黃傳兵 萬 磊 劉 健 劉 磊

(安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，合肥 230031)

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種累及多系統(tǒng)的、慢性、侵襲性自身免疫性疾病，四肢小關(guān)節(jié)受累最常見?；そM織血管新生，肥厚絨毛樣突起形成血管翳，血管翳侵蝕關(guān)節(jié)軟骨及軟骨下骨是造成RA關(guān)節(jié)功能障礙的最主要原因[1]。RA 關(guān)節(jié)外表現(xiàn)形式多樣，其中血小板活化較為多見[2，3]。血小板活化可發(fā)揮凝血、止血作用，但同樣參與RA炎癥反應(yīng)等過程。血小板活化后可通過分泌血小板微粒(platelet microparticles，PMPs)參與RA免疫調(diào)節(jié)、血管新生等過程[4，5]。因此，觀察關(guān)節(jié)炎患者體內(nèi)血小板活化產(chǎn)物的變化及闡明藥物干預(yù)機制意義重大。本研究采用弗氏完全佐劑構(gòu)建佐劑關(guān)節(jié)炎(adjuvant arthritis，AA)大鼠模型，采用新風(fēng)膠囊(XFC)干預(yù)AA大鼠，觀察大鼠體內(nèi)血小板活化物PMPs及磷酸酯酶與張力蛋白同源物(phospholipase and tensin homologue，PTEN)/磷脂酰肌醇三激酶(phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K)/蛋白激酶(protein kinase,AKT)信號通路等變化，探討XFC改善AA血小板活化的機制。

1 材料與方法

1.1材料 弗氏完全佐劑(批號:160861206)、PI3K特異性抑制劑LY294002(批號：52-0213)購自美國Sigma公司。Rabbit Antibody PENT、AKT、p-AKT(ser473)、B淋巴細胞瘤-2(Bcl-2)、Bcl-2相關(guān)死亡啟動因子(BAD)(Rabbit Antibody)、PI3K(Mouse Antibody)、血小板來源的生長因子(PDGF)購自美國Abcam公司。BX53型顯微鏡購自日本奧林巴斯公司。XL-ESPIC MCL型流式細胞儀購自美國Beckman-Coulter公司。JEM-1230型透射電子顯微鏡購自日本日立公司。

1.2方法

1.2.1模型分組 采用隨機對照表將大鼠分為正常對照(NC)組、模型對照(MC)組，PI3K阻滯劑LY294002(LY294002)組、XFC組，每組6只。各組分別給予相應(yīng)藥物治療(NC、MC組給予等體積生理鹽水)，給藥30 d后觀察各項指標變化。

1.2.2流式細胞術(shù)檢測PMPs標志物 抗凝管腹主動脈采血2 ml。1 000 r/min離心20 min，上清即為富血小板血漿。取100 μl 富血小板血漿、5 μl CD61-FITC抗體、5 μl CD41-PE抗體、1 μl熒光微粒加入流式管，室溫孵育30 min，PBS定容至0.5 ml，加入1 μl熒光微粒，流式細胞儀檢測。CD61-FITC和CD41-PE雙陽性顆粒即為PMPs，檢測門內(nèi)PMPs雙陽性表達率CD61+CD41+PMPs(%)。

1.2.3血小板參數(shù)檢測 采用全自動血細胞分析儀檢測血小板計數(shù)(PLT)、血小板壓積(PCT)、血小板體積(MPV)、血小板分布寬度(PDW)表達。

1.2.4電鏡觀察血小板超微結(jié)構(gòu)變化 將采集的血液樣本加于分離液中，離心后用吸管小心吸取第一層(血小板血漿層)，加入10 ml清洗液，離心、棄上清、重懸細胞，再離心、棄上清，白色沉淀即為血小板。血小板固定、脫水、包埋，組織進行超薄切片，透射電鏡觀察攝片。

1.2.5ELISA法檢測血清細胞因子 腹主動脈采血。離心取上清，ELISA法檢測血清細胞因子血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、缺氧誘導(dǎo)因子-1α(HIF-1α)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α) 、內(nèi)皮抑素(ES)、IL-10 OD值，查標準曲線計算VEGF、HIF-1α、TNF-α、ES、IL-10最終濃度。

1.2.6免疫組化、RT-qPCR法檢測腹主動脈組織PDGF 取腹主動脈，石蠟包埋、切片、免疫組織化學(xué)染色。PDGF抗體1∶500稀釋行染色，每張切片任選4個視野，采用圖像分析軟件進行分析，用積分光密度表示PDGF蛋白表達。腹主動脈提取RNA，引物序列如下：PDGF引物：上游5′-GTG CGG TCT TTG TTC TCC TC-3′，下游： 5′-TCG CTC TCT GTG ACA AGG AA-3′；β-actin引物：上游：5′-CCC ATC TAT GAG GGT TAC GC-3′，下游：5′-TTT AAT GTC ACG CAC GAT TTC-3′。逆轉(zhuǎn)錄，進行PCR反應(yīng)，以β-actin為內(nèi)參，2-ΔΔCt計算PDGF mRNA表達。

1.2.7免疫印跡法檢測大鼠血小板細胞PTEN/PI3K/AKT蛋白表達 取上層血漿，離心，去上清。向沉淀加入血小板洗滌液輕輕搖動洗滌，再次離心，除去洗滌液。將蛋白提取液、蛋白酶抑制劑混合物加入離心管中，振蕩、混勻，離心、取上清即為血小板蛋白。轉(zhuǎn)膜、封閉、免疫反應(yīng)。PTEN、PI3K、AKT、BCL-2、p-AKT、BAD抗體1∶2 000稀釋；二抗抗體1∶5 000稀釋，分析結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1XFC對AA大鼠PMPs及血小板參數(shù)的影響 與NC組相比，MC組PMPs、PLT、PCT表達顯著升高(P<0.01)，PDW、MPV表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；與MC組相比，LY294002組、XFC組PMPs、PLT、PCT表達顯著降低(P<0.01)，PDW、MPV表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；XFC組、LY294002組PMPs、PLT、PCT、PDW、MPV表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見圖1、表1。

2.2各組血小板超微結(jié)構(gòu)的變化 電鏡下NC組

圖1 標準熒光微球定位對照及血小板微粒流式設(shè)門圖Fig.1 Standard fluorescent microsphere positioning control and platelet particle flow gate setting dragram

血小板形狀規(guī)整，表面光滑，無偽足伸出，胞質(zhì)中可見α顆粒、線粒體散在分布；MC組可見血小板外形稍膨脹，不規(guī)整，表面多處偽足伸出，胞質(zhì)中α顆粒、線粒體顯著減少，血小板結(jié)構(gòu)破壞明顯，部分血小板表面可見PMPs形成；LY294002組血小板細胞外形不規(guī)整，少量偽足伸出，胞質(zhì)中α顆粒、線粒體分布； XFC組血小板呈橢圓形，狀規(guī)整，有少許偽足伸出，胞質(zhì)結(jié)構(gòu)無明顯損傷、胞質(zhì)α顆粒、線粒體較MC明顯增多。見圖2。

2.3XFC對AA大鼠血清細胞因子的影響 與NC組相比，MC組血清VEGF、HIF-1α、TNF-α表達明顯升高，ES、IL-10表達降低(P<0.01)；與MC組相比，LY294002組和XFC組VEGF、HIF-1α、TNF-α表達降低，ES、IL-10表達升高(P<0.05或P<0.01)；與LY294002組相比，XFC組TNF-α表達降低(P<0.05)。見表2、圖3。

2.4XFC對AA大鼠腹主動脈PDGF表達的影響

圖2 各組血小板超微結(jié)構(gòu) (×5 000)Fig.2 Platelet ultrastructure of each group (×5 000)

表1 各組血小板微粒、血小板參數(shù)變化

表2 各組血清細胞因子水平變化

免疫組化結(jié)果顯示：與NC組相比，MC組大鼠腹主動脈PDGF表達升高(P<0.01)；與MC組相比，LY294002組、XFC組PDGF表達降低(P<0.01)；LY294002組、XFC組PDGF表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。RT-qPCR結(jié)果顯示：與NC組相比，MC組大鼠腹主動脈PDGF mRNA表達升高(P<0.01)；與MC組相比，LY294002組、XFC組PDGF mRNA表達降低(P<0.05或P<0.01)；與LY294002組相比，XFC組PDGF mRNA表達降低(P<0.05)。見表3、圖4。

圖3 各組血清細胞因子水平比較Fig.3 Comparison of serum cytokines levels in each group

表3 各組大鼠腹主動脈PDGF表達變化

2.5血小板細胞PTEN/PI3K/AKT蛋白變化 與NC組相比，MC組大鼠血小板細胞PI3K、AKT、p-AKT、BCL-2蛋白表達升高，PTEN、BAD蛋白表達降低(P<0.01)；與MC組相比，LY294002組、XFC組PI3K、p-AKT、BCL-2蛋白表達降低，PTEN、BAD蛋白水平升高(P<0.05或P<0.01)；XFC組與LY294002組相比PTEN、PI3K、AKT、p-AKT、BAD、BCL-2差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表4、圖5。

圖4 各組腹主動脈組織PDGF表達(×400)Fig.4 PDGF expressions in abdominal aorta tissues of each group (×400)

圖5 各組血小板細胞PTEN/PI3K/AKT蛋白表達Fig.5 Expressions of PTEN/PI3K/AKT protein in platelet cells of each group

表4 各組血小板細胞PTEN/PI3K/AKT蛋白表達變化

3 討論

AA大鼠外周血PMPs釋放增多，該過程受多種炎癥因子、細胞因子和信號通路共同調(diào)控。機體抑炎因子與促炎癥細胞因子平衡失衡、PI3K/AKT異常活化、凋亡指標BAD、抗凋亡指標BCL-2表達紊亂共同導(dǎo)致了外周血PMPs高表達，上調(diào)炎癥因子分泌，介導(dǎo)炎癥反應(yīng)，誘導(dǎo)滑膜血管增生[6,7]。

PMPs是血小板細胞活化后釋放進入微循環(huán)的小囊泡，可直接活化多種單核細胞、中性粒細胞，招募炎癥趨化因子表達，分化為多種炎癥因子，參與炎癥反應(yīng)?；顒悠赗A患者外周血PMPs含量顯著高于穩(wěn)定期RA患者，RA患者關(guān)節(jié)液中PMPs含量顯著高于外周血，表明PMPs與RA炎癥反應(yīng)有關(guān)[8]。RA早期，PMPs可誘導(dǎo)關(guān)節(jié)滑膜組織產(chǎn)生血管內(nèi)皮生長因子，進而誘導(dǎo)滑膜炎癥及血管增生。RA病變過程中，血小板參數(shù)PLT、PCT增高在一定程度上反映了關(guān)節(jié)滑膜侵蝕性炎癥的活動程度，本研究發(fā)現(xiàn)，AA大鼠PMPs、PLT、PCT表達顯著升高。既往研究發(fā)現(xiàn)，AA大鼠中PMPs與足跖腫脹度、AI呈正相關(guān)，說明PMPs介導(dǎo)關(guān)節(jié)及全身炎癥反應(yīng)[9-11]。本研究發(fā)現(xiàn)，AA大鼠體內(nèi)炎癥細胞因子VEGF、HIF-1α、TNF-α表達升高，導(dǎo)致AA血小板參數(shù)失衡及PMPs釋放增多,PDGF表達升高。XFC干預(yù)后血小板計數(shù)降低、超微結(jié)構(gòu)破壞改善，抑制血小板細胞產(chǎn)生、釋放PMPs，降低炎癥因子表達，減輕全身炎癥反應(yīng)，降低微血管密度，抑制血管增生和滑膜組織炎癥反應(yīng)。

PI3K/AKT信號通路是重要的細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，通過跨膜酪氨酸激酶受體和細胞內(nèi)因子應(yīng)答各種細胞內(nèi)外信息，并調(diào)控細胞生長、增殖、分化、凋亡和細胞骨架重排等，在RA滑膜組織中廣泛存在并處于異常激活狀態(tài)，且與滑膜組織中纖維細胞樣滑膜細胞凋亡有關(guān)[12,13]。本研究發(fā)現(xiàn)，AA大鼠機體促炎因子表達增多，激活PI3K/AKT信號通路形成正反饋，進一步促進PMPs釋放，血小板細胞PI3K/AKT通路被異常激活。因此，抑制異?；罨腜I3K/AKT 信號通路或抗凋亡分子的表達可以誘導(dǎo)RA細胞凋亡，抑制PDGF表達，治療RA。LY294002為PI3K/AKT信號通路特異性抑制劑，可抑制PI3K/AKT通路激活[14]。采用LY294002處理的關(guān)節(jié)炎模型小鼠可顯著改善關(guān)節(jié)滑膜增生，抑制滑膜內(nèi)炎癥細胞浸潤產(chǎn)生抗炎作用。本研究發(fā)現(xiàn)，XFC和LY294002均可調(diào)節(jié)PI3K、p-AKT、BCL-2、PTEN、BAD表達，XFC可通過上調(diào)PTEN，負性調(diào)節(jié)PI3K/AKT通路，降低BCL-2表達，升高BAD，改善血小板參數(shù)，抑制血小板活化，下調(diào)PMPs表達，抑制PMPs介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)。

綜上所述，XFC可通過抑制血小板PTEN/PI3K/AKT信號通路，提高抑炎因子表達，調(diào)節(jié)Th1/Th2平衡，降低炎癥因子表達，減輕全身炎癥反應(yīng)，降低PMPs表達，改善血小板參數(shù)，從而抑制RA患者炎癥反應(yīng)。