覃燕，唐習(xí)強(qiáng)，曾德創(chuàng)，覃花杏，黃薪伊，楊迪

(1. 右江民族醫(yī)學(xué)院護(hù)理學(xué)院，廣西 百色 533000；2. 右江民族醫(yī)學(xué)院研究生學(xué)院2019級(jí)，廣西 百色 533000；3. 右江民族醫(yī)學(xué)院2018級(jí)臨床本科教改班，廣西 百色 533000；4. 右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院小兒外科，廣西 百色 533000)

食管癌是我國(guó)消化道常見(jiàn)的惡性腫瘤之一。食管癌具有惡性程度高、預(yù)后差的特點(diǎn)，患者5年的生存率約為15%，嚴(yán)重威脅人們的生命健康[1-2]。因此，對(duì)食管癌的早期診斷、早期治療及延長(zhǎng)食管癌患者生存時(shí)間是臨床上需探究的問(wèn)題之一。食管癌主要是以進(jìn)行性吞咽困難為首要癥狀，大部分確診食管癌患者已進(jìn)入中晚期，食管癌的治療主要以手術(shù)為主，放療、化療等多種治療方式聯(lián)合治療。目前評(píng)估食管癌的生物學(xué)行為及預(yù)后的方法主要有臨床分期、病理分級(jí)、影像學(xué)、術(shù)后病理結(jié)果等，而食管癌的評(píng)估及治療手段并不能完全反應(yīng)食管癌的生物學(xué)行為及不能較理想地延長(zhǎng)患者的生存時(shí)間。因此，在食管癌中尋找新的評(píng)估指標(biāo)對(duì)評(píng)估食管癌生物學(xué)行為并延長(zhǎng)患者生存時(shí)間具有重要的意義。

腫瘤免疫細(xì)胞浸潤(rùn)是指免疫細(xì)胞從血液中移向腫瘤組織中，并發(fā)揮免疫細(xì)胞作用，在腫瘤發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中可能發(fā)揮重要的作用。經(jīng)過(guò)多年研究及探索，腫瘤組織中浸潤(rùn)的免疫細(xì)胞可以通過(guò)直接殺傷腫瘤細(xì)胞來(lái)抑制腫瘤組織的生長(zhǎng)[3]。大量的臨床研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤組織中的免疫細(xì)胞浸潤(rùn)與臨床特點(diǎn)具有相關(guān)性，因此，腫瘤組織中的免疫細(xì)胞有可能成為腫瘤診斷或者治療中的新靶點(diǎn)。目前研究免疫細(xì)胞浸潤(rùn)的實(shí)驗(yàn)方法大多是免疫組化、流式細(xì)胞技術(shù)和免疫熒光技術(shù)，現(xiàn)階段運(yùn)用這些實(shí)驗(yàn)技術(shù)進(jìn)行大規(guī)模浸潤(rùn)免疫細(xì)胞檢測(cè)，其結(jié)果并不能全面闡述不同亞群的免疫細(xì)胞，并且實(shí)驗(yàn)成本高，消耗大量的人力和時(shí)間。因此，運(yùn)用生物信息學(xué)技術(shù)可為研究者們提供很多有價(jià)值的信息，同時(shí)也能為后續(xù)的研究指明方向。TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.cancer.gov/about-cancer)是美國(guó)國(guó)家癌癥研究所(National Cancer Institute)和美國(guó)人類基因組研究所(National Human Genome Reseach Instisute)共同監(jiān)督的一個(gè)項(xiàng)目，旨在應(yīng)用高通量的基因組分析技術(shù)，以幫助人們對(duì)癌癥有個(gè)更好的認(rèn)知，從而提高對(duì)于癌癥的預(yù)防、診斷和治療能力，每年都會(huì)有大量的數(shù)據(jù)源自TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)的文章發(fā)表[4]。例如：2018年，Wu H等[5]分析TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，TFAP2B在子宮內(nèi)膜癌呈低表達(dá)，并且與子宮內(nèi)膜癌預(yù)后有關(guān)。2018年，Zhu XF等[6]利用TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)挖掘了肺腺癌中的DNA甲基化生物標(biāo)志物。2019年，Kurbatov V等[7]利用TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)在早期肺腺癌中分析免疫細(xì)胞，推測(cè)早期肺腺癌中富含靜息肥大細(xì)胞及巨噬細(xì)胞的患者臨床風(fēng)險(xiǎn)較低。因此，運(yùn)用生物信息學(xué)技術(shù)分析TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中與腫瘤相關(guān)數(shù)據(jù)，為研究的起步及實(shí)驗(yàn)方向起到了很好的引導(dǎo)作用。CIBERSORT是2015年由Bindea G等開(kāi)發(fā)的反卷積算法，可以基于標(biāo)準(zhǔn)化的基因表達(dá)數(shù)據(jù)來(lái)估算復(fù)雜組織的細(xì)胞組成，該方法能量化特定細(xì)胞類型的豐度，通過(guò)流式細(xì)胞學(xué)技術(shù)很好地驗(yàn)證并成功地評(píng)估了乳腺癌及肝癌組織中免疫細(xì)胞的組成[8-10]。CIBERSORT可被運(yùn)用并計(jì)算組織中22種免疫細(xì)胞所占總免疫細(xì)胞的比例，這22種免疫細(xì)胞包括：7種T細(xì)胞(CD8+T細(xì)胞、CD4+幼稚T細(xì)胞、CD4+靜息記憶T細(xì)胞、CD4+激活記憶T細(xì)胞、濾泡輔助T細(xì)胞、調(diào)節(jié)T細(xì)胞、YST細(xì)胞)，3種B細(xì)胞(幼稚B細(xì)胞、記憶B細(xì)胞、漿細(xì)胞)，NK細(xì)胞(靜息NK細(xì)胞、激活NK細(xì)胞)及多種髓系細(xì)胞(單核細(xì)胞、MO巨噬細(xì)胞、M1巨噬細(xì)胞、M2巨噬細(xì)胞、靜息樹(shù)突狀細(xì)胞、激活樹(shù)突狀細(xì)胞、靜息肥大細(xì)胞、激活肥大細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、中性粒細(xì)胞[8])。目前在對(duì)乳腺癌[10]、胃癌[11]、直腸癌[12]、腎細(xì)胞癌[13]、前列腺癌[14]等的基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)的研究中，已有運(yùn)用CIBERSORT方法基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)運(yùn)算出腫瘤組織中免疫細(xì)胞浸潤(rùn)，而在食管癌組織的研究中，相關(guān)的研究報(bào)道較少。因此，本研究通過(guò)登錄TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)，運(yùn)用CIBERSORT計(jì)算方法探討食管癌中浸潤(rùn)免疫細(xì)胞表達(dá)，為免疫細(xì)胞在食管癌中的研究提供一定的理論依據(jù)，同時(shí)也為課題研究指明方向。

1 數(shù)據(jù)來(lái)源及方法

1.1 數(shù)據(jù)來(lái)源 本研究通過(guò)登錄TCGA官方網(wǎng)站(https://portal.gdc.cancer.gov/)篩選并下載與食管癌相關(guān)基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)矩陣及相關(guān)臨床數(shù)據(jù)，同時(shí)下載相關(guān)臨床數(shù)據(jù)。所有數(shù)據(jù)均通過(guò)TCGA官方網(wǎng)站下載或TCGA官方軟件下載。

1.2 方法 通過(guò)運(yùn)用Perl軟件將所下載食管癌基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)提取并進(jìn)行整理及基因名轉(zhuǎn)換，最終得到行名是基因名，列名為組織的基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)。登錄CIBERSORT官網(wǎng)下載22種免疫細(xì)胞的CIBERSPRT.R代碼，運(yùn)用R語(yǔ)言中e1071及parallel數(shù)據(jù)包運(yùn)算并濾過(guò)表達(dá)譜數(shù)據(jù)免疫細(xì)胞浸潤(rùn)表達(dá)準(zhǔn)確性較差的樣品，最終得到22種免疫細(xì)胞在例子中的表達(dá)量，以百分比表示。運(yùn)用R語(yǔ)言分析并繪制出22種免疫細(xì)胞在每例樣品中的表達(dá)量；運(yùn)用R語(yǔ)言中pheatmap包繪制出免疫細(xì)胞相關(guān)熱圖；在R語(yǔ)言中下載vioplot包，計(jì)算并繪制出免疫細(xì)胞在食管癌及正常組織中差異表達(dá)；在生存分析中，運(yùn)用R語(yǔ)言中的survival數(shù)據(jù)包計(jì)算22種免疫細(xì)胞是否與患者生存時(shí)間有關(guān)；將入組食管癌患者的臨床資料導(dǎo)入R語(yǔ)言中，并計(jì)算出22種免疫細(xì)胞與食管癌臨床數(shù)據(jù)的相關(guān)性，繪制相關(guān)箱線圖。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 本研究運(yùn)用R語(yǔ)言(3.4.1)內(nèi)的多個(gè)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)包將數(shù)據(jù)導(dǎo)入R軟件并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析及結(jié)果圖片繪制。計(jì)量資料運(yùn)用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料運(yùn)用χ2檢驗(yàn)，生存分析采用Kaplan-Meier法Log-rank檢驗(yàn)，對(duì)于所有統(tǒng)計(jì)學(xué)計(jì)算，最終結(jié)果以P<0.05確定為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 76例食管癌的臨床信息 在TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)所下載處理的食管癌組織及正常組織，依據(jù)CIBERSORT運(yùn)算法則，首先需計(jì)算并剔除準(zhǔn)確性較差的樣品，最終得到76例食管癌組織和2例正常組織，而相關(guān)臨床數(shù)據(jù)包括性別、臨床分期、病理分期等(見(jiàn)表1)。

表1 76例食管癌患者臨床資料

2.2 免疫細(xì)胞在食管癌中的表達(dá) 依據(jù)CIBERSORT運(yùn)算法則剔除不符合用于分析免疫細(xì)胞浸潤(rùn)的樣品后，最終得到76例食管癌組織，進(jìn)一步運(yùn)算得到22種免疫細(xì)胞在每個(gè)樣品里的表達(dá)百分比，并繪制出百分比圖及熱圖。例如：樣品TCGA-L5-A4OS-01A-11R-A28J-31中22種浸潤(rùn)免疫細(xì)胞占比分別為：幼稚B細(xì)胞：9%；記憶B細(xì)胞：0%；漿細(xì)胞：10%；CD8+T細(xì)胞：0%；CD4+幼稚T細(xì)胞：0%；CD4+靜息記憶T細(xì)胞：10%；CD4+激活記憶T細(xì)胞：2%；濾泡輔助T細(xì)胞：2%；調(diào)節(jié)T細(xì)胞：1%；YST細(xì)胞：1%；激活NK細(xì)胞：2%；靜息NK細(xì)胞：9%；單核細(xì)胞：0%；M0巨噬細(xì)胞：0%；M1巨噬細(xì)胞：23%；M2巨噬細(xì)胞：5%；靜息樹(shù)突狀細(xì)胞：15%；激活樹(shù)突狀細(xì)胞：0%；靜息肥大細(xì)胞：1%；激活肥大細(xì)胞：5%；嗜酸性粒細(xì)胞：5%；中性粒細(xì)胞：0%，免疫細(xì)胞表達(dá)結(jié)果運(yùn)用R語(yǔ)言繪制出百分比圖及熱圖(見(jiàn)圖1、圖2)。

2.3 免疫細(xì)胞在食管癌與正常組織中的表達(dá)差異 通過(guò)對(duì)比食管癌中免疫細(xì)胞與正常組織表達(dá)差異，研究發(fā)現(xiàn)22種免疫細(xì)胞中，漿細(xì)胞在食管癌中呈低表達(dá)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.038)；食管癌組織中，與正常組織相比單核細(xì)胞在食管癌中低表達(dá)(P=0.024)；M0巨噬細(xì)胞在食管癌中高表達(dá)(P=0.032)；與正常組織相比，食管癌中靜息肥大細(xì)胞呈低表達(dá)(P=0.016)，上述結(jié)果均運(yùn)用R語(yǔ)言繪制出小提琴圖(見(jiàn)圖3)。

圖2 免疫細(xì)胞在食管癌中表達(dá)的熱圖

圖3 22種免疫細(xì)胞在食管癌與正常組織中表達(dá)差異

2.4 免疫細(xì)胞與食管癌臨床資料對(duì)比 得到免疫細(xì)胞在食管癌中的表達(dá)之后，運(yùn)用R語(yǔ)言分析22種免疫細(xì)胞與食管癌臨床資料的關(guān)系，結(jié)果得到：食管癌中靜息NK細(xì)胞在食管癌中與臨床分期有關(guān)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.027)；單核細(xì)胞與食管癌臨床分期有關(guān)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.045)；在免疫細(xì)胞與食管癌臨床T分級(jí)的研究中，發(fā)現(xiàn)M2巨噬細(xì)胞與食管癌T分級(jí)有關(guān)(P=0.021)，其余免疫細(xì)胞與食管癌臨床數(shù)據(jù)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。以上相關(guān)結(jié)果數(shù)據(jù)運(yùn)用R語(yǔ)言繪制箱型圖(見(jiàn)圖4)。

2.5 22種免疫細(xì)胞與食管癌預(yù)后的關(guān)系 運(yùn)用R語(yǔ)言中的survival生存分析包，分析22種免疫細(xì)胞與食管癌預(yù)后的關(guān)系。結(jié)果發(fā)現(xiàn)22種免疫細(xì)胞中，激活肥大細(xì)胞與食管癌的預(yù)后有關(guān)(P=0.017)，其余免疫細(xì)胞與食管癌預(yù)后無(wú)關(guān)系(P>0.05)(見(jiàn)圖5)。

圖4 免疫細(xì)胞與食管癌臨床資料的關(guān)系

圖5 激活肥大細(xì)胞與食管癌預(yù)后的關(guān)系

3 討論

TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)是目前用于生物信息學(xué)分析數(shù)據(jù)來(lái)源最大的數(shù)據(jù)庫(kù)之一，TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中不僅包含大量的腫瘤相關(guān)的芯片數(shù)據(jù)，同時(shí)還包含有患者的臨床相關(guān)信息、生存時(shí)間及生存狀態(tài)等。目前每年都有大量基于TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)數(shù)據(jù)的研究發(fā)表，研究涉及基因、蛋白、miRNA、lncRNA等，給臨床工作者的研究開(kāi)拓了新的領(lǐng)域[15]。

本研究基于TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中的基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)，結(jié)合CIBERSORT計(jì)算方法利用R語(yǔ)言及Perl軟件描述了免疫細(xì)胞在食管癌中的表達(dá)情況及與食管癌患者預(yù)后的關(guān)系。本研究結(jié)果展示了22種免疫細(xì)胞在食管癌中的分布情況，同時(shí)發(fā)現(xiàn)了與正常組織相比，漿細(xì)胞、單核細(xì)胞、靜息肥大細(xì)胞在食管癌中呈低表達(dá)，而M0巨噬細(xì)胞在食管癌中高表達(dá)。目前已有多個(gè)研究證實(shí)，免疫細(xì)胞在癌癥組織中表達(dá)具有差異性。例如：2019年Luo MS等[16]在鼻咽癌研究中發(fā)現(xiàn)M1巨噬細(xì)胞在鼻咽癌中高表達(dá)，而記憶B細(xì)胞及CD4+靜息記憶T細(xì)胞在鼻咽癌中低表達(dá)。2019年Meng J等[14]研究發(fā)現(xiàn)，CD4+激活記憶T細(xì)胞及M0巨噬細(xì)胞在前列腺癌組織中比例較高，而中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞在前列腺癌組織中表達(dá)較低，該研究結(jié)果中M0巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞與本研究結(jié)果類似。有研究通過(guò)同時(shí)分析TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)及GEO數(shù)據(jù)庫(kù)關(guān)于結(jié)直腸癌的數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，M0巨噬細(xì)胞、M1巨噬細(xì)胞和CD4+激活記憶T細(xì)胞在結(jié)直腸癌中的表達(dá)量高于正常組織[12]。最近研究肝癌與正常肝臟組織的研究中發(fā)現(xiàn)，活化肥大細(xì)胞、單核細(xì)胞、漿細(xì)胞在肝癌組織中表達(dá)減少，而靜息肥大細(xì)胞、靜息CD4+記憶細(xì)胞、幼稚B細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞在肝癌組織中高表達(dá)，該研究結(jié)果中的單核細(xì)胞與漿細(xì)胞結(jié)果與本研究結(jié)果相似[9]。在免疫細(xì)胞與食管癌臨床數(shù)據(jù)的分析中，本研究發(fā)現(xiàn)了靜息NK細(xì)胞、單核細(xì)胞與食管癌的臨床分期有關(guān)，并且靜息NK細(xì)胞在低分期的表達(dá)相對(duì)較高，而單核細(xì)胞在高分期的表達(dá)較高，M2巨噬細(xì)胞與食管癌的T分級(jí)有關(guān)，M2巨噬細(xì)胞在T3&4分級(jí)的食管癌中分布較高。目前已有研究證實(shí)，免疫細(xì)胞與腫瘤臨床資料有關(guān)，例如：2019年Meng J等[14]研究發(fā)現(xiàn)，漿細(xì)胞、靜息肥大細(xì)胞與前列腺癌患者分期有關(guān)。2019年Ge P等[12]研究發(fā)現(xiàn)，在結(jié)直腸癌中， CD4+激活記憶T細(xì)胞與癌癥的分期有關(guān)，M0巨噬細(xì)胞與結(jié)直腸癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。在肝癌研究中發(fā)現(xiàn)，M1巨噬細(xì)胞與肝癌的臨床分期有關(guān)，并且與肝癌的預(yù)后有關(guān)[9]。這些結(jié)果證實(shí)了免疫細(xì)胞浸潤(rùn)在癌癥的發(fā)生及進(jìn)展有可能扮演著重要的角色。而在免疫細(xì)胞與食管癌生存關(guān)系分析中，本研究結(jié)果揭示了激活肥大細(xì)胞與食管癌預(yù)后相關(guān)，高分布激活肥大細(xì)胞預(yù)后相對(duì)較差。目前多個(gè)研究也已證實(shí)，免疫細(xì)胞與癌癥患者的預(yù)后有關(guān)。例如：2019年，Wang J等[17]研究發(fā)現(xiàn)，CD4+激活記憶T細(xì)胞與激活肥大細(xì)胞是宮頸癌的獨(dú)立預(yù)后因子，高表達(dá)CD4+激活記憶T細(xì)胞患者生存時(shí)間較長(zhǎng)，而高表達(dá)激活肥大細(xì)胞的宮頸癌患者預(yù)后較差，激活肥大細(xì)胞結(jié)果與本研究結(jié)果相似。在前列腺癌患者的研究中，M2巨噬細(xì)胞的表達(dá)與前列腺癌患者的預(yù)后有關(guān)[14]。而在另一項(xiàng)關(guān)于免疫細(xì)胞在前列腺癌患者生存分析中發(fā)現(xiàn)，高比例的M2巨噬細(xì)胞患者的生存率明顯低于低表達(dá)患者，并且M2巨噬細(xì)胞被認(rèn)為是前列腺癌患者的獨(dú)立預(yù)后因子[18]。2019年Chen F等[19]研究發(fā)現(xiàn)，通過(guò)運(yùn)用CIBERSORT運(yùn)算最終得出免疫細(xì)胞中的漿細(xì)胞及調(diào)節(jié)T細(xì)胞與非小細(xì)胞肺癌患者的預(yù)后有關(guān)。

綜上所述，本研究展示了免疫細(xì)胞與食管癌之間的關(guān)系，并發(fā)現(xiàn)浸潤(rùn)性免疫細(xì)胞與食管癌臨床資料及預(yù)后的關(guān)系。本研究結(jié)果將有助于推動(dòng)免疫細(xì)胞在食管癌中的研究進(jìn)展。