鮮 亮，敖尼蘇，席 蓓，楊 梅，盧亞超，康香蕊

(1. 西北民族大學(xué) 化工學(xué)院，甘肅 蘭州 730124；2.甘肅省高校環(huán)境友好復(fù)合材料及生物質(zhì)利用省級重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730124)

L-抗壞血酸(AA)是人體必需的營養(yǎng)物質(zhì)之一，也是維持人體機(jī)能的一種重要的維生素.蔬菜、水果類食品是AA的日常主要來源.AA穩(wěn)定性較差，其結(jié)構(gòu)中含有烯二醇結(jié)構(gòu)，故而呈現(xiàn)出一定的酸性(圖1)，在空氣中較穩(wěn)定，但其水溶液易被空氣和其他氧化劑氧化，生成脫氫抗壞血酸.其在堿性條件下易分解，見光加速分解，在弱酸條件中相對比較穩(wěn)定，在食品工業(yè)中常用作抗氧化劑、酸味劑及強(qiáng)化劑等[1-2].

由于AA具有較強(qiáng)的還原性,所以，在食品加工和存儲過程中，其含量易受環(huán)境的影響.AA可以和空氣中的氧或溶解氧發(fā)生反應(yīng)，喪失其營養(yǎng)價(jià)值.因此，有必要對AA在水溶液中的存在狀態(tài)及其穩(wěn)定性影響因素進(jìn)行深入細(xì)致的研究[3-4].

目前，有多種方法可以檢測AA水溶液狀態(tài)下的含量和穩(wěn)定性變化，包括色譜法、化學(xué)分析法、分光光度法以及點(diǎn)化學(xué)方法等[5-6].這些方法中，從準(zhǔn)確性、方便性和實(shí)用性而言，紫外-可見分光光度法(UV-Vis)是一個(gè)較佳的選擇[7].

由于AA分子結(jié)構(gòu)當(dāng)中含有剛性結(jié)構(gòu)，所以，其在紫外光區(qū)243～265 nm范圍內(nèi)有較為明顯的最大吸收峰.稀溶液的吸收峰強(qiáng)度應(yīng)當(dāng)符合Lambert-Beer定律.該方法操作簡單、快速、準(zhǔn)確，不受還原性物質(zhì)干擾，回收率高，也無需特殊儀器和試劑，具有較高的使用價(jià)值.目前，對于食品中水溶液狀態(tài)下的AA含量檢測大多采用此種方法.但在實(shí)際的檢測過程中，因?yàn)闃悠繁旧淼奶崛∫簆H不同、化學(xué)組成成分極其復(fù)雜、其他維生素的存在以及在空氣中的氧化還原反應(yīng)等因素的影響，會導(dǎo)致AA吸收峰強(qiáng)度和波長發(fā)生相應(yīng)的變化.這些UV-Vis吸收峰強(qiáng)度和波長的變化都會影響AA檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性.鑒于此，本文針對UV-Vis分光光度法中濃度和pH值對AA的吸收光譜的影響進(jìn)行了深入細(xì)致的研究.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑和儀器

主要試劑為L-抗壞血酸(AR)、鹽酸(AR，6 mol/L)，試劑使用前未經(jīng)進(jìn)一步純化.主要儀器為紫外-可見分光光度計(jì)(UV-1200，上海美譜達(dá)儀器有限公司)、移液槍(TopPette手動單道可調(diào)式，大龍興創(chuàng)實(shí)驗(yàn)儀器有限公司)、電子天平(凱豐高精密電子天平，凱豐集團(tuán)有限公司)、pH酸度計(jì)(上海雷磁 PHB-4).

1.2 不同濃度AA水溶液的配制

典型的配制過程如下：在室溫下稱取AA 0.080 0 g，置于1 000 mL容量瓶中，以去離子水定容，配制成80 μg/mL的溶液.再從其中分別量取75 mL、50 mL、37.5 mL、25 mL、12.5 mL以及6.25 mL的溶液置于100 mL容量瓶中后以去離子水定容，從而得到包括反應(yīng)母液在內(nèi)的80 μg/mL、60 μg/mL、40 μg/mL、30 μg/mL、20 μg/mL、10 μg/mL和5 μg/mL的AA水溶液樣品.其pH值分別為3.66、3.73、3.83、3.91、4.21及4.43.搖勻后于4 ℃冰箱中避光靜置待用.

1.3 不同pH值A(chǔ)A水溶液的配制

典型的配制過程如下：從配制好的80 μg/mL溶液中平行取4份50 mL AA水溶液，轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中后以去離子水定容，配制成40 μg/mL的AA水溶液.以移液槍分別加入10 μL、20 μL以及40 μL的6 mol/L的鹽酸，獲得pH值分別為3.19、2.91及2.62的不同pH的AA水溶液樣品(加入鹽酸導(dǎo)致的總體積變化忽略不計(jì))，搖勻后于4 ℃冰箱中避光靜置待用.

1.4 UV-Vis吸收光譜測量

AA的氧化反應(yīng)速率主要以UV-Vis吸收曲線進(jìn)行檢測.主要檢測不同濃度和不同酸度條件下UV-Vis最大吸收峰波長和強(qiáng)度變化以及隨時(shí)間變化的動力學(xué)過程.典型的UV-Vis實(shí)驗(yàn)條件是：從上述配制好的樣品溶液取出樣品至具塞石英比色皿中，在200～700 nm范圍內(nèi)每隔一定時(shí)間測定其UV-Vis曲線.

2 結(jié)果與討論

2.1 AA水溶液的濃度、pH值對AA水溶液最大吸收峰強(qiáng)度及波長的影響

圖2 不同濃度(80、60、40、30、20、10和5 μg/mL)AA水溶液UV-Vis吸收曲線(插圖為最大吸收峰強(qiáng)度的Lambert-Beer線性擬合)

通過對不同濃度AA水溶液(80、60、40、30、20、10、5 μg/mL)的UV-Vis最大吸收的測定(圖2)，獲得吸收峰和濃度之間的線性擬合方程為y=0.0391+0.1287，擬合度為0.9996，說明在5～80 μg/mL的濃度范圍內(nèi)，AA的吸收峰強(qiáng)度完全符合稀溶液Lambert-Beer定律.AA在紫外光區(qū)產(chǎn)生吸收峰的主要原因在于其結(jié)構(gòu)當(dāng)中剛性環(huán)的存在.這種吸光度和濃度的高度線性相關(guān)性是水溶液中AA含量的UV-Vis檢測方法可靠性的理論基礎(chǔ).

值得注意的是，雖然前期的文獻(xiàn)報(bào)道中大多數(shù)以265 nm或243 nm處的吸收峰強(qiáng)度檢測AA濃度[8]，但較少有文獻(xiàn)關(guān)注最大吸收峰位置隨酸度的變化情況.而在上述UV-Vis實(shí)驗(yàn)中，除驗(yàn)證了已知的線性相關(guān)性以外，從圖2中發(fā)現(xiàn)UV-Vis最大吸收峰發(fā)生了顯著的藍(lán)移.如圖3a所示，其濃度和最大吸收峰波長呈現(xiàn)明顯的線性負(fù)相關(guān)性.而在添加了鹽酸的pH值減小的40 μg/mL樣品中，也觀察到了最大吸收峰的藍(lán)移現(xiàn)象.以上述樣品pH值為橫坐標(biāo)，以最大吸收峰波長為縱坐標(biāo)，可以獲得最大吸收峰藍(lán)移和pH值的關(guān)系曲線(圖3b).

圖3 a. AA水溶液最大吸收峰波長和濃度(5、20、30、40、60、80 μg/mL)之間線性負(fù)相關(guān)；b. AA水溶液最大吸收峰波長隨溶液pH變化曲線

從圖3b中可以看到，隨著溶液樣品的pH值從4.4變化到2.6，最大吸收峰從265 nm逐漸藍(lán)移至243 nm.其四次方多項(xiàng)式擬合方程曲線呈現(xiàn)了一個(gè)明顯的拐點(diǎn).擬合曲線拐點(diǎn)切線和擬合曲線相交的A、B兩點(diǎn)(圖3b)pH值分別為4.1和3.5.pH值降低，c(H+)迅速增大，隨后產(chǎn)生AA羰基質(zhì)子化.這導(dǎo)致羰基氧原子與C=C的共軛程度降低，π-π*躍遷能量升高，從而發(fā)生藍(lán)移.

2.2 濃度對AA水溶液穩(wěn)定性影響的動力學(xué)研究

圖4 不同濃度(80 μg/mL和60 μg/mL)AA水溶液歸一化最大吸收峰強(qiáng)度隨時(shí)間(h)變化速率

為了研究濃度對AA氧化速率的影響,考察不同濃度AA最大吸收峰隨時(shí)間變化的速率.圖5及圖6分別為80、60、30、5 μg/mL的AA水溶液隨時(shí)間變化曲線.從圖中可以看到，在較高的濃度下(60～80 μg/mL)，AA在實(shí)驗(yàn)條件下(室溫18～20 ℃，溶液靜置在具塞石英比色皿中)的氧化反應(yīng)中，最大吸收峰隨時(shí)間線性負(fù)相關(guān)，呈現(xiàn)零級反應(yīng)的特征.而在較稀的AA溶液中(5～30 μg/mL)，最大吸收峰的自然對數(shù)值和時(shí)間線性負(fù)相關(guān)，呈現(xiàn)一級反應(yīng)的特征.

圖5 不同濃度(30 μg/mL和5 μg/mL)AA水溶液ln(Amax)隨時(shí)間變化速率

2.3 c(H+)對AA抗氧化性的影響

為了解c(H+)對AA抗氧化性的影響,實(shí)驗(yàn)研究了40 μg/mL濃度的AA水溶液在不同pH值下的最大吸收峰強(qiáng)度和時(shí)間的關(guān)系.從圖6可以看到，隨著鹽酸加入量的增加(10 μL、20 μL、40 μL)，歸一化的最大吸收峰強(qiáng)度和時(shí)間呈現(xiàn)線性負(fù)相關(guān)，從而表觀反應(yīng)速率常數(shù)分別為0.012 7 h-1、0.012 2 h-1和0.009 7 h-1，呈現(xiàn)逐漸減緩的趨勢.該實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明，酸性的增加有助于AA在水溶液中的穩(wěn)定性.結(jié)合前述圖3b的討論，該實(shí)驗(yàn)結(jié)果合理的推論是：在酸度調(diào)節(jié)到小于3.5之后，能將稀AA水溶液空氣環(huán)境下的氧化反應(yīng)從一級反應(yīng)轉(zhuǎn)變?yōu)榱慵壏磻?yīng)，從而降低了氧化還原反應(yīng)速率，即達(dá)到對水溶液中的低濃度AA抗氧化保護(hù)作用的最大化.

圖6 不同酸度(鹽酸加入量40 μL、20 μL、10 μL)AA水溶液(濃度40 μg/mL)歸一化最大吸收峰強(qiáng)度隨時(shí)間(h)變化速率的線性擬合

3 結(jié)論

AA水溶液的不同濃度和不同酸度對AA的UV-Vis最大吸收峰的波長和強(qiáng)度具有較大的影響，而這種影響對AA的UV-Vis檢測結(jié)果的準(zhǔn)確與否至關(guān)重要.實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，AA的Amax隨著濃度的增加而逐漸發(fā)生藍(lán)移.高濃度AA在空氣環(huán)境中的氧化反應(yīng)為零級反應(yīng)，而低濃度AA在空氣環(huán)境中的氧化反應(yīng)為一級反應(yīng).c(H+)的加大對AA穩(wěn)定性具有顯著的幫助.當(dāng)pH值調(diào)節(jié)到<3.5以后，即能夠使相對較烯的AA溶液也能夠以零級反應(yīng)方式進(jìn)行.上述結(jié)論對于AA的UV-Vis測定結(jié)果的準(zhǔn)確性以及研究果蔬的AA提取、保護(hù)和提取液酸度的選擇具有一定的參考價(jià)值.