亢瑞娜 何國(guó)莉 黃靚妹 劉曉霞 李君蕊

(唐山市工人醫(yī)院感染性疾病科，唐山 063000)

肺炎是終末氣道、肺泡和肺間質(zhì)炎癥統(tǒng)稱(chēng)，致病因素包括細(xì)菌、病毒、真菌、寄生蟲(chóng)等微生物及放射線、異物吸入等?？死撞畻U菌是細(xì)菌性肺炎常見(jiàn)致病菌，高發(fā)于嬰幼兒，危及嬰幼兒生命安全。肺炎患者體內(nèi)存在大量炎癥細(xì)胞因子和纖維，形成肺部機(jī)械損傷和宿主炎癥介質(zhì)、細(xì)胞因子激活釋放的惡性循環(huán)。因此，肺炎治療第一要?jiǎng)?wù)為抗炎。穿心蓮內(nèi)酯是從植物穿心蓮葉片中提取得到的二萜內(nèi)酯，具有抗炎抗菌、保肝、抗腫瘤、抗氧化和增強(qiáng)免疫等作用，廣泛應(yīng)用于各種炎癥性疾病，如關(guān)節(jié)炎、神經(jīng)炎、椎間盤(pán)退變等[1-9]?；罨疊細(xì)胞的核因子kappa輕鏈增強(qiáng)子(NF-κB)信號(hào)通路是炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵介質(zhì)，誘導(dǎo)各種促炎基因表達(dá)，包括編碼細(xì)胞因子和趨化因子的基因[10]。研究表明穿心蓮內(nèi)酯抗炎活性與靶向TLR4/NF-κB信號(hào)通路有關(guān)，可能成為炎癥的防治藥物[6,9,11-13]。本研究采用氣管滴入克雷伯桿菌的方法建立大鼠肺炎模型，研究穿心蓮內(nèi)酯對(duì)大鼠的抗炎作用及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)雄性SD大鼠60只，體質(zhì)量180～220g，購(gòu)自北京維通利華公司，合格證號(hào)：SCXK (京) 2014-0001。飼養(yǎng)于無(wú)菌環(huán)境，26℃～28℃，50%～60%濕度，自由采食高壓滅菌水和無(wú)菌飼料，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.1.2試劑與儀器 穿心蓮內(nèi)酯粉末購(gòu)自Sigma公司；TRIzol試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒和熒光定量試劑盒購(gòu)自美國(guó)ThermoFisher公司；HE染色試劑盒、Masson染色試劑盒均購(gòu)自南京建成生物工程研究所；一抗、二抗均購(gòu)自英國(guó)Abcam公司；ECL化學(xué)發(fā)光液購(gòu)自Invitrogen公司；ELISA試劑盒購(gòu)自美國(guó)RB公司； BCA蛋白定量試劑盒購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所；肺炎克雷伯桿菌(1.5×109cfu/ml)購(gòu)自重慶醫(yī)科大微生物學(xué)教研室。PCR儀、電泳儀及半干轉(zhuǎn)膜儀購(gòu)自美國(guó)伯樂(lè)公司；Gel View 6000凝膠成像系統(tǒng)購(gòu)自廣州云星儀器有限公司；多功能酶標(biāo)儀購(gòu)自瑞士TECAN公司；普通光學(xué)顯微鏡購(gòu)自日本奧林巴斯公司。

1.2方法

1.2.1分組及給藥 大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組(Control組)、模型組(Klebsiella組)、Kleb+Adnro(2.5 mg)組、Kleb+Adnro(5 mg)組和Kleb+Adnro(10 mg)組，每組12只。穿心蓮內(nèi)酯配制成10 mg/ml儲(chǔ)存液，給藥時(shí)稀釋成0.25、0.5和1 mg/ml分別作為低、中、高劑量組。給藥組自造模前1 d腹腔注射10 ml/kg 穿心蓮內(nèi)酯，對(duì)照組和模型組腹腔注射等體積滅菌生理鹽水，連續(xù)7 d。給藥結(jié)束后，眼眶采血后脫頸椎處死大鼠，取血清和肺臟進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2建模 參考文獻(xiàn)[7]，10 %水合氯醛麻醉大鼠，無(wú)菌切開(kāi)頸部皮膚，暴露上段氣管，經(jīng)氣管滴入0.15 ml菌液后豎直固定1 min，對(duì)照組滴入等體積生理鹽水。

1.2.3W/D值測(cè)定 取大鼠右肺中葉用預(yù)冷的PBS充分洗滌，吸水紙去除水分，稱(chēng)量濕重(W)。80℃干燥48 h，稱(chēng)量干重(D)，計(jì)算W/D。

1.2.4HE染色和Masson染色 將左肺用預(yù)冷的PBS充分洗滌，10 %中性福爾馬林固定，脫水、透明、浸蠟和包埋，制成5 μm切片。行HE和Masson染色，光學(xué)顯微鏡下觀察肺臟病理學(xué)改變和纖維化情況。

1.2.5Western blot檢測(cè)Caspase-3、Caspase-9、NF-κB p65和IκBα表達(dá) RIPA蛋白裂解液于冰上提取各組肺組織總蛋白，BCA試劑盒檢測(cè)各組蛋白濃度并調(diào)平。每組取等量蛋白質(zhì)用12%SDS-PAGE分離，轉(zhuǎn)移至PVDF膜。5%脫脂牛奶室溫封閉2 h，加入一抗，4℃孵育過(guò)夜。棄去一抗，緩沖液清洗PVDF膜，加入對(duì)應(yīng)二抗，室溫封閉1 h，滴加ECL于暗室曝光顯影。以GAPDH或LAMIN A為內(nèi)參。

1.2.6ELISA檢測(cè)大鼠血清TNF-α、IL-1β和IL-6的含量 眼眶靜脈叢取血，4℃下3 000 r/min離心10 min，收集上清保存于-80℃?zhèn)溆谩?yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。

1.2.7RT-PCR檢測(cè)NF-κB p65和IκB表達(dá) Trizol試劑提取各組大鼠肺臟組織總RNA，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，PCR擴(kuò)增，熒光定量PCR試劑盒檢測(cè)cDNA。

2 結(jié)果

2.1穿心蓮內(nèi)酯減輕肺炎大鼠肺臟損傷 與對(duì)照組相比，模型組大鼠右肺W/D值明顯增加(P<0.05)，而穿心蓮內(nèi)酯治療組大鼠右肺濕重/干重比值與模型組相比明顯降低(P<0.05)，見(jiàn)圖1A。

對(duì)照組大鼠肺組織結(jié)構(gòu)基本完整，未見(jiàn)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)或間質(zhì)增厚；模型組出現(xiàn)包括肺泡塌陷、肺泡壁厚度增加、間質(zhì)水腫、充血，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)和成纖維細(xì)胞間質(zhì)浸潤(rùn)等組織病理學(xué)改變；給藥劑量增加，穿心蓮內(nèi)脂治療組大鼠肺組織病理學(xué)改變及纖維化程度隨之改善，提示建模成功，見(jiàn)圖1B。

對(duì)照組大鼠肺泡結(jié)構(gòu)正常，未見(jiàn)明顯病理變化；與對(duì)照組相比，模型組大鼠肺泡結(jié)構(gòu)破壞嚴(yán)重，肺泡腔基本消失，藍(lán)色膠原纖維呈彌漫性增生沉積；給藥組大鼠仍有肺泡結(jié)構(gòu)，膠原纖維沉積較模型組明顯減輕，且與給藥劑量呈負(fù)相關(guān)，提示建模成功，見(jiàn)圖1C。

圖1 穿心蓮內(nèi)酯對(duì)肺炎大鼠肺臟損傷的影響(×200)Fig.1 Effects of Andro on lung injury in pneumonia rats(×200)

圖2 穿心蓮內(nèi)酯對(duì)肺炎大鼠凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響Fig.2 Effect of Andro on expressions of apoptosis-related proteins in pneumonia rats

2.2穿心蓮內(nèi)酯減少大鼠凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平 與對(duì)照組相比，模型組大鼠高表達(dá)裂解形式的Caspase-3和Caspase-9(P<0.05)，穿心蓮內(nèi)脂治療組蛋白表達(dá)水平較模型組明顯下調(diào)(P<0.05)，且呈劑量依賴性，見(jiàn)圖2。

2.3穿心蓮內(nèi)酯降低肺炎模型大鼠炎癥反應(yīng) 與對(duì)照組相比，模型組大鼠炎癥細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β和IL-6血清表達(dá)水平均明顯上調(diào)(P<0.05)；與模型組相比，穿心蓮內(nèi)酯治療組炎癥因子水平隨給藥劑量增加而下降(P<0.05)，見(jiàn)圖3。

圖3 穿心蓮內(nèi)酯對(duì)肺炎大鼠血清炎癥細(xì)胞因子含量的影響Fig.3 Effect of Andro on concentration of inflammatory cytokines in serum of pneumonia rats

圖4 穿心蓮內(nèi)酯對(duì)肺炎大鼠IκBα和NF-κB p65磷酸化水平的影響Fig.4 Effects of Andro on phosphorylation of IκBα and NF-κB p65 in pneumonia rats

2.4穿心蓮內(nèi)酯抑制肺炎大鼠IκBα和NF-κB p65磷酸化激活 與對(duì)照組相比，模型組大鼠p-IκBα和p-NF-κB p65 mRNA表達(dá)水平明顯上調(diào)(P<0.05)；經(jīng)穿心蓮內(nèi)酯治療后，mRNA表達(dá)水平明顯下調(diào)(P<0.05)，且與給藥劑量呈負(fù)相關(guān)。Western blot檢測(cè)結(jié)果與RT-PCR類(lèi)似，證明穿心蓮內(nèi)酯能下調(diào)IκBα和NF-κB p65磷酸化水平，從而抑制該通路的激活，見(jiàn)圖4。

3 討論

克雷伯桿菌是最早被發(fā)現(xiàn)的能引起肺炎的革蘭氏陰性桿菌，克雷伯桿菌肺炎因其并發(fā)癥高耐藥性而威脅公共衛(wèi)生安全[14]。段爭(zhēng)等[15]研究認(rèn)為PM2.5暴露。降低肺臟對(duì)細(xì)菌的清除能力，加重炎癥反應(yīng)，增加大鼠肺臟對(duì)細(xì)菌、病毒等的敏感性，使條件致病菌成為致病菌。當(dāng)致病菌到達(dá)下呼吸道時(shí)，肺泡毛細(xì)血管發(fā)生滲透性水腫、充血、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)及纖維沉積等，因此，課題組采用氣管滴入克雷伯桿菌的方法構(gòu)建肺炎模型，測(cè)量大鼠肺臟W/D比值，HE和Masson染色結(jié)果證明肺炎模型建立成功。本文研究也證實(shí)穿心蓮內(nèi)酯能有效緩解肺臟病理?yè)p傷和纖維化，與具有強(qiáng)大抗炎活性的碧蘿芷(松樹(shù)皮萃取物)通過(guò)抑制NF-κB介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)改善肺損傷相似[16]。

炎癥性疾病的病理特征是細(xì)胞過(guò)度凋亡和促炎因子產(chǎn)生，許多天然化合物在抗細(xì)胞凋亡和/或炎癥干預(yù)上表現(xiàn)出生物學(xué)活性，如碧蘿芷、丹參酚酸B、牛蒡子苷元等，穿心蓮內(nèi)酯在干預(yù)炎癥和凋亡性疾病中作用明顯。在體內(nèi)體外實(shí)驗(yàn)中均表現(xiàn)出抗凋亡作用[9，16-18]。體外培養(yǎng)小鼠T細(xì)胞，穿心蓮內(nèi)酯在不影響細(xì)胞活性的情況下通過(guò)抑制細(xì)胞凋亡和炎癥細(xì)胞因子釋放發(fā)揮有效的免疫抑制作用，在膿毒癥小鼠模型中，能通過(guò)減少心肌細(xì)胞凋亡等機(jī)制減輕脂多糖誘導(dǎo)的心臟功能紊亂[19，20]。本研究表明穿心蓮內(nèi)酯能降低肺炎大鼠凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3和Caspase-9表達(dá)，下調(diào)炎癥細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β和IL-6的血清表達(dá)水平，這可能與大鼠肺部細(xì)菌清除增加有關(guān)，有效改善大鼠肺部病理學(xué)。

NF-κB是調(diào)節(jié)炎癥最重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，激活的NF-κB可轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核并與促炎基因啟動(dòng)子結(jié)合，導(dǎo)致基因表達(dá)增強(qiáng)和炎癥反應(yīng)擴(kuò)增，從而導(dǎo)致炎癥損傷。因此，阻斷NF-κB轉(zhuǎn)錄活性可能是治療炎癥的重要靶點(diǎn)[21-23]。脂多糖誘導(dǎo)的髓核變性研究發(fā)現(xiàn)，穿心蓮內(nèi)酯治療后，細(xì)胞凋亡率、炎癥介質(zhì)表達(dá)均明顯降低，其機(jī)制與抑制NF-κB途徑密切相關(guān)[9]。穿心蓮內(nèi)酯能顯著抑制促炎細(xì)胞因子IL-1β對(duì)髓核細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用，明顯抑制Toll樣受體(TLRs)、髓系分化因子88(MYD88)激活和NF-κB核易位[12]。本研究觀察到克雷伯桿菌肺炎大鼠肺組織NF-κB p65和其抑制蛋白IκBα的mRNA和蛋白水平顯著升高，穿心蓮內(nèi)酯可抑制兩者表達(dá)。

綜上所述，穿心蓮內(nèi)酯能降低克雷伯桿菌肺炎大鼠肺臟W/D比值，緩解肺組織充血、水腫、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)和膠原沉積，改善肺組織形態(tài)和纖維化情況，抑制血清TNF-α、IL-1β和IL-6表達(dá)，并抑制NF-κB p65和IκBα磷酸化水平。穿心蓮內(nèi)酯通過(guò)抑制TLR4/NF-κB信號(hào)通路活化，改善克雷伯桿菌肺炎大鼠的肺臟病理?yè)p傷和免疫功能紊亂，為穿心蓮內(nèi)酯治療細(xì)菌性肺炎提供參考。