顧世玉，秦文舉，高建芝,薛明輝

肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是一種常見(jiàn)的原發(fā)性肝癌(primary liver cancer，PLC)，約占所有PLC的90%[1]。HCC患者早期臨床癥狀隱匿，就診時(shí)往往已發(fā)展為中晚期，臨床預(yù)后較差[3]。目前，主要采取外科手術(shù)根治性切除腫瘤治療，但術(shù)后復(fù)發(fā)率和轉(zhuǎn)移率高，易導(dǎo)致臨床治療失敗，5 a生存率較低[2]。尋找HCC的分子標(biāo)志物，正確評(píng)估患者的預(yù)后，指導(dǎo)臨床治療，具有重要的意義。氧化氫誘導(dǎo)的克隆基因-5(hydrogen peroxide inducible clone-5，Hic-5)也稱(chēng)為生長(zhǎng)轉(zhuǎn)化因子β誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄基因，是轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(transforming growth factor，TGF)-β1信號(hào)通路的輔助啟動(dòng)因子，參與調(diào)控細(xì)胞增殖分化、腫瘤細(xì)胞遷移和侵襲等生物學(xué)過(guò)程[4]。I型膠原α1鏈(collagen type I alpha gene，COL1A1)是細(xì)胞外基質(zhì)的組成成分，與細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖、分化密切相關(guān)[5]。臨床研究顯示[6，7]，Hic-5和COL1A1參與了調(diào)控肝組織的纖維化，且在多種惡性腫瘤均存在異常高表達(dá)，但其在肝癌組織的表達(dá)研究較少，對(duì)肝癌患者預(yù)后的影響尚不清楚。因此，本研究檢測(cè)了HCC患者癌組織Hic-5和COL1A1表達(dá)情況，并分析了它們對(duì)HCC患者術(shù)后生存的影響，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 2013年9月～2016年7月在本院行肝癌切除術(shù)治療的HCC患者97例,男66例，女31例；年齡30～75歲，平均年齡為(54.4±10.2)歲。均經(jīng)影像學(xué)檢查和術(shù)后組織病理學(xué)檢查確診為HCC。根據(jù)CT和MRI檢查結(jié)果，確定腫瘤直徑≤5 cm 者43例，>5 cm者54例；根據(jù)Edmondson分級(jí)法[8]，Ⅰ期12例，Ⅱ期30例，Ⅲ期36例，Ⅳ期19例；TNM分期：Ⅰ期17例，Ⅱ期38例，Ⅲ期30例，Ⅳ期12例；存在血管侵犯43例，存在門(mén)靜脈癌栓40例；甲胎蛋白(alpha fetoprotein，AFP)≥400 ng/mL者58例，AFP<400 ng/mL者39例。排除標(biāo)準(zhǔn)：轉(zhuǎn)移性肝癌、存在其他惡性腫瘤、無(wú)法耐受手術(shù)治療、凝血功能異常、存在心、腦、肺、腎等重要臟器功能異常、有肝移植手術(shù)史者?；颊呓o出知情同意書(shū)，本研究經(jīng)我院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核通過(guò)。

1.2 手術(shù)方法 根據(jù)腫瘤大小和部位，對(duì)所有納入HCC患者選擇性行肝葉、肝段、半肝和局部切除術(shù)。

1.3 肝組織Hic-5和COL1A1檢測(cè) 采用免疫組化法檢測(cè)，無(wú)菌取HCC患者癌組織和癌旁組織，進(jìn)行常規(guī)的固定、脫水、包埋和切片。切片依次經(jīng)二甲苯和梯度酒精脫水，采用檸檬酸修復(fù)緩沖液進(jìn)行抗原修復(fù)，經(jīng)PBS洗滌后加入3%過(guò)氧化氫溶液，室溫避光孵育25 min，用PBS洗滌后，加入牛血清白蛋白封閉30 min，分別加入兔抗人Hic-5多克隆抗體(1:100，北京綠源伯德生物科技有限公司)和兔抗人COL1A1多克隆抗體(1:100，北京綠源伯德生物科技有限公司)，4℃下孵育過(guò)夜，加二抗37℃下孵育1 h，經(jīng)DAB顯色，蘇木素復(fù)染細(xì)胞核2 min，常規(guī)梯度酒精和二甲苯脫水封片，于顯微鏡下鏡檢，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞膜和胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃色顆粒者為陽(yáng)性表達(dá)。

1.4 肝組織Hic-5和COL1A1 mRNA檢測(cè) 采用實(shí)時(shí)熒光定量(real-time，RT)-PCR法測(cè)定，無(wú)菌取HCC患者癌組織和癌旁組織，勻漿，采用RNA提取試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)提取組織總RNA，采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)將總RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，使用RT-PCR分析儀(美國(guó)ABI公司，7500型)行實(shí)時(shí)RT-PCR反應(yīng)， Hic-5上游引物：5′-GCAGCTTCTTCGAGAAGGATG-3′，下游引物：5′-TGAGCGCCGAGATGTAGTTATC-3′，PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min，95℃變性15 s，58℃退火20 s，72℃延伸20s，共40個(gè)循環(huán)。COL1A1上游引物：5′-ATCAACCGGAGGAATTTCCGT-3′，下游引物：5′-CACCAGGACGACCAGGTTTTC-3′, PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min，95℃變性15 s，60℃退火20 s，72℃延伸20s，共40個(gè)循環(huán)。以GAPDH作為內(nèi)參照，計(jì)算Hic-5和COL1A1相對(duì)水平。

1.5 隨訪 患者出院后，在門(mén)診復(fù)查或電話隨訪。治療后1年內(nèi)每3個(gè)月門(mén)診復(fù)查1次，2年內(nèi)半年復(fù)查 1次，以后至少每年復(fù)查一次，隨訪截止至2019年8月。所有患者均隨訪36個(gè)月。隨訪時(shí)，記錄腫瘤復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移、生存和死亡。

2 結(jié)果

2.1 HCC癌組織Hic-5和COL1A1蛋白表達(dá)情況 HCC患者癌組織Hic-5和COL1A1陽(yáng)性表達(dá)率顯著高于癌旁組織(P<0.05，圖1和表1)。

2.2 不同臨床和病理學(xué)特征的HCC患者癌組織Hic-5和COL1A1 mRNA陽(yáng)性率比較 見(jiàn)表2。

表1 癌組織與癌旁肝組織Hic-5和COL1A1陽(yáng)性率(%)比較

與癌旁組織比，①P<0.05

①P<0.05

2.3 癌組織Hic-5和COL1A1陽(yáng)性表達(dá)對(duì)HCC患者術(shù)后3 a生存時(shí)間的影響 本研究納入97例患者，共獲得87例(89.7%)患者的生存資料，失訪10例(10.3%)。87例患者生存時(shí)間為8.2～36.0個(gè)月，中位生存時(shí)間為36.0(14.6，36.0)個(gè)月。生存分析顯示，癌組織Hic-5陽(yáng)性表達(dá)患者3 a生存率和3 a無(wú)事件生存率顯著低于Hic-5陰性表達(dá)者，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，但癌組織COL1A1陽(yáng)性表達(dá)患者3 a生存率和3 a無(wú)事件生存率與癌組織COL1A1陰性表達(dá)者比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，圖2、表3)。

圖1 HCC癌組織Hic-5和COL1A1表達(dá)(SP，400×)A：癌旁組織Hic-5表達(dá)；B：癌組織Hic-5表達(dá)；C：癌旁組織COL1A1表達(dá)；D：癌組織COL1A1表達(dá)

圖2 癌組織Hic-5 mRNA陽(yáng)性與陰性患者生存時(shí)間比較

表3 癌組織Hic-5和COL1A1 mRNA陽(yáng)性與陰性患者生存時(shí)間【M(IQR)】比較

癌組織生存時(shí)間(m)Log-rank x2P無(wú)事件生存(m)Log-rank x2PHic-5 陽(yáng)性26.3(16.1,36.0)4.9010.02721.4(11.7,36.0)5.2260.022陰性36.0(30.6,36.0)36.0(24.2,36.0)COL1A1 陽(yáng)性36.0(17.4,36.0)1.2280.26826.3(12.5,36.0)2.5220.112陰性36.0(28.5,36.0)36.0(22.6,36.0)

3 討論

HCC是一種常見(jiàn)的惡性腫瘤，具有高侵襲性，術(shù)后易發(fā)生復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，嚴(yán)重影響了患者的預(yù)后生存[9]。HCC患者的發(fā)生發(fā)展涉及多個(gè)因素、多個(gè)信號(hào)通路，其發(fā)病機(jī)制尚不明確，研究影響HCC患者預(yù)后的分子標(biāo)識(shí)物，對(duì)于指導(dǎo)臨床用藥和新靶向藥物的研發(fā)具有重要意義。本研究發(fā)現(xiàn)HCC患者癌組織Hic-5表達(dá)陽(yáng)性率顯著高于癌旁組織。Hic-5屬于LIM蛋白家族，是細(xì)胞內(nèi)TGF-β1信號(hào)通路的特異性輔助啟動(dòng)因子，通過(guò)調(diào)節(jié)TGF-β相關(guān)通路，調(diào)控多種細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖等[10]。Hic-5與肝纖維化的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，過(guò)表達(dá)的Hic-5可以促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)的合成，促進(jìn)肝纖維化的形成，促進(jìn)肝癌的發(fā)生，提示HCC組織過(guò)表達(dá)的Hic-5參與了HCC的發(fā)生發(fā)展[11]。TNM分期和門(mén)靜脈癌栓是臨床常用的評(píng)估HCC患者疾病發(fā)展的指標(biāo)，與HCC患者預(yù)后密切相關(guān)[12]，癌組織Hic-5表達(dá)可能與患者預(yù)后差有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)HCC癌組織COL1A1表達(dá)陽(yáng)性率顯著高于癌旁組織，且其陽(yáng)性表達(dá)與HCC患者TNM分期、是否存在門(mén)靜脈癌栓密切相關(guān)，提示癌組織COL1A1表達(dá)可能也與HCC患者預(yù)后有關(guān)。COL1A1是編碼Ⅰ型膠原纖維的前α1鏈，組成細(xì)胞外基質(zhì)的重要成分，可以參與調(diào)節(jié)細(xì)胞間的黏附和分化[13]。臨床研究顯示[14，15]，COL1A1基因在前列腺癌、胰腺癌、乳腺癌等多種惡性腫瘤中均存在異常高表達(dá)，異常高表達(dá)的COL1A1基因可能通過(guò)改變腫瘤微環(huán)境，提高腫瘤細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)和遷移能力，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移，提示COL1A1基因可能通過(guò)參與調(diào)控腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移，加快HCC的惡性發(fā)展。

Hic-5可以激活TGF-β1信號(hào)通路，調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)的合成，COL1A1是細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分，提示Hic-5可能促進(jìn)了COL1A1的表達(dá)[16，17]。Hic-5在肝癌組織表達(dá)明顯上調(diào)，上調(diào)的Hic-5可能通過(guò)促進(jìn)COL1A1的表達(dá)，促進(jìn)Ⅰ型膠原的合成，促進(jìn)肝組織纖維化，促進(jìn)HCC的發(fā)生[18]。在三維細(xì)胞外基質(zhì)模型，發(fā)現(xiàn)Hic-5是腫瘤細(xì)胞表型的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，可用于預(yù)測(cè)腫瘤細(xì)胞在體內(nèi)的遷移和侵襲行為[19]。Ⅰ型膠原可以通過(guò)調(diào)節(jié)非小細(xì)胞肺癌E-鈣黏蛋白介導(dǎo)的細(xì)胞間黏附作用，促進(jìn)癌細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移[20]。本研究發(fā)現(xiàn)Hic-5表達(dá)與HCC患者的預(yù)后有關(guān)，癌組織Hic-5陰性表達(dá)患者3 a生存率顯著長(zhǎng)于Hic-5陽(yáng)性表達(dá)患者。

綜上所述，HCC患者癌組織Hic-5過(guò)表達(dá)可能預(yù)示預(yù)后差，是否與腫瘤分期較晚或存在門(mén)靜脈癌栓有關(guān)，需要進(jìn)一步研究。