趙 康，趙煦萌，徐盼盼，張瑛琪

人的大腦對缺氧極為敏感，當(dāng)腦組織發(fā)生缺血時，會使局部的腦組織和功能產(chǎn)生損傷，其損傷程度和缺血時間以及血流速度有密切關(guān)系[1]。短時間局部缺血只會產(chǎn)生可逆性的損傷，但是若長時間并且完全缺血則可能出現(xiàn)腦梗死[2-3]。當(dāng)腦出現(xiàn)缺血/再灌注時也會對大腦功能產(chǎn)生嚴(yán)重?fù)p傷。當(dāng)大腦出現(xiàn)缺血時，腦細胞中的生物電會隨之發(fā)生改變，產(chǎn)生病理性的慢波，缺血一段時間后再進行灌注，慢波會持續(xù)存在并加重，與此同時，神經(jīng)遞質(zhì)也會發(fā)生顯著變化，隨著腦缺血/再灌注時間的增加，其興奮性氨基酸會隨之降低，而抑制性氨基酸則隨之升高[4-6]。發(fā)生缺血/再灌注的時間越長，其興奮性神經(jīng)遞質(zhì)的含量就越低，腦組織結(jié)構(gòu)發(fā)生改變就越明顯。據(jù)文獻報道，腦缺血/再灌注的發(fā)病原因與自由基、鈣超載、興奮性氨基酸、炎癥反應(yīng)等因素有關(guān)[7]。有研究發(fā)現(xiàn)，環(huán)磷酸腺苷(cAMP)-蛋白激酶A(PKA)-環(huán)磷腺苷反應(yīng)元件結(jié)合蛋白(CREB)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路對腦缺血發(fā)揮重要作用，cAMP信號通路能夠?qū)θ毖哪X組織起到保護作用。黃芪為豆科植物黃芪的干燥根，是治療心腦血管疾病的常用中藥，發(fā)揮作用的主要成分為黃芪甲苷。據(jù)文獻報道，黃芪甲苷具有增強抗腦缺血/再灌注的作用[8-9]。本研究探討黃芪通過調(diào)節(jié)cAMP通路對腦缺血/再灌注大鼠神經(jīng)功能的影響?，F(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與藥物 成年清潔級SD大鼠60只，體重220～280(245±25)g，月齡3～4(3.0±0.4)個月。大鼠均由武漢華聯(lián)科生物技術(shù)有限公司提供，動物合格證號為SCXK(湘)2017-0003。黃芪甲苷，規(guī)格：每瓶500 mg，批號：20170425，購于四川省維克奇生物科技有限公司。純度≥98%，用5%羧甲基纖維素鈉配制成混懸液使用。

1.2 分組、給藥及造模 將60只大鼠隨機分為3組：假手術(shù)組、模型組、黃芪甲苷組，每組20只。3組大鼠一般情況比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。黃芪甲苷組給予黃芪甲苷10 mg/kg灌胃；假手術(shù)組和模型組給予生理鹽水10 mL/kg灌胃，每日1次，連續(xù)7 d后黃芪甲苷組和模型組制作腦缺血模型即大腦中動脈栓塞(MCAO)模型，腹腔注射10%水合氯醛(0.3 mL/kg)對大鼠進行麻醉處理，隨后將大鼠仰臥固定，去除頸部皮毛，在頸部的正中位置切2 cm長切口，將頸總動脈和迷走神經(jīng)充分暴露和分離，結(jié)扎頸總動脈，制造腦缺血，20 min后停止結(jié)扎恢復(fù)血流，再灌注24 h。假手術(shù)組同上述方法進行手術(shù)，但不對其進行腦缺血和再灌注處理。造模結(jié)束后，可通過觀察大鼠抬尾時是否前肢正常向地面用力，癱瘓的前肢是否能夠正常屈伸等，來判斷造模是否成功。

1.3 觀察指標(biāo)

1.3.1 神經(jīng)功能 從每組隨機選取5只大鼠，按照改良神經(jīng)功能評分(Modified Neurological Severity Scores，mNSS)的標(biāo)準(zhǔn)及方法，于造模后1 d、7 d、14 d進行神經(jīng)功能評分。通過觀察大鼠的行為活動、平衡感以及反射程度等對大鼠的神經(jīng)功能進行評分，評分13～18分的大鼠進入實驗。功能正常用0分表示，有功能損害用1分表示，功能損害最嚴(yán)重用22分表示；評分越高，神經(jīng)功能損害越嚴(yán)重。

1.3.2 腦梗死體積 腦缺血/再灌注后24 h，從每組選取5只大鼠，在無菌條件下斷頭取腦組織將其放置在-20 ℃冰箱進行冷凍，腦組織變硬后，用刀片對腦組織進行冠狀位切片，每片厚度2 mm。將腦組織切片放置在1%氯化三苯四氮唑磷酸緩沖液中進行染色。正常腦組織與氯化三苯四氮唑反應(yīng)呈現(xiàn)出紅色，而缺血腦組織不能與之進行反應(yīng)，所以腦梗死組織則呈現(xiàn)出白色。利用分析軟件計算腦梗死面積，進而計算出腦梗死體積，腦梗死體積=腦梗死面積之和×切片厚度(2 mm)。

1.3.3 酶聯(lián)免疫吸附實驗法測定大鼠血清中酶活性變化 采集大鼠腹主動脈血樣，4 000 r/min離心5 min，取上清液并將其放置在4 ℃下保存?zhèn)溆?。具體操作方法參考試劑盒內(nèi)所附說明書進行操作。使用酶標(biāo)儀在450 mm下對其吸光度值進行測定，利用標(biāo)準(zhǔn)品的吸光度值，于EXCEL軟件中制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，由曲線計算出樣品中cAMP、腺苷酸環(huán)化酶(AC)和PKA的活性變化。

2 結(jié) 果

2.1 3組大鼠神經(jīng)功能評分比較 假手術(shù)組大鼠沒有出現(xiàn)神經(jīng)功能損傷；與模型組比較，黃芪甲苷組腦缺血/再灌注后7 d、14 d神經(jīng)功能評分降低(P<0.05)，隨著腦缺血/再灌注后時間延長，黃芪甲苷組神經(jīng)功能評分呈降低趨勢。詳見表1。

組別只數(shù)1 d7 d14 d假手術(shù)組 50.000.000.00模型組 514.86±2.1712.46±2.05 10.35±2.11 黃芪甲苷組513.97±2.189.57±2.05①6.78±2.16①

與模型組同期比較，①P<0.05。

2.2 3組大鼠腦梗死體積比較 腦缺血/再灌注后24 h，假手術(shù)組無腦梗死，模型組和黃芪甲苷組的腦梗死體積分別為(37.39±3.06)%、(16.38±1.67)%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

2.3 3組大鼠血清中酶活性比較 與模型組比較，黃芪甲苷組大鼠血清中cAMP、AC和PKA活性較高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。詳見表2。

組別只數(shù)cAMPACPKA假手術(shù)組 511.00±0.0927.00±0.42362.00±0.84模型組 510.00±0.0323.00±0.53348.00±0.43黃芪甲苷組512.00±0.80①25.00±0.54①391.00±0.06①

與模型組比較，①P<0.05。

3 討 論

據(jù)文獻報道，腦缺血后，促進神經(jīng)的發(fā)生有利于病人后期預(yù)后神經(jīng)功能的改善，當(dāng)對神經(jīng)發(fā)生進行抑制，會加重腦缺血[10-12]。在正常生理狀態(tài)時，已經(jīng)出現(xiàn)活化PKA會催化亞基，使得CREB出現(xiàn)磷酸化過程，抑制轉(zhuǎn)錄因子活性來對外界刺激產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)[13-16]。cAMP-PKA-CREB通路在神經(jīng)細胞興奮、生長、凋亡及重塑全生命周期過程中均發(fā)揮重要作用，出現(xiàn)腦缺血癥狀后，cAMP-PKA-CREB通路中的各個關(guān)鍵因子活性會受到影響，對神經(jīng)元的內(nèi)生長狀態(tài)產(chǎn)生不利影響，從而抑制神經(jīng)元軸突再生[17-19]。

本研究結(jié)果顯示，與模型組比較，黃芪甲苷組大鼠血清中cAMP、AC和PKA的活性較高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。假手術(shù)組大鼠沒有出現(xiàn)神經(jīng)功能損傷；與模型組比較，黃芪甲苷組腦缺血/再灌注后7 d、14 d神經(jīng)功能評分降低 (P<0.05)，隨著腦缺血/再灌注后時間延長，黃芪甲苷組神經(jīng)功能評分呈降低趨勢。腦缺血/再灌注后24 h，假手術(shù)組無腦梗死，模型組和黃芪甲苷組的腦梗死體積分別為(37.39±3.06)%、(16.38±1.67)%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。其作用途徑可能是腦缺血后處于神經(jīng)元突觸位置的γ-氨基丁酸B受體(GABAB)會被激活，然后與G蛋白進行偶聯(lián)，此時，會對興奮性神經(jīng)遞質(zhì)分泌產(chǎn)生抑制作用，使機體發(fā)生抑制性反應(yīng)，GABAB受體可使細胞內(nèi)的cAMP濃度降低，從而使神經(jīng)元突觸部位的囊泡聚集困難[20-21]。當(dāng)GABAB和G蛋白進行結(jié)合后，會對AC的激活產(chǎn)生抑制，使AC聯(lián)合三磷酸腺苷(ATP)生成cAMP的過程受到抑制，從而使機體內(nèi)的cAMP濃度降低，最終使得PKA催化亞基由細胞核轉(zhuǎn)移至細胞漿內(nèi)，而且和保留在細胞漿的調(diào)節(jié)亞基重組為無活性的PKA全酶，隨之導(dǎo)致PKA失活[13-14]。

綜上所述，黃芪可以調(diào)節(jié)cAMP通路中的相關(guān)蛋白來減少腦缺血/再灌注小鼠腦梗死面積，改善大鼠神經(jīng)功能。