程 浩，查 勇 ，高丹丹，丁功濤，馬忠仁，馮若飛

(1.西北民族大學(xué) 生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730030；2.西北民族大學(xué) 生物醫(yī)學(xué)研究中心，甘肅 蘭州 730030；3.日照市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)所，山東 日照 276800 ；4.陜西省土地工程建設(shè)集團(tuán)有限責(zé)任公司寶雞分公司,陜西 西安 710075)

隨著食品工業(yè)的快速發(fā)展和居民生活水平的不斷提高及飲食結(jié)構(gòu)的改善，我國居民對于肉類食品需求增加的同時(shí)，在食品安全方面所面臨的問題也日益嚴(yán)峻[1-2].食品中肉制品摻假的現(xiàn)象也日益增多[3-4].近些年來，在肉制品領(lǐng)域發(fā)生了中國的“瘦肉精事件”、瑞典、英國和法國的“雞、馬肉風(fēng)波”、沃爾瑪?shù)摹昂側(cè)馐录钡萚5-6].飼料產(chǎn)品的安全又是畜產(chǎn)品加工養(yǎng)殖業(yè)的基礎(chǔ)，總有一些不法分子鋌而走險(xiǎn)，添加患病的動(dòng)物性成分在飼料里，輕則會(huì)導(dǎo)致大量牲畜患病死亡，例如非洲豬瘟、瘋牛病等，重則會(huì)對人類健康帶來巨大的危害[7-9].所以對食品和牲畜飼料中動(dòng)物源性成分檢測技術(shù)就顯得尤為重要.

隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，目前已有ELISA法、光譜法、電子鼻等多種食品和牲畜飼料中動(dòng)物源性成分檢測技術(shù)手段，但是這些檢測技術(shù)或多或少都有一定的缺陷，如ELISA法不能很好的對經(jīng)過熱加工變性的樣本進(jìn)行檢測，光譜法設(shè)備昂貴，操作復(fù)雜，電子鼻對環(huán)境要求很高等.而PCR技術(shù)在食品與飼料安全檢測、提升動(dòng)物配種效果、增加產(chǎn)乳量、改善肉質(zhì)、種質(zhì)資源保護(hù)等方面具有很大的優(yōu)勢[10].Cai等人[11]利用Taqman實(shí)時(shí)熒光定量PCR法，根據(jù)牛β-肌動(dòng)蛋白和綿羊催乳素受體基因(PRLR)序列設(shè)計(jì)了特異性引物來檢測牛源和綿羊源性成分，結(jié)果表明，此方法檢測精度和效率均高，可以作為官方和第三方檢測機(jī)構(gòu)的檢測依據(jù)，用來保證食品和飼料行業(yè)產(chǎn)品的質(zhì)量.Silveira等人[12]采用PCR-RFLP技術(shù)研究了生長激素受體(growth hormone,GH)、胰島素生長因子I(insulin-like growth factor 1,IGF-I)和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子5A(STAT5A,5A)基因多態(tài)性與血清YGF-I關(guān)聯(lián)后的荷斯坦奶牛的繁殖能力和產(chǎn)奶量，結(jié)果表明，IGF-I與泌乳奶牛的首次排卵減少和受孕間隔天數(shù)降低相關(guān)，且GHRAluIT等位基因與提高生育力上有一定的關(guān)聯(lián).Zhao等人[13]為了降低食品風(fēng)險(xiǎn)，建立牛肉的可追溯性，使用AFLP-PCR方法從中國不同地方采了牛6個(gè)品種的89個(gè)個(gè)體，獲得了八對組合引物，總共產(chǎn)生了1095個(gè)多態(tài)性片段，并且每種引物都可以成功區(qū)分所有檢測的個(gè)體和所檢測的6個(gè)品種.Martin等人[14]開發(fā)了一種SYBR-Green實(shí)時(shí)PCR法用于對飼料中豬源性成分進(jìn)行定性和定量檢測，結(jié)果表明，該方法對飼料中豬DNA的檢測和定量限低至0.1%.

建立PCR檢測技術(shù)，首先是要獲取高濃度和高純度的DNA[15].常規(guī)提取基因組DNA的方法有：濃鹽法、陰離子去污劑法、水抽提法、試劑盒法等[16-18]，但是傳統(tǒng)提取方法實(shí)驗(yàn)過程繁瑣、消化時(shí)間長且所提取的DNA質(zhì)量難以保證后續(xù)分子生物學(xué)的檢測，食品或者飼料中經(jīng)常將原材料進(jìn)行熱加工處理后才進(jìn)行售賣，因此本研究采用試劑盒法、SDS法和異硫氰酸胍法提取不同動(dòng)物肌肉組織的基因組DNA，并對所提取DNA的純度、濃度進(jìn)行檢測和PCR檢測對比分析，從中篩選出一種動(dòng)物性基因組DNA提取方法，為食品中肉制品檢測和動(dòng)物營養(yǎng)以及動(dòng)物遺傳育種的分子生物學(xué)技術(shù)鑒定提供一個(gè)經(jīng)濟(jì)適用、操作簡單、快速，且滿足后續(xù)PCR檢測分析的DNA提取方法.

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)原材料

生鮮豬肉、牛肉、羊肉、雞肉、草魚肉均購自蘭州市亞歐超市.高壓肉(121℃，高壓 30 min).

1.1.2 儀器與試劑

儀器：DYY-6D型電泳儀(北京六一生物科技有限公司)；PCR儀(德國 Biometar GmbH公司)；ChemiDocTMTouch lmaging System(美國伯樂)；Varioskan LUX-1510型酶標(biāo)儀(美國賽默飛世爾).

試劑：Tissue DNA Kit 50次(美國Omega Biotek公司)；2×Taq Plus Mix、100bp DNA Ladder(北京天根生化科技有限公司)；RNase A(廣州美基生物科技有限公司)；DL 10 000 DNA Marker、6×Lodding Buffer(日本TaKaRa公司)；TES裂解液(1mol/L Tris-Hcl、0.85% Nacl、0.5 mol/L EDTA10%十二烷基磺酸鈉)；異硫氰酸胍裂解液(5 mol/L異硫氰酸胍，0.05 mol/LTris-Hcl、0.02 mol/L EDTA，1.3%Triton-100)；TE緩沖液(0.05 mol/L Tris-Hcl、0.02mol/LEDTA)；Tris-Hcl 、EDTA、SDS、異硫氰酸胍、Triton-100、酚、氯仿、異戊醇、乙醇等化學(xué)試劑均為分析純.

1.2 方法

1.2.1 樣品制備

將待測動(dòng)物肌肉組織樣本用生理鹽水清洗三遍后，去除動(dòng)物組織中的脂肪及結(jié)締組織后稱取30 mg，各取兩份，其中一份放在高壓蒸汽滅菌鍋內(nèi)加熱，將高壓高溫加熱后的組織樣品以及生鮮組織樣品分別放入液氮預(yù)冷的研缽中，然后將液氮緩緩加入研缽中，將樣品迅速研磨至粉末狀后將動(dòng)物組織樣本分別加入1.5 mL離心管內(nèi).

1.2.2 基因組DNA的提取1.2.2.1 SDS法

取50 mg樣品至1.5 mL離心管中，加入400 μLTES裂解液后置于組織研磨儀上至均漿狀態(tài)，然后加入200μL的SDS和20 μL蛋白酶K后56 ℃水浴消化2h，期間每半小時(shí)顛倒混勻一次直至溶液變透明水浴后的裂解液加入等體積的飽和酚，緩慢顛倒混勻5～6 min后靜置5 min，12 000 r/min離心10min；將上清液轉(zhuǎn)移到全新的1.5 mL離心管中；加入相同體積的飽和酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)，緩慢顛倒至均勻，靜靜擱置4～5 min，12 000 r/min離心10 min；取上清液至全新1.5 mL離心管中,加入等體積的氯仿∶異戊醇(24∶1)，搖晃至充分均勻，靜置4～5min，12 000 r/min離心10 min；取上清，加入兩倍體積的無水乙醇(無水乙醇需在-20 ℃預(yù)冷20 min)，12 000 r/min離心10 min；將無水乙醇排凈后加入1 mL的75%的乙醇，緩慢吹打，12 000 r/min離心10 min，此步驟重復(fù)一次；然后將離心管放在室溫干燥5～10 min后加入100 μL TE將DNA溶解后放于-20 ℃?zhèn)溆?

1.2.2.2 異硫氰酸胍法

取50 mg樣品至1.5 mL離心管中，參照文獻(xiàn)[19]的提取方法，取50 mg樣品至1.5 mL離心管中，加入200 μL TE后置于組織研磨儀上至均漿狀態(tài)后，加入400 μL異硫氰酸胍裂解液，渦旋混勻；在離心管里加入600 μL酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)，渦旋劇烈震蕩15 s，13 000 r/min離心10 min；將上清移至新的1.5 mL離心管中，加入等體積氯仿∶異戊醇(24∶1)，渦旋震蕩15 s后13 000 r/min離心10 min；將上清液移至新的1.5 mL離心管中，加入0.8倍體積的異丙醇，12 000 r/min離心10 min；棄掉異丙醇后用1 mL的70%乙醇將離心管底部的沉淀清洗一次后將離心管放置室溫10～15 min干燥，然后加入100 μL TE將DNA溶解后放于-20 ℃?zhèn)溆?

1.2.2.3 試劑盒法

將30 mg組織置于1.5 mL離心管內(nèi)，按照Tissue DNA Kit 50次(美國Omega Biotek公司)試劑盒說明書提取模板DNA，將所提取的的DNA儲(chǔ)存在-20 ℃?zhèn)溆?

1.2.3 DNA濃度及純度測定

用酶標(biāo)儀檢測DNA在230、260和280 nm處的吸收值，以及A260/A280、A260/A230值，來檢測三種方法提取的DNA中鹽分、蛋白質(zhì)、酚等雜質(zhì)的去除情況[20],并同時(shí)檢測DNA濃度.

1.2.4 DNA質(zhì)量檢測

配制1%瓊脂糖凝膠，吸取5μLDNA提取的樣品基因組DNA溶液與上樣緩沖液混勻后，加入上樣孔，并在另一個(gè)孔中加入DL10 000分子量標(biāo)準(zhǔn),配制1.5%瓊脂糖凝膠，在PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中加入上樣緩沖液混勻后加入上樣孔，并在另一個(gè)孔中加入100 bp分子量標(biāo)準(zhǔn).電壓設(shè)定為120 V，電泳30 min后，在凝膠成像分析儀上掃描.

1.2.5 PCR反應(yīng)條件的建立1.2.5.1 引物設(shè)計(jì)

在NCBI中查找豬(基因ID：808513)、牛(基因ID: 3283889)、綿羊(基因ID：808260)、雞(基因ID：39116918)、草魚(基因ID：13230650)的線粒體細(xì)胞色素B基因序列，使用primer5.0軟件設(shè)計(jì)引物，見表1.

1.2.5.2 PCR反應(yīng)條件的建立

PCR反應(yīng)體系為25 μL，各成分含量為：2×Taq酶12.5 μL，上下游引物各1 μL，模板1 μL，無菌水補(bǔ)足至25 μL，輕柔混勻后短暫離心，在PCR儀上開始循環(huán)擴(kuò)增.循環(huán)參數(shù)為：95 ℃預(yù)變性3min，然后進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)為95 ℃變性2min，62 ℃退火30 s，72 ℃延伸20 s.

表1 PCR引物序列

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA的完整性

在提取DNA后，將基因組DNA在1%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳檢測，通過圖1a、圖1b可知三種方法對生鮮組織和高壓組織都能提取出高分子量的基因組DNA(>10 Kb)，生鮮肌肉組織和高壓肌肉組織大部分都出現(xiàn)了彌散性條帶，生鮮肉基因組DNA條帶彌散性低于高壓肉基因組DNA，彌散性上SDS法>異硫氰酸胍法>試劑盒法.表明有可能在提取過程中DNA已經(jīng)出現(xiàn)不同程度的降解，或者在混勻試劑過程中渦旋力度太大，造成長鏈DNA斷裂形成較短DNA片段，所以導(dǎo)致了彌散性條帶的出現(xiàn).所提取的DNA完整性與劉娟、王戊藤等人實(shí)驗(yàn)結(jié)果相比較[21-22]，本實(shí)驗(yàn)的條帶彌散性略高，但是條帶的亮度也高，說明本實(shí)驗(yàn)所提取的DNA濃度高，由于在實(shí)驗(yàn)中混勻用力過度才導(dǎo)致DNA條帶彌散性較為嚴(yán)重.

M：marker(DL10 000 bp)；1、2、3、4、5為SDS法提取的高壓組織基因組DNA；6、7、8、9、10為試劑盒法提取的高壓組織基因組DNA；11、12、13、14、15為異硫氰酸胍法提取的高壓組織基因組DNA.

M：marker(DL10000bp)；1、2、3、4、5為試劑盒提取的基因組；6、7、8、9、10為異硫氰酸胍法提取的基因組；11、12、13、14、15為SDS法提取的基因組.

2.2 DNA的純度及濃度測定

用酶標(biāo)儀測定所提取DNA的純度和濃度，結(jié)果如表2、表3所示.OD260/OD280的比值用來體現(xiàn)蛋白質(zhì)和酚等雜質(zhì)的去除情況，OD260/OD280的比值在1.8左右，說明DNA純度高，低說明DNA中有蛋白質(zhì)以及苯酚等雜質(zhì)未除盡.比值高則說明有RNA.230 nm處是多肽、苯酚、碳水化合物的吸光度，所以O(shè)D260/OD230比值反映了DNA樣品碳水化合物和鹽類等物質(zhì)的污染情況.OD260/OD230比值一般大于2，比值低說明有鹽分、氨基酸和核苷酸等小分子物質(zhì)存在[23].

SDS法、異硫氰酸胍法、試劑盒法對生鮮所提取DNA的OD260/OD280的比值范圍分別是：1.67～1.82，1.78～1.94,1.84～1.92；OD260/OD230比值范圍分別是：1.83～2.24，1.94～2.14，2.14～2.35.對熱加工組織所提取的DNA的OD260/OD280得到比值范圍分別是：1.61～1.75,1.72～1.98,1.91～1.86，OD260/OD230比值范圍分別是：1.91～2.11，1.96～2.15，2.04～2.27.總體來看，生鮮樣品及熱加工樣品所提取的DNA純度及濃度是試劑盒法>異硫氰酸胍法>SDS法，且生鮮組織所提取DNA的純度和濃度都優(yōu)于熱加工組織.可能是因?yàn)榧∪饨M織經(jīng)過熱加工后，樣品中基因組DNA受高溫、高壓影響會(huì)發(fā)生一定程度的降解；SDS法和異硫氰酸胍法在操作時(shí)需要轉(zhuǎn)移上清液至另一離心管中，但是在使用移液槍吸取上清液時(shí)容易將離心后有機(jī)相和水相中所沉淀的雜質(zhì)吸起.SDS法和異硫氰酸胍法所用試劑裂解效果不如試劑盒法.與王萍等人[24]所采用的酚-三氯甲烷法、聚乙烯吡咯烷酮法(PVP法)相比，本實(shí)驗(yàn)異硫氰酸胍法、SDS法在提取的DNA濃度和純度上都要比前者要高.

表2 不同物種生鮮肉DNA濃度及純度檢測

表3 不同物種高壓肉DNA濃度及純度檢測

2.3 PCR擴(kuò)增

將三種方法提取的生鮮組織和熱加工組織的DNA分別擴(kuò)增豬、牛、羊、雞、草魚的線粒體細(xì)胞色素B基因，電泳結(jié)果見圖2所示.各樣品之間擴(kuò)增條帶明亮程度差距較大，且明亮程度與DNA提取濃度的高低趨勢相一致.圖2a的試劑盒法和異硫氰酸胍法提取的生鮮組織DNA經(jīng)過PCR擴(kuò)增后，電泳檢測的條帶亮度清晰且明亮.SDS法提取的基因組DNA經(jīng)過PCR后條帶明亮度程度不一，10、13、14號(hào)樣品清晰度和明亮度較差.表明此三個(gè)樣品PCR產(chǎn)物濃度低且產(chǎn)物質(zhì)量差.

圖2b三種方法提取的基因組DNA經(jīng)PCR擴(kuò)增后于瓊脂糖凝膠電泳檢測觀察，發(fā)現(xiàn)4、9、14、15號(hào)條帶顏色昏暗且條帶彌散嚴(yán)重，表明樣品基因組DNA的PCR產(chǎn)物濃度低，且完整性低于其他樣品.

M：marker(100bp)；1、2、3、4、5為試劑盒提取的生鮮基因組作為模板；6、7、8、9、10為異硫氰酸胍法提取的生鮮基因組作為模板；11、12、13、14、15為SDS法提取的生鮮基因組作為模板，cytb基因擴(kuò)增后的效果.

M：marker(100bp)；1、2、3、4、5為試劑盒提取的高壓基因組作為模板；6、7、8、9、10為異硫氰酸胍法提取的高壓基因組作為模板；11、12、13、14、15為SDS法提取的高壓基因組作為模板，cytb基因擴(kuò)增后的效果.

3 討論

3.1 不同方法提取DNA操作過程及提取質(zhì)量比較

通過對三種DNA提取方法的比較，發(fā)現(xiàn)異硫氰酸胍法無需水浴加熱，操作簡便、快速，單個(gè)樣品可以在30 min內(nèi)完成，比試劑盒法提取時(shí)間至少縮短1小時(shí)，比SDS法提取時(shí)間至少縮短1.5小時(shí).試劑盒法在提取過程中避免使用了有毒的有機(jī)溶劑，所以減少了在操作過程中對操作人員的健康損害.異硫氰酸胍法在操作過程中所使用的有毒的有機(jī)溶劑比SDS法要少，所以對操作人員的損害較少.將異硫氰酸胍法和試劑盒法所提取的DNA的濃度和純度進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)異硫氰酸胍法所提取的DNA的OD260/OD280比值穩(wěn)定在1.8左右，OD260/OD230的比值均大于2.0，證明異硫氰酸胍所提取的DNA的濃度和純度高，證明異硫氰酸胍法提取的DNA質(zhì)量和產(chǎn)率高，蛋白質(zhì)和鹽分等雜質(zhì)去除效果好，效果僅次于試劑盒法.

3.2 擴(kuò)增產(chǎn)物比較

通過后續(xù)PCR產(chǎn)物的電泳圖可知，所得到的擴(kuò)增帶的亮度和完整性完全可以媲美試劑盒法所提取的DNA，所以異硫氰酸胍法所提取的DNA可以滿足以PCR為基礎(chǔ)的分子生物學(xué)檢測技術(shù)的要求.從擴(kuò)增產(chǎn)物的質(zhì)量來看，高壓肉擴(kuò)增條帶的完整性稍差于生鮮肉的擴(kuò)增條帶，因?yàn)楦邷馗邏合聦?dǎo)致DNA片段降解斷裂，不能形成完整的DNA片段，在擴(kuò)增過程中，引物不能很好地與DNA鏈進(jìn)行結(jié)合，所以在擴(kuò)增過后，高溫處理過的擴(kuò)增產(chǎn)物條帶比生鮮肉條帶的完整性差，且不均一.

4 結(jié)論

1)異硫氰酸胍法所提取的DNA濃度和純度與試劑盒提取的濃度及純度相近，都要高于SDS法.

2)異硫氰酸胍法提取的DNA經(jīng)過PCR擴(kuò)增后，產(chǎn)物條帶清晰明亮，完全滿足對PCR擴(kuò)增要求.

3)異硫氰酸胍提取動(dòng)物組織基因組DNA，操作簡單、快速，DNA產(chǎn)率與質(zhì)量高.

4)異硫氰酸胍法是一種有效的大量提取動(dòng)物基因組DNA的方法，并且可以滿足PCR等后續(xù)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的要求.