王 勝 陳永平 呂敬龍 李 穎 劉 林

(重慶醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院血液科，重慶 400016)

原發(fā)性骨髓纖維化(primary myelofibrosis，PMF)是一類慢性骨髓增生性疾病，造血干細胞惡性克隆伴隨著繼發(fā)性的骨髓纖維化和髓外造血[1,2]，其中骨髓纖維化病變通常是由于骨髓成纖維細胞的惡性增殖并產生大量膠原蛋白引起的。PMF發(fā)病機制十分復雜[3]，前期研究表明，JAK2(janus kinase 2)和血小板生成素受體(thrombopoietin receptor，MPL)的突變與PMF發(fā)病密切相關[4-6]。造血干細胞中持續(xù)性激活的JAK/STAT3信號通路會引起巨核細胞(megakaryocyte)異常增殖，并分泌轉化生子因子-β(transforming growth factor beta，TGF-β)、血小板衍生生長因子(platelet derived growth factor，PDGF)和纖維母細胞生長因子(fibroblast growth factor，F(xiàn)GF)，其中，TGF-β可以誘發(fā)骨髓成纖維細胞的惡性增殖，促進Ⅰ型、Ⅱ型等膠原蛋白的表達和分泌，引起骨髓纖維化及骨硬化[7,8]。但PMF疾病中，是否有其他細胞來源的TGF-β也參與骨髓纖維化進展尚不清楚。

巨噬細胞是一類固有免疫吞噬細胞，在炎癥反應中浸潤炎癥部位，并通過分泌炎癥細胞因子如TGF-β、IL-1β和IL-6調控炎癥反應的發(fā)生，在肝臟、肺纖維化疾病中發(fā)揮重要作用[9]，然而其在PMF疾病進展中的功能還缺乏研究。本研究利用小鼠原代骨髓巨噬細胞和骨髓成纖維細胞，發(fā)現(xiàn)了巨噬細胞來源的TGF-β可以促進骨髓成纖維細胞的增殖及Ⅰ型膠原的表達。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1試劑和材料 主要試劑：RPMI1640培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)購自ThermoFisher Scientific；抗TGF-β抗體(1D11)、重組人TGF-β蛋白、重組小鼠M-CSF蛋白購自R&D；TGF-β酶聯(lián)免疫吸附實驗試劑盒購自PeproTech；Ⅰ型膠原酶聯(lián)免疫吸附實驗試劑盒購自Abcam；脂多糖(LPS)、紅細胞裂解液、二甲基亞砜(DMSO)、MTT購自Sigma。

1.1.2實驗動物 8～12周齡的SPF級C57BL/6雄性小鼠購自北京維通利華公司，小鼠飼養(yǎng)于SPF屏障設施內。

1.2方法

1.2.1小鼠骨髓成纖維細胞和骨髓來源巨噬細胞的分離及培養(yǎng) 引頸處死小鼠，分離其脛骨和股骨，并剪去骨末端，用磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗骨髓，并用移液器反復吹打數次，使用40 μm孔徑細胞濾器過濾，得到的骨髓細胞進行如下操作：將骨髓細胞直接接種于含有20% FBS的RPMI1640培養(yǎng)基中，置于37℃ CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，換液去除未貼壁細胞，并繼續(xù)使用含有10% FBS RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)至細胞匯合度達到85%～95%，得到骨髓成纖維細胞；或將骨髓細胞接種于含有10% FBS、20 ng/ml M-CSF的RPMI1640培養(yǎng)基中，培養(yǎng)6 d，得到骨髓來源巨噬細胞(bone marrow-derived macrophages,BMMs)。分離得到的BMMs經過胰蛋白酶消化、重懸，調整細胞密度為5×106個/ml。取50 μl細胞懸液，加入1 μl FITC-F4/80和PE-CD11b抗體，室溫孵育40 min，隨后用流式細胞儀檢測F4/80+CD11b+細胞。

1.2.2酶聯(lián)免疫吸附實驗 取細胞培養(yǎng)基，1 000 g離心3 min，按照使用說明稀釋樣品和標準品，并將樣品和標準品每孔加100 μl，每組設置3個復孔。隨后洗去樣品，加入檢測抗體、顯色底物、終止液，最后使用酶標儀讀數，并利用標準曲線計算樣品濃度。

1.2.3MTT法檢測細胞增殖 將骨髓纖維細胞以5×103個/孔接種于96孔板，培養(yǎng)至指定時間后，每孔加入10 μl MTT溶液(5 mg/ml)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄去培養(yǎng)基，加入100 μl DMSO溶解沉淀，使用酶標儀測定490 nm波長的吸光值(A)。

1.2.4BMM條件培養(yǎng)基的制備 在分離培養(yǎng)的BMMs 培養(yǎng)基中加入終濃度100 ng/ml的LPS，刺激細胞活化，培養(yǎng)24 h后收集培養(yǎng)基，1 000 g離心3 min，上清液即為BMM條件培養(yǎng)基(BMM conditioned medium,BMM-CM)。

2 結果

2.1ELISA檢測LPS活化的BMMs中TGF-β的表達水平 BMMs經過6 d誘導分化及培養(yǎng)后，流式細胞儀檢測其F4/80+CD11b+細胞比例為(92.8±2.1)%，細胞呈貼壁生長狀態(tài)。在巨噬細胞中加入終濃度為100 ng/ml 的LPS刺激培養(yǎng)24 h后，培養(yǎng)基中TGF-β表達水平明顯上調。對照組為(0.13±0.04)ng/ml，LPS組為(2.81±0.31)ng/ml，P=0.000 1 (圖1)。

2.2ELISA檢測TGF-β誘導的骨髓成纖維細胞Ⅰ型膠原的表達水平 骨髓成纖維細胞中加入終濃度為5 ng/ml的TGF-β培養(yǎng)24 h后，ELISA檢測培養(yǎng)基中Ⅰ型膠原表達水平。其中對照組為(0.37±0.07)μmol/L，TGF-β組為(0.54±0.09)μmol/L，P=0.044 7，TGF-β組顯著高于對照組(圖2)。

2.3BMM-CM促進骨髓成纖維細胞增殖 骨髓成纖維細胞接種于96孔板中培養(yǎng)24 h后，加入終濃度5 ng/ml TGF-β或將培養(yǎng)基替換為BMM-CM，并在24 h、48 h和72 h時間點用MTT法檢測細胞增殖活性。圖3結果表明，TGF-β組及BMM-CM組細胞增殖活性明顯高于對照組，并且TGF-β組也略高于BMM-CM組。

圖1 LPS刺激BMMs表達TGF-βFig.1 LPS-induced TGF-β expression in BMMs

圖2 TGF-β誘導的骨髓成纖維細胞Ⅰ型膠原的表達Fig.2 TGF-β-induced collagen Ⅰ expression in bone marrow fibroblasts

圖3 TGF-β及BMM-CM促進骨髓成纖維細胞的增殖Fig.3 TGF-β and BMM-CM promote bone marrow fibroblasts proliferation

圖4 TGF-β中和抗體對骨髓成纖維細胞活性及Ⅰ型膠原表達影響Fig.4 Effects of TGF-β neutralizing antibodies on bone marrow fibroblasts viabilities and collagen Ⅰ expression

2.4抗TGF-β抗體抑制骨髓成纖維細胞增殖和Ⅰ型膠原表達 為了進一步確BMM-CM對骨髓成纖維細胞增殖活性的影響是由TGF-β引起的，本研究在BMM-CM中加入終濃度為0.5 μg/ml的抗TGF-β抗體，中和培養(yǎng)基中的TGF-β，對照組加入等濃度同型IgG，利用MTT法檢測細胞增殖。結果表明，抗TGF-β組細胞增殖活性明顯受到抑制(圖4A)。此外，ELISA檢測培養(yǎng)基中Ⅰ型膠原表達水平，對照組為(0.47±0.10 )μmol/L，而抗TGF-β組為(0.29±0.04)μmol/L，P=0.044 4?？筎GF-β組Ⅰ型膠原表達水平顯著低于對照組，差異有統(tǒng)計學意義。

3 討論

骨髓成纖維細胞的異常增殖以及膠原蛋白的過度積累可以直接引發(fā)骨髓纖維化，然而對誘發(fā)骨髓成纖維細胞增殖及膠原蛋白表達的分子機制尚不明確。當前較為流行的觀點認為骨髓纖維化是造血干細胞惡性增殖的繼發(fā)反應，造血干細胞增殖引起的炎癥細胞因子的表達可以引起骨髓纖維化病變[5]。其中，促炎因子TGF-β在這一過程中發(fā)揮了重要的作用。骨髓纖維化疾病進展過程復雜，早期研究已經發(fā)現(xiàn)骨髓纖維化病人單核-巨噬細胞活性提升[10]，但巨噬細胞能否通過分泌TGF-β促進骨髓纖維化病變還不是很清楚。本研究分離培養(yǎng)了原代BMMs，發(fā)現(xiàn)其可在LPS誘導激活后大量表達TGF-β，并且BMMs-CM能夠有效促進骨髓成纖維細胞的增殖及Ⅰ型膠原的表達，其作用效果與直接添加TGF-β接近。進一步使用抗TGF-β抗體中和BMM-CM中的TGF-β，可以抑制骨髓成纖維細胞的增殖及I型膠原的表達，這些結果表明BMM-CM中的TGF-β是促進骨髓成纖維細胞增殖和Ⅰ型膠原表達的主要因素。然而，BMM-CM中同時也存在熱源物質(如LPS)和活化的巨噬細胞分泌的其他細胞因子(如IL-1β，IL-10等)，這些因素對骨髓成纖維細胞的增殖會產生怎樣的影響還需在后續(xù)的研究中進行深入的探究。

當前越來越多的研究認為骨髓部位的炎癥反應，尤其是慢性炎癥很可能是引發(fā)骨髓纖維化病變的重要因素[11,12]，但在PMF疾病中，早期的炎癥反應是如何起始的一直是本研究領域亟待解決的問題。炎癥反應會引發(fā)造血細胞的應激進而產生更多的炎癥因子，導致炎癥反應的持續(xù)發(fā)展。TGF-β是引發(fā)病理性纖維化病變的最重要的炎癥因子。骨髓微環(huán)境中的TGF-β與骨髓成纖維細胞表面的受體TBRⅠ和TBRⅡ結合，并引起下游Smad蛋白磷酸化激活，調控下游基因的轉錄。TGF-β一方面促進骨髓成纖維細胞增殖，一方面促進膠原蛋白、纖連蛋白、蛋白聚糖等基質的表達和分泌，引起細胞外基質性質改變[13]。本研究指出骨髓中的巨噬細胞也可能是PMF疾病進展過程中TGF-β的來源，而且靶向TGF-β的抗體能夠抑制骨髓成纖維細胞的增殖及Ⅰ型膠原的表達，為靶向炎癥反應的PMF臨床治療提供了研究基礎。