李建波，張靜，羅永鋒，李小珩

糖尿病性視網(wǎng)膜病變（diabetic retinopathy，DR）是糖尿病最常見的眼部并發(fā)癥，也是成年人致盲的主要原因之一[1]。高血糖等因素導致視網(wǎng)膜微血管病變，致使疾病晚期出現(xiàn)視網(wǎng)膜新生血管，繼發(fā)視網(wǎng)膜脫離和玻璃體積血等是患者視力喪失的主要因素[2]。DR 的發(fā)生機制與多種因素有關(guān)，由于復雜的細胞間相互作用，所有視網(wǎng)膜細胞均出現(xiàn)了生化和代謝異常。過去20 年的大量研究表明，氧化應激、炎癥、血管生成相關(guān)因子是引發(fā)糖尿病視網(wǎng)膜并發(fā)癥發(fā)生的關(guān)鍵機制[3]。姜黃素是從傳統(tǒng)中藥姜科姜黃屬植物的根莖中提取的一種黃色多酚，近年來研究[4]發(fā)現(xiàn)，姜黃素不僅具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤等藥理活性，還具有抗動脈粥樣硬化、調(diào)節(jié)血脂、抗心律失常等心血管保護作用。不過，姜黃素能否在治療DR，尤其是其視網(wǎng)膜新生血管中發(fā)揮作用還不清楚。鑒于此，本研究擬在體外觀察姜黃素對高濃度葡萄糖培養(yǎng)的恒河猴脈絡膜-視網(wǎng)膜內(nèi)皮細胞 （rhesus choroido-retinal endothelial cell,RF/6A） 血管生成的影響，為進一步明確姜黃素在治療DR 中的作用奠定實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

RF/6A 細胞（中科院上海細胞庫），DMEM 培養(yǎng)基及D-葡萄糖（美國Gibco 公司），胎牛血清（美國Invitrogen 公司），姜黃素（美國Sigma 公司），CCK-8細胞增殖檢測試劑盒 （碧云天生物公司），Transwell及Matrigel（美國BD 公司）。

1.2 細胞處理及分組

將RF/6A 細胞置于含有10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基中，在37℃、5%CO2條件下常規(guī)培養(yǎng)。消化后用相應培養(yǎng)基制備單細胞懸液，按照每孔1×104個將細胞接種于96 孔板，細胞貼壁后按照如下分組進行處理：對照組（含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基），高糖組（DMEM 培養(yǎng)基中加入25 mmol/LD-葡萄糖），高糖+姜黃素組（DMEM 培養(yǎng)基中加入25 mmol/L D-葡萄糖＋30 μmol/L 姜黃素），在37℃、5%CO2及飽和濕度條件下培養(yǎng)3 d。

1.3 CCK-8 法檢測RF/6A 細胞增殖活力

0.25 %胰蛋白酶消化處于對數(shù)生長期的復蘇后第3 代細胞，用培養(yǎng)基制成細胞懸液（5×104個細胞/mL），在96 孔板中接種細胞懸液（100 μL/孔），將培養(yǎng)板放在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。按照上述不同分組處理3d，向每孔加入標準制式的CCK-8 溶液10μL，將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育4 h，用酶標儀測定每孔在450 nm 處的吸光度（A），計算細胞增殖活力。細胞增殖活力（%）=[A（加藥）-A（空白）]/[A（0 加藥）-A（空白）]×100%。A（加藥）：具有細胞、CCK-8 溶液和藥物溶液的孔的吸光度；A （空白）： 具有培養(yǎng)基和CCK8 溶液而沒有細胞的孔的吸光度；A（0 加藥）：具有細胞、CCK8 溶液而沒有藥物溶液的孔的吸光度。

圖1 觀察各組RF/6A 細胞形態(tài)學變化（×100）。1A 對照組；1B 高糖組；1C 高糖+姜黃素組

1.4 Transwell 法檢測RF/6A 細胞遷移

取對數(shù)生長期的細胞，0.25%胰蛋白酶消化后用DMEM 培養(yǎng)基制成單細胞懸液，計數(shù)后按照每孔5×105個細胞均勻接種至6 孔板中，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱種過夜培養(yǎng)。按照上述分組條件處理3 d，消化細胞，離心棄去培養(yǎng)液，PBS 液洗2 遍，用無血清培養(yǎng)基重懸細胞，調(diào)整細胞密度至2×105個/mL。在24孔板中加入800 μL 含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基，并放入Transwell 小室，取各組細胞懸液200 μL加入Transwell 上室，常規(guī)培養(yǎng)24 h。取出Transwell小室，棄去孔中培養(yǎng)液，PBS 洗2 遍，用70%冰乙醇溶液固定1 h，將小室適當風干。0.5%結(jié)晶紫染液染色20 min，用棉簽輕輕擦掉上層未遷移的細胞，PBS洗3 遍，顯微鏡下觀察計數(shù)5 個低倍視野（×200）的穿膜細胞數(shù)，取平均值。

1.5 Matrigel 法檢測RF/6A 細胞血管形成

將Matrigel 放于冰盒中，在4℃冰箱內(nèi)過夜使膠緩慢融化，同時4℃預冷槍頭和24 孔板。用預冷槍頭迅速將膠以每孔200 μL 加至預冷的24 孔板中，輕搖培養(yǎng)板使其評鋪板底，置入37℃培養(yǎng)箱中孵育30 min 使膠凝固。取上述不同分組處理3 d 的細胞，制備單細胞懸液，計數(shù)后按照每孔2×105/個接種到鋪好膠的24 孔板中，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)，顯微鏡下隨即取3 個低倍視野（×100）拍照。采用Image J 圖像分析軟件計算血管分支點數(shù)和分支長度（每3 個分叉處記作一個血管腔），取平均值。

1.6 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 17.0 統(tǒng)計軟件進行分析，計量資料以均數(shù)±標準差（）表示，多組間比較采用方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t 檢驗，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 RF/6A 形態(tài)學變化

在顯微鏡下觀察培養(yǎng)3 d 時的RF/6A 細胞形態(tài)，發(fā)現(xiàn)細胞多呈橢圓形或短梭形，排列致密，各組細胞均有不同程度的凋亡（胞體萎縮變小，形態(tài)不規(guī)則），高糖組細胞凋亡較對照組明顯增多，姜黃素處理后有所改善，凋亡細胞較高糖組明顯減少（圖1）。

2.2 姜黃素對RF/6A 細胞增殖活力的影響

CCK-8 檢測顯示，不同處理組RF/6A 細胞的增殖活力分別為： 對照組（99.55±0.57）%，高糖組（72.53±2.20）%，高糖＋姜黃素組（92.75±2.37）%，3 組間總體比較差異具有統(tǒng)計學意義（F=329.10，P=0.000）。與對照組相比，高糖組（t=29.07，P=0.000）和高糖+姜黃素組（t=6.83，P=0.000）細胞增殖活力明顯降低。與高糖組相比，高糖+姜黃素組細胞增殖活力明顯升高（t=15.30，P=0.000）（圖2）。以上實驗結(jié)果表明，高濃度葡萄糖培養(yǎng)條件下RF/6A 細胞活力降低，姜黃素對高濃度葡萄糖條件下的細胞活力具有保護作用。

圖2 CCK-8 檢測各組RF/6A 細胞增殖活力的比較

2.3 姜黃素對RF/6A 細胞遷移的影響

Transwell 結(jié)果顯示，不同處理組RF/6A 細胞的遷移數(shù)分別為：對照組（122.00±5.48）個、高糖組（142.00±10.18）個、高糖＋姜黃素組（76.50±7.56）個，3 組間比較差異具有統(tǒng)計學意義（F=106.35，P=0.000）。與對照組相比，高糖組細胞遷移數(shù)明顯增多（t=4.24，P=0.002），高糖+姜黃素組細胞遷移數(shù)明顯減少（t=11.94，P=0.000）。與高糖組相比，高糖+姜黃素組細胞遷移數(shù)明顯減少（t=12.66，P=0.000）（圖3）。

圖3 Transwell 法檢測各組RF/6A 細胞遷移能力（200×）。3A 對照組；3B 高糖組；3C 高糖+姜黃素組

2.4 姜黃素對RF/6A 細胞血管形成的影響

Matrigel 結(jié)果顯示，不同處理組RF/6A 細胞的管腔形成數(shù)分別為：對照組（9.33±2.50）個、高糖組（14.83±3.06）個、高糖＋姜黃素組（6.33±1.37）個，3 組間比較差異具有統(tǒng)計學意義（F=19.11，P=0.000）。與對照組相比，高糖組細胞管腔形成數(shù)明顯增多（t=3.41，P=0.007），高糖+姜黃素組細胞管腔形成數(shù)明顯減少（t=2.58，P=0.028）。與高糖組相比，高糖+姜黃素組細胞管腔形成數(shù)明顯減少（t=6.21，P=0.000）（圖4）。

血管分支長度比較：對照組（3169.67±270.81）μm、高糖組（3606.67±325.15）μm、高糖＋姜黃素組（2556.50±301.72）μm，3 組間比較差異具有統(tǒng)計學意義（F=18.55，P=0.000）。與對照組相比，高糖組血管分支長度明顯增加（t=2.53，P=0.030），高糖+姜黃素組血管分支長度明顯減?。╰=3.71，P=0.004）。與高糖組相比，高糖+姜黃素組血管分支長度明顯減?。╰=5.80，P=0.000）（圖4）。

圖4 Matrigel 法檢測各組RF/6A 細胞血管形成能力（×100）。4A 對照組；4B 高糖組；4C 高糖+姜黃素組；4D 各組RF/6A 細胞的管腔形成數(shù)比較；4E 各組RF/6A 細胞的血管分支長度比較

3 討論

DR 是糖尿病患者最常見的微血管并發(fā)癥，是世界范圍內(nèi)不可逆致盲的主要原因[5]。從上世紀90年代以來，隨著人民生活水平的提升，此并發(fā)癥的發(fā)生率也在逐年攀升[6]。近年來抑制DR 晚期出現(xiàn)的病理性視網(wǎng)膜新生血管的藥物不斷涌現(xiàn)，給大部分患者帶來了福音，但并非所有患者均能得到有效治療[7]，因而尋求其他的治療方法意義重大。本研究結(jié)果提示，高濃度葡萄糖培養(yǎng)明顯降低了RF/6A 細胞活力，導致其細胞增殖能力下降，與文獻報道的結(jié)果一致[8-10]。給予姜黃素處理后，可明顯增強高濃度葡萄糖培養(yǎng)條件下的RF/6A 細胞增殖活力，其機制可能與高糖增加細胞的氧化應激，而姜黃素通過抑制氧化應激水平保護細胞免受高糖的損傷有關(guān)[9]。此外，姜黃素具有明顯的抗炎作用，能夠減少高濃度葡萄糖誘導的腫瘤壞死因子α （tumor necrosis factor-α,TNF-α）表達，同時也與姜黃素抑制細胞凋亡、維持高糖條件下的細胞活力有關(guān)[10]。最近研究[11]發(fā)現(xiàn)，姜黃素能顯著降低人視網(wǎng)膜色素上皮細胞中的活性氧簇（reactive oxygen species,ROS）濃度和高濃度葡萄糖培養(yǎng)下人視網(wǎng)膜內(nèi)皮細胞TNF-α 的釋放，還能維持視網(wǎng)膜周細胞活力免受高糖損傷，以上報道均與本研究結(jié)果相符。綜上，姜黃素通過抗氧化應激和抗炎作用對高濃度葡萄糖條件下的視網(wǎng)膜內(nèi)皮細胞損傷起到抑制作用，從而保護視網(wǎng)膜內(nèi)皮細胞，維持細胞活力。

新的血管網(wǎng)絡是由先前存在的血管通過血管生成的過程發(fā)展而來，視網(wǎng)膜新生血管是增殖性DR（proliferative diabetic retinopathy,PDR）的重要特征，其特點是血管生成異常導致缺氧和血管滲漏[3]。缺氧等代謝障礙損傷糖尿病患者視網(wǎng)膜組織，引起視網(wǎng)膜炎癥，進而血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）的表達增多，促進新血管形成。由于糖尿病視網(wǎng)膜內(nèi)皮細胞和周細胞的快速凋亡，嚴重破壞了視網(wǎng)膜微血管的平衡，導致進行性血管變性[12-13]。內(nèi)皮細胞損傷伴隨著視網(wǎng)膜內(nèi)屏障的破壞和生長因子、細胞因子和趨化因子的局部釋放，這些因子通過直接作用于內(nèi)皮細胞或通過炎癥細胞產(chǎn)生誘導血管生成的因子而間接發(fā)揮促血管生成活性[14-15]。本研究發(fā)現(xiàn)高濃度葡萄糖明顯抑制內(nèi)皮細胞RF/6A的活力，進而促進細胞遷移和血管形成，與文獻報道一致。VEGF 作為介導缺血誘導的視網(wǎng)膜新生血管形成的主要血管生成因子，是治療和干預PDR 的重要靶點。不過，雖然VEGF 拮抗劑對新生血管的改善效果良好，但在缺血條件下抑制新生血管可能會導致持續(xù)的視網(wǎng)膜缺血。此外，VEGF 對其他視網(wǎng)膜細胞具有保護作用，抗新生血管治療廢除了VEGF 的這一生理功能可能會帶來副作用[16-17]。盡管VEGF 拮抗劑具有強大的抗VEGF 特性，但它并不能完全抑制視網(wǎng)膜纖維血管化，在嚴重的PDR 病例中，也有關(guān)于玻璃體腔注射貝伐單抗后發(fā)生牽拉性視網(wǎng)膜脫離的報道[18]。因此，可能有其他各種因素參與DR 所涉及的纖維化和血管生成過程，研究抗VEGF 以外的其他治療策略很有必要。

姜黃素是從姜黃、莪術(shù)、郁金等植物根莖中提取的多酚類化合物，具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)等廣泛藥理作用，且毒性極低，自古以來被許多國家廣泛用于預防和/或治療多種疾病。近年來在腫瘤方面的研究中，姜黃素表現(xiàn)出明顯的抑制血管生成特性。例如，在肝癌的體內(nèi)體外實驗中，姜黃素可明顯抑制人臍靜脈內(nèi)皮細胞的血管生成，與降糖藥二甲雙胍聯(lián)合應用后效果更為顯著[19]。在結(jié)直腸癌的研究中發(fā)現(xiàn)，植物體姜黃素通過調(diào)控VEGF 信號通路誘導氧化應激和抑制血管生成，從而發(fā)揮抗腫瘤作用[20]。同樣，在惡性胸膜間皮瘤的研究中，姜黃素可以誘導小鼠惡性間皮瘤細胞的凋亡，抑制細胞活性；在腫瘤的小鼠模型中，姜黃素可明顯抑制腫瘤血管生成[21]。本研究觀察了姜黃素對高濃度葡萄糖培養(yǎng)條件下RF/6A 細胞遷移和血管生成的影響，結(jié)果提示姜黃素對高糖誘導的細胞遷移和血管生成具有顯著的抑制作用，與腫瘤血管生成方面的研究結(jié)果相似。另有研究表明，姜黃素可通過調(diào)控內(nèi)皮祖細胞促進新生血管形成，在缺血再灌注損傷（ischemia-reperfusion injury,IRI） 中發(fā)揮保護作用。在心肌IRI 模型中，姜黃素能顯著增加VEGF 分泌，從而促進新生血管形成[22]。在1 型糖尿病小鼠疾病模型中，姜黃素可顯著改善缺血后肢的血流再灌注和毛細血管密度；同時姜黃素的應用增強了內(nèi)皮祖細胞的增殖、遷移能力，促進新生血管形成，機制與姜黃素治療后內(nèi)皮祖細胞中VEGF-A 和血管緊張素-1 表達增多有關(guān)[23]。綜上，姜黃素對血管新生可能通過雙向調(diào)節(jié)機制發(fā)揮保護作用，即在組織缺血狀態(tài)下，姜黃素刺激新生血管形成，改善缺血組織的血供；在病理條件下，姜黃素抑制新生血管形成，減輕病理性新生血管的繼發(fā)組織損害，改善疾病預后。

近年來研究表明，姜黃素是一種有效的治療眼前節(jié)疾病的候選藥物，其效應主要包括角膜疾病中的抗血管生成作用；干眼、結(jié)膜炎、前葡萄膜炎中的抗炎、抗過敏作用；翼狀胬肉中的抗增殖和促凋亡作用；白內(nèi)障中的抗氧化應激、抗?jié)B透應激、抗脂質(zhì)過氧化、促細胞凋亡、調(diào)節(jié)鈣穩(wěn)態(tài)、隔離自由基、蛋白修飾及降解作用以及青光眼中的神經(jīng)保護作用等[24]。此外，脈絡膜新生血管的細胞和動物模型研究也提示，姜黃素能通過抑制炎癥和血管生成過程明顯抑制疾病的進展[25]。由于其抗氧化和抗炎等特性，在合理配制的情況下（考慮到其眼部生物利用度和在視網(wǎng)膜的分布），姜黃素對視網(wǎng)膜疾病的治療具有一定的臨床應用價值[11,26]?？傊狙芯刻崾窘S素在治療DR，尤其是PDR 方面具有臨床應用前景，姜黃素對視網(wǎng)膜血管生成影響的具體機制還需要進一步研究。