王 昱

(隴南師范高等?？茖W(xué)校 農(nóng)林技術(shù)學(xué)院隴南特色農(nóng)業(yè)生物資源研究開發(fā)中心， 甘肅 成縣 742500)

太歲是肉靈芝，生長于地下，介于原生物與真菌之間的大型粘菌復(fù)合體，結(jié)構(gòu)不是由單一的細菌構(gòu)成，而是由細菌、粘菌、真菌三類物質(zhì)構(gòu)成的聚合體，十分稀有，是百藥中的上品.太歲中主要的有效成分是吡咯喹啉醌、氨基酸、維生素、微量元素[1]，具有補中益氣、消除疲勞及延緩衰老等藥理作用[2].熊川等[3]采用白肉靈芝水提物影響體外培養(yǎng)的PC-12細胞，發(fā)現(xiàn)能有效促進PC-12 細胞分化，對神經(jīng)元有很好的保護作用.本課題前期研究表明，肉靈芝水提物能增加膠原蛋白含量、抑制皮膚細胞DNA損傷、調(diào)節(jié)皮膚衰老相關(guān)基因的表達[4].為了進一步驗證TSAE的藥理作用，本研究構(gòu)建了衰老大鼠模型，利用生物顯微技術(shù)、酶聯(lián)免疫吸附、定量PCR及Western blot等技術(shù)研究太歲水提物抗衰老作用及機制.

1 材料與方法

1.1 太歲水提物制備

太歲為本實驗室培養(yǎng)，35 ℃烘干子實體，提取DNA.選用真菌通用引物ITS1和ITS4對子實體DNA進行擴增，電泳檢測后條帶純化，純化樣品送至上海生物工程有限公司進行測序.鑒定結(jié)果表明,該樣本為太歲(白肉靈芝).根據(jù)文獻[3]，取太歲子實體干品粉碎機粉碎，60目過篩，96 ℃水浴提取6 h、離心、收集上清液、過濾.濾液凍干，得到太歲水提物.

1.2 動物模型建立與給藥

健康SD大鼠50只(許可證號：SCXK(甘)2005-0007)，體質(zhì)量200～250 g，雌雄各半).同條件飼養(yǎng)一周后隨機分為5組:對照組、模型組、TSAE低劑量組、TSAE中劑量組和TSAE高劑量組,每組10只.模型組和TSAE組大鼠頸背部皮下注射D-半乳糖(北京優(yōu)尼康生物科技，批號MG05201)溶液300 mg/kg·bw[5]，同時TSAE低、中、高劑量組分別灌胃(50、100 和200 mg /kg·bw)的TSAE[6]，對照組每天注射等量的0.9% 生理鹽水，連續(xù)處理7周.

1.3 組織學(xué)觀察

采用頸椎脫臼法處死大鼠，用 8%硫化鈉溶液脫毛后立即取大鼠背部正中皮膚(0.5 cm × 0.5 cm 大小)2 塊，去掉皮下脂肪及結(jié)締組織，投入4%多聚甲醛液固定24 h.常規(guī)石蠟包埋切片(6 μm)，H.E染色，在光學(xué)顯微鏡(Olympus，F(xiàn)X-35WA，Japan)下觀察并拍照.

1.4 酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法檢測大鼠皮膚組織中透明質(zhì)酸的質(zhì)量濃度

取背部皮膚的真皮，按照ELISA檢測試劑盒(ELx800，美國BioTek公司)說明書操作，檢測各組大鼠皮膚組織中透明質(zhì)酸(hyaluronic acid,Ha)的質(zhì)量濃度.

1.5 Western blot檢測各組大鼠皮膚HABP1、角蛋白K19表達

取大鼠背部皮膚的表皮進行RIPA裂解，提取總蛋白，BCA法測定總蛋白濃度.樣品經(jīng)過SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳及轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉.一抗單克隆兔抗鼠透明質(zhì)酸結(jié)合蛋白1(hyaluronan binding prolcint HABP1)、角蛋白K19(濃度均為1︰1000)在室溫下孵育2 h，4 ℃過夜.充分洗滌，加偶聯(lián)辣根過氧化物酶(HRP)的二抗(濃度為1︰5000)孵育，洗膜后加ECL顯影，以β-actin作為內(nèi)參照，運用Image Lab 軟件進行曝光成像，采用Quantity one 軟件分析條帶灰度值，實驗重復(fù)3次.

1.6 PCR檢測皮膚HABP1和表皮K19 mRNA表達水平

取大鼠皮膚，放入2 mL 的離心管，加入1 mL Trizol后用勻漿器反復(fù)研磨，離心(14 000 rpm)10 min.取上清液通過酚-氯仿抽提RNA.以總RNA為模板逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA后進行實時熒光PCR檢測(RNA抽提試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑、定量PCR試劑Taka Ra公司)，并采用 ABI 7500 軟件分析，用2-△△Ct方法進行相對定量.其中K19引物序列上游-CAGATAAGCAAGACCGAAG，下游-CAGCTGGACTCCATAACG；HABP1引物序列上游-TTGTCTCCATCTGGGTTTCTG，下游-CTACGTTGACGACGGCTACTC；β-actin引物序列上游-GAGGGAAATCGTGCGTGAC，下游-CTGGAAGGTGGACAGTGAG.引物由上海涵悅生物科技有限公司設(shè)計，上海生工生物技術(shù)有限公司合成.

1.7 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果

2.1 TSAE對大鼠皮膚組織結(jié)構(gòu)的影響

對照組大鼠皮膚組織結(jié)構(gòu)正常，沒有明顯的病理損害特征.模型組大鼠表皮變薄，結(jié)構(gòu)不完整，皮膚附屬器減少；真皮和皮下結(jié)締組織被致密、無彈性的纖維化組織所替代，皮膚纖維化嚴重.TSAE高劑量組大鼠皮膚組織形態(tài)接近對照組，表皮較厚，組織結(jié)構(gòu)完整，皮膚附屬器較多,見圖1.

A.對照組； B.模型組； C.TSAE高劑量組(標尺示50 μm)

2.2 TSAE對大鼠皮膚組織HA質(zhì)量濃度的影響

與對照組相比，模型組大鼠皮膚組織HA質(zhì)量濃度顯著下降(P< 0.01).與模型組相比，TSAE低、中、高劑量組大鼠皮膚組織HA質(zhì)量濃度明顯升高(P< 0.05，P< 0.01),見圖2.

同列數(shù)據(jù)肩標不同小寫字母表示差異顯著(P < 0.05)；肩標不同大寫字母表示差異極顯著(P < 0.01)；肩標相同字母或無字母標注表示差異不顯著(P > 0.05),下同.

2.3 TSAE對大鼠皮膚HABP1、表皮K19表達的影響

以β-actin 的吸光度值作為內(nèi)參照，對各組條帶的吸光度值校正后進行半定量分析.與對照組相比，模型組大鼠皮膚HABP1、表皮K19蛋白含量極顯著降低(P< 0.01).經(jīng)TSAE干預(yù)后，TSAE低、中、高劑量組大鼠皮膚HABP1、表皮K19蛋白含量呈明顯升高趨勢(P< 0.05，P< 0.01).以上結(jié)果與PCR檢測HABP1、表皮K19 mRNA結(jié)果一致(圖3，圖4).

注：1.對照組； 2.模型組； 3.TSAE低劑量組；4.TSAE中劑量組；5.TSAE高劑量組

圖4 各組大鼠皮膚HABP1、K19 mRNA表達

3 討論

人體衰老是一個多因素、多系統(tǒng)的不可逆過程，常伴隨著組織、器官功能的退行性變化.皮膚的衰老是機體整體老化的一部分，是機體內(nèi)各種生化反應(yīng)的綜合過程[7].基于傳統(tǒng)中藥理論，采用現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)手段提取天然產(chǎn)物有效成分，開發(fā)用于美容治療及皮膚健康保健的功能性食品是當前重要課題之一.本實驗衰老大鼠模型，從皮膚形態(tài)學(xué)上的改變來觀察太歲水提物的作用.模型組大鼠皮膚組織結(jié)構(gòu)出現(xiàn)了明顯的病理改變，表皮變薄，表皮、真皮及皮下組織層次不明顯.采用TSAE作用后，大鼠皮膚結(jié)構(gòu)完整，表皮增厚，真皮內(nèi)膠原纖維增多，排列比較緊密、整齊.這表明TSAE對衰老大鼠皮膚組織的損傷有明顯的保護作用.

HA是生物體內(nèi)一種天然高分子多糖，為皮膚細胞外基質(zhì)的重要成分，也是一種重要的結(jié)構(gòu)支撐和保濕物質(zhì)，可根據(jù)周圍組織的含水量改變自身的吸水量，進而調(diào)節(jié)皮膚水分平衡和維持細胞結(jié)構(gòu)[8].保持皮膚的韌性和彈性，HA也能夠清除生物體內(nèi)自由基，延緩皮膚衰老[9].HABP1具有獨特的晶體結(jié)構(gòu)，屬于透明質(zhì)酸黏素家族中的一員，能夠與HA高度特異性結(jié)合，與透明質(zhì)酸的含量呈正相關(guān)系[10].在哺乳動物細胞內(nèi)外均有表達，與多種細胞蛋白發(fā)生作用，具有細胞間黏附、細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細胞凋亡、精子成熟和運動等多種功能[11].本實驗結(jié)果顯示，模型大鼠皮膚組織HA質(zhì)量濃度、HABP1表達均顯著下降，說明HA含量減少可能是導(dǎo)致大鼠皮膚組織病理改變的重要原因.而經(jīng)TSAE作用后，皮膚組織HA質(zhì)量濃度、HABP1表達顯著升高，說明TSAE對衰老大鼠皮膚組織HA質(zhì)量濃度及HABP1表達有促進作用，而HA含量的增加明顯改善了衰老的皮膚組織.

角蛋白是一類典型中間絲家族成員，是上皮細胞骨架的重要組成部分，在不同的上皮類型或者不同的細胞分化狀態(tài)中，具有分子多樣性的特點[12].表皮干細胞是皮膚特異的干細胞，主要位于表皮基底層，具有很強的分裂增殖能力，對于保持皮膚正常結(jié)構(gòu)、內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定、自我更新及自我修復(fù)具有重要意義[13,14].K19是表皮干細胞表明特異性的標記物，在正常皮膚組織基底層中呈陽性表達，而且其表達量與表皮干細胞的數(shù)量呈正向關(guān)系.嬰兒皮膚K19的表達量要顯著高于成年人[15-18]，表明角蛋白在皮膚衰老中發(fā)揮著重要作用.本實驗用PCR和Western blot研究結(jié)果表明，模型大鼠皮膚表皮K19表達顯著下降，說明衰老表皮上皮干細胞的增殖更新能力受到明顯的抑制.而經(jīng)TSAE作用后，皮膚表皮K19表達顯著升高，說明TSAE對衰老大鼠表皮中K19 的表達有促進作用，這可能通過促進表皮干細胞的增殖延緩皮膚衰老速度.

綜上所述，TSAE能夠改善衰老大鼠皮膚組織的形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)，這種作用可能與干預(yù)HA的含量和表皮角蛋白K19的表達有關(guān).但對于太歲中有效生物成分的藥用價值，目前無合理的科學(xué)解釋，還需大量的藥理實驗驗證.