檢測miR-363-3p和PIK3CA靶向關系Fig.3 Relationship between miR-363-3p and PIK3CA by luciferase reporter assay

圖4 RT-PCR檢測A549細胞miR-363-3p、PIK3CA mRNA表達水平Fig.4 Expression level of miR-363-3p in A549 cells by RT-PCR

圖5 Western blot檢測A549細胞PIK3CA蛋白表達Fig.5 Protein expression of PIK3CA in A549 cells by Western blot

圖6 CCK8法檢測A549細胞增殖倍數(shù)Fig.6 CCK8 assays for measuring cell growth of A549 cells

圖7 劃痕愈合法檢測A549細胞遷移能力Fig.7 Wound healing test for migration ability of A549 cells

2.6miR-363-3p抑制腫瘤細胞侵襲和遷移 與mimic NC組相比，miR-363-3p組A549細胞劃痕愈合率和侵襲細胞數(shù)目均顯著降低，pc-PIK3CA組顯著升高(P<0.01)；與pc-PIK3CA組相比，miR-363-3p+pc-PIK3CA組細胞劃痕愈合率和侵襲細胞數(shù)目顯著降低(P<0.01)，見圖7,8。

圖8 Transwell檢測A549細胞侵襲能力Fig.8 Transwell test for invasion ability of A549 cells

圖9 Western blot檢測A549細胞增殖、轉移及PI3K/AKT通路關鍵蛋白表達Fig.9 Western blot for protein expression of and PI3K/AKT pathway proliferation,metastasis in A549 cells

2.7miR-363-3p對增殖和轉移相關蛋白及PI3K/AKT信號通路蛋白表達的調(diào)控 與mimic NC組相比，miR-363-3p組A549細胞E-cadherin蛋白表達顯著升高，N-cadherin、Cyclin D1蛋白表達顯著降低，p-AKT/AKT比率顯著降低(P<0.01)，pc-PIK3CA組A549細胞E-cadherin蛋白表達顯著降低，N-cadherin、Cyclin D1蛋白表達顯著升高，p-AKT/AKT比率顯著升高(P<0.01)；與pc-PIK3CA組比較，miR-363-3p+pc-PIK3CA組A549細胞E-cadherin蛋白表達顯著升高，N-cadherin、Cyclin D1蛋白表達顯著降低，p-AKT/AKT比率顯著降低(P<0.01)，見圖9。

3 討論

磷脂酰肌醇3-激酶(phosphoinositide 3-kinases,PI3Ks)家族來源于細胞內(nèi)的磷脂酰肌醇激酶家族，可分為3個類型，其中研究最多的是Ⅰ類PI3K，可在體內(nèi)催化4,5-二磷酸磷脂酰肌醇轉化為3,4,5-三磷酸磷脂酰肌醇(phosphatidylinositol (3,4,5)-trisphosphate,PIP3)，在細胞增殖、生長、運動、代謝、生存及炎癥反應等生理過程中起關鍵作用[7,8]。I類PI3K是異源二聚體，由調(diào)節(jié)亞基p85和催化亞基p110組成，p85亞基包含SH2和SH3結構域，在缺乏激活信號時，p85抑制p110催化活性，當包含對應結合位點的受體酪氨酸激酶或接頭蛋白與p85相互作用，使PI3K被募集到質(zhì)膜部位，p110催化活性抑制被解除，參與PIP3催化合成[9]。PIK3CA基因編碼Ⅰ類PI3K的p110催化p110α，在包括NSCLC在內(nèi)的各種癌癥中均有起促癌作用[10-12]。miR-363-3p是新鑒定出的腫瘤抑制miRNA，Wang等[6]報道m(xù)iR-363-3p在肺腺癌中的抑癌作用，Liu等[13]報道 miR-363-3p可通過靶向作用于PIK3CA，抑制乳頭狀甲狀腺癌的增殖，推測在NSCLC中miR-363-3p的抑癌作用與PIK3CA相關。本研究對臨床NSCLC樣本進行檢測，發(fā)現(xiàn)miR-363-3p在NSCLC組織中表達下調(diào)，PIK3CA基因表達上調(diào)，且密切相關。同時，熒光素酶報告基因?qū)嶒炞C實miR-363-3p與PIK3CA的靶向作用，表明miR-363-3p可通過靶向作用于PIK3CA抑制PIK3CA表達。此外，本研究進一步構建PIK3CA過表達細胞株，并對細胞中的基因和蛋白表達進行檢測，發(fā)現(xiàn)miR-363-3p可顯著降低PIK3CA的基因和蛋白表達，與之前結果相符。

PI3K/AKT信號通路在調(diào)節(jié)細胞生長代謝中發(fā)揮關鍵作用，在各種癌癥中PI3K/AKT信號通路都可能發(fā)生異激活，因此該通路在腫瘤治療中常被作為靶向治療位點之一[14,15]。當PI3K誘發(fā)PIP3生成后，PIP3與細胞內(nèi)包含PH結構域的AKT和磷脂酰激酶依賴性蛋白激酶1(phosphoinositide dependent kinase-1,PDK1)結合，參與誘導AKT激活，活化的AKT可通過磷酸化下游因子，調(diào)控增殖、凋亡及遷移等一系列細胞生長過程[16]。研究表明PIK3CA可通過PI3K/AKT信號通路促進NSCLC細胞增殖、侵襲與遷移，而部分miRNA如miR-1、miR-142-5p可通過靶向作用于PIK3CA抑制腫瘤生長[12,17]。本研究發(fā)現(xiàn)miR-363-3p可顯著抑制AKT激活，并抑制NSCLC細胞的增殖、侵襲與遷移，PIK3CA過表達可抵消miR-363-3p對NSCLC細胞的影響。同時，miR-363-3p可顯著降低N-cadherin和Cyclin D1表達，提升E-cadherin表達，PIK3CA可抵消miR-363-3p對以及蛋白表達的影響。E-cadherin主要介導細胞間黏附反應，維持上皮細胞形態(tài)，N-cadherin主要存在于間葉細胞，與E-cadherin作用相反，兩者常用作衡量腫瘤細胞轉移能力的標志物[18]。Cyclin D1是細胞周期的調(diào)控基因，其表達與細胞周期的轉換時間相關，可反映細胞增殖水平[19]。上述實驗結果表明miR-363-3p可通過下調(diào)PIK3CA表達，抑制NSCLC細胞增殖、侵襲和轉移。

綜上所述，miR-363-3p可靶向作用于PIK3CA降低PIK3CA表達，抑制PI3K/AKT信號通路激活，從而抑制NSCLC細胞增殖、侵襲和遷移。本研究從細胞水平初步探究NSCLC中miR-363-3p對PIK3CA的靶向作用及其對NSCLC細胞的影響，尚存不足，需要通過移植腫瘤動物模型等方法進一步驗證miR-363-3p在體內(nèi)的作用。