劉 謙 魏世超 徐麗君 鄒 欣 胡茹楠 童鳳雪 張礫丹 陸付耳

1華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合研究所，武漢 430030 2華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院藥學(xué)部，武漢 430030 3華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合系，武漢 430030

胰高血糖素樣肽-1(glucagon-like peptide-1，GLP-1)是一種由腸道L細(xì)胞產(chǎn)生及分泌的多肽激素，該激素以葡萄糖濃度依賴性方式促進(jìn)胰島β細(xì)胞分泌胰島素，調(diào)節(jié)血糖水平[1]。但GLP-1在體內(nèi)很快被二肽基肽酶-IV(DDP-IV)分解，所以半衰期極短，只有5 min左右[2]。因此，尋找能夠有效促進(jìn)內(nèi)源性GLP-1分泌的藥物將會(huì)給2型糖尿病的治療帶來(lái)新的途徑。目前研究[3-4]證實(shí)，黃連及其有效成分如小檗堿、表小檗堿、黃連堿、藥根堿等均具有一定的降糖調(diào)脂功效。本課題組前期研究[5]進(jìn)一步證實(shí)黃連有效成分小檗堿、黃連堿、藥根堿及其混合物可升高荷糖小鼠胰島素和GLP-1水平，并且證實(shí)其可直接作用于L細(xì)胞的研究模型之一的NCI-H716細(xì)胞而促GLP-1分泌，即可恢復(fù)內(nèi)源性GLP-1的分泌，而且混合物的作用效果優(yōu)于單一成分。在相關(guān)研究中，小檗堿的研究最為廣泛和深入[6-8]，體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)均證實(shí)其可促進(jìn)GLP-1的分泌[9]，并主要通過(guò)AMPK/PKC/PKA信號(hào)通路發(fā)揮作用，其他成分的作用機(jī)制目前尚不明確。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)行混合物中另一成分——鹽酸藥根堿(jatrorrhizine，JAT)相關(guān)作用及其機(jī)理的研究，即利用GLP-1分泌細(xì)胞模型——來(lái)源于人低分化的盲腸腺癌NCI-H716細(xì)胞株，初步探討JAT恢復(fù)內(nèi)源性GLP-1分泌的作用及其機(jī)制。通過(guò)該系列的相關(guān)研究，將為小檗堿、黃連堿和藥根堿的新藥開發(fā)奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞

NCI-H716細(xì)胞株購(gòu)買自上海中科院細(xì)胞庫(kù)，由本實(shí)驗(yàn)室傳代培養(yǎng)。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥品及試劑

鹽酸藥根堿(JAT)由南京普怡生物科技公司提供(純度≥98%，批號(hào)111022)，JAT對(duì)照品由成都普菲德生物技術(shù)有限公司提供(批號(hào)15050712)。AMPK通路抑制劑Dorsomorphin(批號(hào)115M4736V)和PKC通路抑制劑Chelerythrine chloride(批號(hào)C2932)均購(gòu)于美國(guó)Sigma公司。胎牛血清(美國(guó)Gibco公司，批號(hào)10270-106)、GLP-1 ELISA試劑盒(美國(guó)R&D Systems，批號(hào)P148658)、CCK-8試劑盒(日本同仁，批號(hào)BC2060)、PCR試劑盒(日本Takara公司，批號(hào)AK5301、AK7301)、TRIZOL[安迪福諾生物科技(武漢)有限公司，批號(hào)AB312FP1]、GLP-1 Antibody-BSA Free(美國(guó)Novus公司，批號(hào)K0920)、Anti-mouse IgG、GAPDH Mouse mAb(美國(guó)CST公司，批號(hào)6)、Color-coded Protein Marker(美國(guó)CST公司，批號(hào)00556442)、BCA試劑盒(武漢賽維爾生物科技有限公司，批號(hào)181363)。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器

二氧化碳培養(yǎng)箱(5810F，美國(guó)Nuaire公司)、酶標(biāo)儀(Synergr2，美國(guó)Bio-Tek公司)、迷你離心機(jī)(LX-200，中國(guó)其林貝爾儀器)、漩渦混合器(XW-80A，中國(guó)滬西儀器)、恒溫箱(XMTD-8222，中國(guó)天康電子)、低溫高速離心機(jī)型(Megafuge 8R，德國(guó)sigma公司)、電子天平(BT25S，中國(guó)賽多利斯)、微量加樣器(P1000、P200、P100、P20、P2.5，德國(guó)Eppendorf公司)、PCR儀(Mastergyde，德國(guó)Eppfndorf公司)、熒光定量PCR儀(Stepone，美國(guó)Applied Biosystems公司)、電泳儀(DYY-6C，美國(guó)Bio-RAD公司)、掃膜儀(Odyssey公司)。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng)

將NCI-H716細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基中，置于37℃、含5%CO2、濕度飽和的恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，每隔2～3 d換液或傳代1次。

1.5 分組及給藥

選取同批同代對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，離心棄上清，加入0.02 g/L的BSA溶液混懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為1.5×106個(gè)/mL，接種于無(wú)菌6孔板，每孔2 mL，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)90 min，分為最適JAT組、低JAT組、高JAT組、最適JAT+高、中、低濃度抑制劑Dorsomorphin組(50、10、2)μmol/L、最適JAT+高、低濃度抑制劑Chelerythrine組(10、2)μmol/L及空白組，共9組。向6孔板中加入等體積、不同濃度的實(shí)驗(yàn)藥物，空白組加入等體積0.02 g/LBSA溶液，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱干預(yù)36 h。收集各組細(xì)胞，提取RNA用于PCR檢測(cè)，提取蛋白用于Western blot檢測(cè)，離心上清用于酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測(cè)。

1.6 檢測(cè)指標(biāo)

1.6.1 CCK-8方法檢測(cè)細(xì)胞活性

①選擇JAT濃度 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期NCI-H716細(xì)胞按照1×104個(gè)接種于96孔板中，每孔加入100 μL細(xì)胞懸液置于37℃、含5%CO2、濕度飽和的恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h，加入100 μL含不同濃度JAT(6、30、60、90、150、300 μmol/L)的完全培養(yǎng)基在培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)36 h，加入10 μL CCK-8溶液，在培養(yǎng)箱中孵育4 h，用酶標(biāo)儀測(cè)定在450 nm處的吸光度，記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果，計(jì)算細(xì)胞存活率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)2次。據(jù)此結(jié)果，繪制藥物濃度與吸光度曲線，選擇JAT 150 μmol/L作為本實(shí)驗(yàn)基本濃度。

②不同處理對(duì)細(xì)胞活性的影響 分組同前，每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，使用上述CCK-8方法檢測(cè)吸光度，計(jì)算細(xì)胞存活率，根據(jù)細(xì)胞存活率計(jì)算細(xì)胞相對(duì)活性，實(shí)驗(yàn)重復(fù)2次。細(xì)胞相對(duì)活性=(實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞存活率/空白對(duì)照組細(xì)胞存活率)×100%。

1.6.2 ELISA法檢測(cè)GLP-1蛋白含量 采用ELISA法檢測(cè)GLP-1蛋白含量，分組同前，加上不加樣的陰性對(duì)照組。參照ELISA試劑盒說(shuō)明方法繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線方程(y=1357x+30.915)，同時(shí)每組取50 μL進(jìn)行GLP-1含量的測(cè)定，重復(fù)8次。

錯(cuò)因：不清楚反應(yīng)的實(shí)質(zhì)。由于反應(yīng)過(guò)程中KClO3得到6個(gè)電子被還原,而HCl失去一個(gè)電子被氧化,因此,氧化產(chǎn)物和還原產(chǎn)物的物質(zhì)的量之比為6∶1;或者由于反應(yīng)過(guò)程中KClO3得到電子還原為KCl(還原產(chǎn)物),而 HCl失去電子被氧化Cl2(氧化產(chǎn)物),根據(jù)化學(xué)方程式得到氧化產(chǎn)物和還原產(chǎn)物的物質(zhì)的量之比為1∶3。

1.6.3 PCR法檢測(cè)GLP-1 mRNA表達(dá) 參照Trizol試劑盒說(shuō)明書提取RNA，波長(zhǎng)260/280 nm處分別測(cè)吸光度，鑒定RNA純度，取A260/280>1.8、0.1

1.6.4 Western blot法檢測(cè)GLP-1蛋白水平

①蛋白樣品制備及變性 取藥物干預(yù)36 h后的NCI-H716細(xì)胞于2 mL EP管中，每管加入RIPA裂解液(按照每孔裂解液150 μL)，置碎冰上裂解30 min，4 ℃，12 000 r/min離心10 min，取上清液，用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度。各組吸取80 μL，按4：1加入5×Loding buffer，混勻后煮沸15 min。

②制膠、上樣及電泳 配制18%分離膠，依次加入去離子水、30% acrylamide、1.5 mol/L Tris-HCl(pH 8.8)、10% SDS充分混勻，再加入10% AP和TEMED后立即搖勻，并加入到2層玻璃板之間，去離子水液封，37 ℃放置30 min，待膠凝后將水倒出，吸除多余水分；再按上述方法配制5%濃縮膠，均勻灌膠，插入梳子，室溫放置30～60 min后取出梳子，用水沖洗濃縮膠后放入電泳槽中，加入足夠電泳緩沖液后，根據(jù)所測(cè)蛋白濃度，每孔按蛋白量40 μg上樣；穩(wěn)定電壓80 V，電泳30 min，當(dāng)染料進(jìn)入分離膠后，將電壓調(diào)至120 V繼續(xù)電泳，到達(dá)凝膠底部時(shí)終止電泳。

③轉(zhuǎn)膜、封閉 將轉(zhuǎn)膜支架放平，依次放置濾紙、PVDF膜、凝膠、濾紙，將凝膠面與負(fù)極相連，PVDF膜與正極相連，接通電源，200 mA轉(zhuǎn)膜30 min。將PVDF膜放入含5%脫脂奶粉的TBST溶液，搖床上輕搖1 h后TBST洗膜。

④抗體孵育及顯影 4℃一抗孵育24 h(一抗?jié)舛葹镚LP-1 1：1000、GAPDH 1：1000)，次日用TBST洗膜，室溫孵育1 h(二抗稀釋濃度為GLP-1 1：5000、GAPDH 1：5000)，洗膜。用Odyssey雙色紅外熒光成像系統(tǒng)對(duì)目的條帶進(jìn)行掃描，用Image J軟件進(jìn)行分析。

表1 PCR引物序列

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 基本藥物濃度的選擇

圖1 不同濃度JAT對(duì)細(xì)胞活性的影響

2.2 藥物處理對(duì)細(xì)胞活性的影響

采用CCK-8方法檢測(cè)細(xì)胞活性，不同處理間細(xì)胞活性比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，可視為同等條件。見圖2。

1為空白組；2為JAT(150)組；3為JAT+Dorsomorphin(150+2)組；4為JAT+Dorsomorphin(150+10)組；5為JAT+Dorsomorphin(150+50)組；6為JAT+Chelerythrine(150+2)組；7為JAT+Chelerythrine(150+10)組

2.3 不同抑制劑對(duì)藥根堿促進(jìn)NCI-H716細(xì)胞分泌GLP-1的影響

ELISA法檢測(cè)GLP-1濃度結(jié)果顯示，藥根堿可明顯促進(jìn)NCI-H716細(xì)胞分泌GLP-1，加入不同濃度的AMPK通路抑制劑Dorsomorphin和PKC通路抑制劑Chelerythrine均可抑制藥根堿的這一作用，且Dorsomorphin的抑制作用具有濃度依賴性。此外，分別對(duì)比高濃度Dorsomorphin組、低濃度Chelerythrine組、高濃度Chelerythrine組與陰性對(duì)照組，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，即可認(rèn)為上述3組中NCI-H716細(xì)胞分泌GLP-1被完全抑制，故此3組不再進(jìn)行GLP-1表達(dá)的測(cè)定。見表2。

2.4 不同抑制劑對(duì)藥根堿促進(jìn)NCI-H716細(xì)胞GLP-1 mRNA表達(dá)的影響

RT-PCR法檢測(cè)GLP-1表達(dá)結(jié)果顯示，藥根堿可明顯促進(jìn)NCI-H716細(xì)胞GLP-1 mRNA表達(dá)，而Dorsomorphin可抑制藥根堿的作用，且濃度越高，抑制作用越明顯。見表3。

表2 藥物對(duì)GLP-1分泌的影響

與空白對(duì)照組比較，*P<0.05；與JAT(150)組比較，△P<0.05；JAT+Dorsomorphin(150+2)、JAT+Dorsomorphin(150+10)、JAT+Dorsomorphin(150+50)組兩兩比較，▲P<0.05

表3 各組細(xì)胞GLP-1 mRNA表達(dá)

與空白對(duì)照組組比較，*P<0.05；與JAT(150)組比較，△P<0.05；與JAT+Dorsomorphin(150+2)組比較，▲P<0.05

2.5 不同抑制劑對(duì)藥根堿促進(jìn)NCI-H716細(xì)胞GLP-1蛋白表達(dá)的影響

Western blot法檢測(cè)GLP-1蛋白的表達(dá)結(jié)果顯示，藥根堿可明顯促進(jìn)NCI-H716細(xì)胞GLP-1表達(dá)，且150 μmol/L的藥根堿效果最好，而Dorsomorphin可抑制藥根堿的作用，且濃度越高，抑制作用越明顯。見圖3及圖4。

1為空白對(duì)照組；2為JAT(100)組；3為JAT(150)組；4為JAT(200)組；5為JAT+Dorsomorphin(150+2)組；6為JAT+Dorsomorphin(150+10)組

1為為空白對(duì)照組；2為JAT(100)組；3為JAT(150)組；4為JAT(200)組；5為JAT+Dorsomorphin(150+2)組；6為JAT+Dorsomorphin(150+10)組

3 討論

GLP-1促進(jìn)葡萄糖依賴性胰島素分泌，也能促進(jìn)胰腺導(dǎo)管內(nèi)皮細(xì)胞轉(zhuǎn)為胰島素樣細(xì)胞，給予永久性胰腺上皮細(xì)胞(IMPE)GLP-1后能促使胰島素分泌，可保護(hù)β細(xì)胞避免高游離脂肪酸、高濃度葡萄糖自身代謝引起的凋亡，故GLP-1通過(guò)保護(hù)β細(xì)胞來(lái)控制血糖，并且在降低血糖同時(shí)不會(huì)導(dǎo)致明顯低血糖，為其臨床應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)[10]?；贕LP-1靶點(diǎn)的藥物很多，現(xiàn)在臨床上相繼出現(xiàn)了GLP-1類似物類藥物如索瑪魯肽和利拉魯肽、DPP-IV抑制劑如維格列汀和西他列汀等，此類藥物臨床療效明確，尤其是在心血管方面有所獲益[11-13]。但是，GLP-1類似物給藥方式為皮下注射，即使用藥頻率較高，也難以保持GLP-1濃度穩(wěn)定，且存在可能導(dǎo)致的副作用如胰腺炎、胃腸道不適等[14]。而DPP-IV抑制劑完全依賴GLP-1發(fā)揮作用[13，15]，若內(nèi)源性GLP-1分泌不足，則其藥效普遍不佳。由此可見，GLP-1類似物和DPP-IV抑制劑應(yīng)用于臨床過(guò)程中均存在嚴(yán)重的局限性。因此“從內(nèi)求之”，促進(jìn)內(nèi)源性GLP-1分泌可能是基于GLP-1靶點(diǎn)治療T2DM的突破口。

NCI-H716細(xì)胞是人結(jié)直腸腺癌細(xì)胞，是一種由低分化的盲腸腺癌產(chǎn)生的細(xì)胞系，具有內(nèi)分泌特性，包括嗜鉻粒蛋白和胰高血糖素原的表達(dá)，并可由脂肪酸、糖調(diào)節(jié)蛋白(GRP)、膽堿能激動(dòng)劑、PKA和PKC活化劑刺激分泌GLP-1[16-17]。

腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)是一種由α、β和γ3個(gè)亞單位組成的異源三聚體蛋白。AMPK在調(diào)節(jié)機(jī)體能量代謝平衡方面起總開關(guān)作用，通過(guò)調(diào)節(jié)肝葡萄糖的轉(zhuǎn)化，增強(qiáng)骨骼肌對(duì)葡萄糖的攝取和脂肪組織中葡萄糖的利用，以保證機(jī)體糖代謝的穩(wěn)定。AMPK及其信號(hào)通路有望成為治療肥胖和2型糖尿病的新藥理學(xué)靶點(diǎn)[18-19]。AMPK是促進(jìn)小檗堿發(fā)揮有益作用的主要中間體[20-21]。研究[22]表明，AMPK位于p38 MAPK上游，MAPK通路參與了GLP-1分泌。在NCI-H716細(xì)胞中，小檗堿、AMPK和GLP-1之間存在一定的相關(guān)性[9，23]。藥根堿和小檗堿同為黃連提取物，其促進(jìn)GLP-1的分泌可能也與AMPK相關(guān)。Dorsomorphin(又稱Compound C)是一種有效的，可逆選擇性AMPK抑制劑，無(wú)細(xì)胞試驗(yàn)中Ki為109 nmol/L，對(duì)幾個(gè)結(jié)構(gòu)相關(guān)的激酶，包括ZAPK、SYK、PKCθ、PKA、和JAK3沒(méi)有顯著的抑制作用，也會(huì)抑制I型BMP受體活性。

PKC是一種重要的調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育、收縮、分泌、傳導(dǎo)、通透性、細(xì)胞外基質(zhì)和基因表達(dá)等的第二信使，可以將胞外信息傳遞到細(xì)胞內(nèi)，并且在糖尿病微血管并發(fā)癥中發(fā)揮重要作用[24-25]。有報(bào)道[26-27]顯示PKC依賴的途徑參與調(diào)節(jié)NCI-H716細(xì)胞中GLP-1的分泌。用體外培養(yǎng)人肝細(xì)胞模型進(jìn)行的研究[28]表明，小檗堿通過(guò)激活PKC依賴通路誘導(dǎo)胰島素受體的表達(dá)，說(shuō)明小檗堿的作用至少在某種程度上與PKC依賴的途徑有關(guān)。藥根堿和小檗堿同為黃連提取物，其促進(jìn)GLP-1的分泌可能也與PKC依賴的途徑相關(guān)。Chelerythrine是一種特異性的PKC通路抑制劑，Chelerythrine以1.5 μmol/L的IC50抑制BclXL-Bak BH3肽結(jié)合，并從BclXL中置換Bax(一種含BH3的蛋白質(zhì))。

綜上所述，JAT具有恢復(fù)內(nèi)源性GLP-1分泌的功效，該作用可被AMPK通路抑制劑Dorsomorphin和PKC通路抑制劑Chelerythrine所阻斷，即與AMPK通路和PKC通路相關(guān)。有關(guān)組合物的另一成分——黃連堿，相關(guān)機(jī)理研究待續(xù)。