劉淦，李曉敏，王健君

(1. 皖南醫(yī)學(xué)院檢驗(yàn)學(xué)院，安徽 蕪湖 241002；2.南方醫(yī)科大學(xué)病理學(xué)系，廣東 廣州 510515；3.皖南醫(yī)學(xué)院病理學(xué)教研室，安徽 蕪湖 241002；4.皖南醫(yī)學(xué)院組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室，安徽 蕪湖 241002)

結(jié)直腸癌發(fā)病率逐年上升，目前我國(guó)結(jié)直腸癌發(fā)病率在男性位于第三位，女性位于第二位，死亡率位于所有腫瘤的第四位[1-2]。傳統(tǒng)治療方案為手術(shù)切除腫瘤并結(jié)合放化療，但化療藥物均存在毒副作用及耐藥性影響療效，而近些年新出現(xiàn)的腫瘤靶向藥治療及免疫治療又存在受益人群較少的缺憾，很多結(jié)直腸癌患者由于伴有K-Ras突變并不能應(yīng)用抗EGFR靶向藥治療[3]。因此進(jìn)一步闡明結(jié)直腸癌發(fā)生及轉(zhuǎn)移的機(jī)制，探尋有效的靶向藥物作用靶點(diǎn)，對(duì)于改善結(jié)直腸癌患者的治療現(xiàn)狀至關(guān)重要。卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域蛋白66(coiled-coil domain containing protein 66，CCDC66)是中心粒衛(wèi)星蛋白[4]，其基因突變可引起狗的視網(wǎng)膜萎縮[5]，但是測(cè)序分析發(fā)現(xiàn)CCDC66與人的視網(wǎng)膜營(yíng)養(yǎng)不良性萎縮并無(wú)相關(guān)性[6]。有文獻(xiàn)報(bào)道CCDC66缺氧時(shí)在結(jié)直腸癌細(xì)胞中表達(dá)降低[7]，而惡性腫瘤組織由于生長(zhǎng)旺盛及腫瘤性血管結(jié)構(gòu)異常[8]，均存在不同程度的缺氧，缺氧導(dǎo)致下調(diào)表達(dá)的CCDC66在結(jié)直腸癌中的表達(dá)及與血管生成是否有關(guān)，尚未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。我們通過(guò)qRT-PCR、免疫組織化學(xué)染色等技術(shù)檢測(cè)CCDC66在結(jié)直腸癌中的表達(dá)，分析其表達(dá)與臨床病理參數(shù)的相關(guān)性，并初步探討CCDC66表達(dá)與結(jié)直腸癌微血管密度的關(guān)系，可能為結(jié)直腸癌抗腫瘤血管生成治療提供新的靶點(diǎn)。

1 材料和方法

1.1 標(biāo)本及組織芯片制備方法 24例結(jié)直腸癌新鮮組織取自南方醫(yī)科大學(xué)附屬南方醫(yī)院普外科手術(shù)切除的結(jié)直腸癌患者，腫瘤組織及癌旁組織各取黃豆般大小樣本，置于液氮中儲(chǔ)存直至提取總RNA。并收集2018年6月—2018年12月皖南醫(yī)學(xué)院附屬弋磯山醫(yī)院普外科收治的結(jié)直腸癌腸癌手術(shù)切除標(biāo)本(結(jié)直腸癌組織及癌旁組織)46對(duì)，經(jīng)常規(guī)石蠟包埋制備石蠟標(biāo)本。并對(duì)石蠟標(biāo)本進(jìn)行HE染色，標(biāo)記待取的典型腫瘤部位，應(yīng)用組織芯片儀(北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司)分別穿取每對(duì)供體蠟塊放入受體蠟塊孔中制備2個(gè)6×8陣列組織芯片(其中每個(gè)陣列空2孔用于標(biāo)記)。上述標(biāo)本來(lái)源于術(shù)前均未接受放化療患者，術(shù)后病理均證實(shí)為結(jié)直腸腺癌，均已收集完整的臨床病理資料。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 人結(jié)直腸癌細(xì)胞株SW480、SW620、HT29、RKO、Caco-2、LoVo及正常結(jié)腸黏膜上皮細(xì)胞株FHC均購(gòu)自美國(guó)模式培養(yǎng)物集存庫(kù)(American Type Culture Collection，ATCC)公司。腫瘤細(xì)胞用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，F(xiàn)HC用含20%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，置于37℃、5%CO2孵箱內(nèi)，當(dāng)細(xì)胞融合度為70%～80%時(shí)，取生長(zhǎng)狀態(tài)好的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.3 組織、細(xì)胞RNA提取及逆轉(zhuǎn)錄 結(jié)直腸癌及癌旁組織總RNA提取由廣州維柏鑫生物技術(shù)有限公司完成，細(xì)胞總RNA提取應(yīng)用RNAisoTMPlus(Takara公司)裂解細(xì)胞后，應(yīng)用苯酚氯仿抽提法提取。RNA逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)根據(jù)PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser(TaKaRa公司)說(shuō)明書進(jìn)行，cDNA用無(wú)菌超純水稀釋5～10倍，用于qRT-PCR反應(yīng)。

1.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(quantitative real-time PCR，qRT-PCR) 使用SybrGreen qPCR Mastermix(DBI公司)說(shuō)明書進(jìn)行qRT-PCR，避光條件下在冰上配置qRT-PCR反應(yīng)體系，應(yīng)用ABI7500熒光定量PCR儀檢測(cè)各樣品的Ct值，即反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)達(dá)到所設(shè)定的閾值時(shí)總共經(jīng)歷的循環(huán)次數(shù)，qRT-PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5°C，預(yù)變性1 min；95°C，變性15 s；60°C，退火及延伸34 s；40個(gè)循環(huán)；用2-△△Ct方法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析[9]，計(jì)算每個(gè)樣本的平均ΔCt(ΔCt = CtCCDC66-CtGAPDH)，分析細(xì)胞株CCDC66相對(duì)表達(dá)量時(shí)，以FHC細(xì)胞△Ct作為對(duì)照，計(jì)算△△Ct=△CtCCDC66-△CtGAPDH，以公式2-△△Ct計(jì)算腫瘤細(xì)胞株相對(duì)表達(dá)量；所用引物CCDC66：上游5′->3′GATGGGCAATGCACTTTGATTC，下游5′->3′CAGGTTGTTTGTGTGTTGACTG；GAPDH：上游5′->3′ GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT，下游5′->3′ GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG；引物由北京睿博興科生物技術(shù)有限公司合成。

1.5 免疫組織化學(xué)染色及結(jié)果判讀 參照增強(qiáng)型二步法檢測(cè)試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)說(shuō)明書進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色。Anti-CCDC66及Anti-CD31抗體均購(gòu)自武漢華美生物工程有限公司，1∶100稀釋，PBS緩沖液、枸櫞酸鹽緩沖液購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司，DAB顯色液均購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。CCDC66染色結(jié)果由三位病理醫(yī)生獨(dú)立判讀，根據(jù)染色強(qiáng)度分為陰性、弱陽(yáng)性(淡黃色)、強(qiáng)陽(yáng)性(棕黃色)，其中染色強(qiáng)度為陰性或弱陽(yáng)性，且染色比例<50%判定為低表達(dá)，其余為高表達(dá)。微血管密度計(jì)數(shù)(microvessel density，MVD)參照Weidner方法[10]，即低倍鏡(100倍)下掃視整個(gè)切片，選擇切片中間質(zhì)微血管密度最為豐富的區(qū)域，在高倍鏡下隨機(jī)觀察3個(gè)視野計(jì)數(shù)微血管數(shù)目，取平均值作為微血管密度。

2 結(jié)果

2.1 CCDC66在結(jié)直腸癌組織及細(xì)胞株中表達(dá)下調(diào) 應(yīng)用qRT-PCR檢測(cè)24例結(jié)直腸癌組織、癌旁組織及6株結(jié)直腸癌細(xì)胞CCDC66 mRNA的表達(dá)，結(jié)果顯示CCDC66 mRNA在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)低于癌旁組織(t=3.294，P<0.01)(見(jiàn)圖1A)，CCDC66 mRNA在6株結(jié)直腸癌細(xì)胞SW480(t=4.271，P=0.0129)、HT29(t=14.616，P<0.0001)、RKO(t=16.410，P<0.0001)、SW620(t=16.11，P<0.0001)、Caco-2(t=18.526，P<0.0001)、LoVo(t=21.080，P<0.0001)中的表達(dá)均低于正常結(jié)腸黏膜上皮來(lái)源的細(xì)胞株FHC，并且在低轉(zhuǎn)移潛能細(xì)胞株SW480中的表達(dá)高于高轉(zhuǎn)移潛能細(xì)胞株SW620(t=6.576，P=0.0028)(見(jiàn)圖1B)。應(yīng)用免疫組織化學(xué)染色方法檢測(cè)CCDC66在結(jié)直腸癌組織芯片中的表達(dá)，結(jié)果顯示CCDC66陽(yáng)性染色主要位于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，呈淡黃色或棕黃色彌漫或顆粒狀。CCDC66在結(jié)直腸癌癌旁黏膜上皮呈強(qiáng)陽(yáng)性染色，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)呈現(xiàn)明顯的棕黃色顆粒，而大部分結(jié)直腸癌組織呈陰性或弱陽(yáng)性染色，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)局限性淡黃色(見(jiàn)圖2)。在46例結(jié)直腸癌組織中，有18例(39.13%)高表達(dá)CCDC66，28例(60.87%)低表達(dá)CCDC66，而配對(duì)癌旁組織中有34例(73.91%)高表達(dá)CCDC66，12例(26.09%)低表達(dá)CCDC66，CCDC66在結(jié)直腸癌及癌旁組織中的表達(dá)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)，見(jiàn)表1。

A

B

圖1 CCDC66 mRNA在結(jié)直腸癌組織、癌旁組織和結(jié)直腸癌細(xì)胞株中、正常結(jié)腸黏膜細(xì)胞的表達(dá)下調(diào)

注：A：CCDC66 mRNA在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)低于癌旁組織(n=24)；B：CCDC66 mRNA在結(jié)直腸癌細(xì)胞株中的表達(dá)低于正常結(jié)腸黏膜上皮細(xì)胞株FHC；*：P<0.05； **：P<0.01； ***：P<0.001； ****：P<0.0001。

圖2 結(jié)直腸癌及癌旁組織CCDC66免疫組織化學(xué)染色

注：A、B和C：高表達(dá)CCDC66的癌旁組織；D、E和F：低表達(dá)CCDC66的結(jié)直腸癌組織；標(biāo)尺：(A 和D)100μm，(B 和 E)50μm，(C和F)20μm。

表1 CCDC66在結(jié)直腸癌及癌旁組織中的表達(dá)差異

注：表內(nèi)計(jì)數(shù)資料數(shù)據(jù)用[n(%)]表示。

2.2 CCDC66在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)水平與患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系 在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNMⅠ～Ⅱ期及Ⅲ～Ⅳ期的結(jié)直腸癌組織中CCDC66的表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示CCDC66與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期有關(guān)，而CCDC66與患者的年齡、性別及腫瘤的部位、直徑、分化程度、漿膜是否侵犯等無(wú)關(guān)，見(jiàn)表2。

表2 CCDC66在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)與患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系 (n=46)

注：“-”表示采用Fisher的精確檢驗(yàn)結(jié)果(雙側(cè))。

2.3 CCDC66在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)與腫瘤微血管密度的關(guān)系 文獻(xiàn)報(bào)道[7]缺氧會(huì)導(dǎo)致CCDC66在結(jié)直腸癌細(xì)胞中的表達(dá)下調(diào)，而缺氧是促進(jìn)腫瘤血管生成的重要因素，為進(jìn)一步探討CCDC66在結(jié)直腸癌中的表達(dá)是否與腫瘤血管生成相關(guān)，我們應(yīng)用免疫組織化學(xué)染色方法檢測(cè)20例結(jié)直腸癌組織石蠟標(biāo)本CCDC66及CD31的表達(dá)，并計(jì)數(shù)微血管密度，分析CCDC66表達(dá)與腫瘤MVD的關(guān)系，結(jié)果20例結(jié)直腸癌組織中CCDC66高表達(dá)8例，CCDC66低表達(dá)12例，高表達(dá)組MVD計(jì)數(shù)平均為(16.88±1.90)個(gè)/高倍鏡視野，低表達(dá)組MVD計(jì)數(shù)平均為(27.08±1.78)個(gè)/高倍鏡視野，高表達(dá)CCDC66的結(jié)直腸癌組織的MVD計(jì)數(shù)明顯低于低表達(dá)組(t=3.811，P=0.0013)，見(jiàn)圖3。

圖3 結(jié)直腸癌組織CCDC66表達(dá)與腫瘤微血管密度關(guān)系

注：A：高表達(dá)CCDC66的結(jié)直腸癌組織CD31免疫組織化學(xué)染色；B：低表達(dá)CCDC66的結(jié)直腸癌組織CD31免疫組織化學(xué)染色；C：柱狀圖示CCDC66高表達(dá)組和低表達(dá)組MVD計(jì)數(shù)統(tǒng)計(jì)；標(biāo)尺：50μm。

3 討論

研究顯示，CCDC66前轉(zhuǎn)錄本除了通過(guò)傳統(tǒng)剪切生成線性CCDC66 mRNA外，還可以通過(guò)反向剪切生成環(huán)狀RNA，CCDC66來(lái)源的環(huán)狀RNA在結(jié)直腸癌中表達(dá)上調(diào)并且促進(jìn)了結(jié)直腸癌的生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移，而同一前轉(zhuǎn)錄本來(lái)源的CCDC66 mRNA在結(jié)直腸癌中的表達(dá)下調(diào)[7]。在本項(xiàng)研究中，我們發(fā)現(xiàn)CCDC66無(wú)論在mRNA水平還是蛋白水平均在結(jié)直腸癌組織及細(xì)胞株中表達(dá)下調(diào)。根據(jù)CCDC66環(huán)狀RNA和mRNA在結(jié)直腸癌中的表達(dá)情況，我們推測(cè)，相比正常組織，結(jié)直腸癌中CCDC66的剪切方式由傳統(tǒng)剪切向反向剪切轉(zhuǎn)變，生成更多的環(huán)狀RNA而減少線狀mRNA生成，從而導(dǎo)致CCDC66 mRNA及蛋白水平的下調(diào)，這也表明了腫瘤發(fā)生發(fā)展機(jī)制的復(fù)雜性，傳統(tǒng)剪切與線性剪切之間存在競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系，但剪切調(diào)控的機(jī)制尚罕見(jiàn)報(bào)道。

此外，與CCDC66來(lái)源的環(huán)狀RNA能夠增強(qiáng)腫瘤的惡性行為相反，我們通過(guò)統(tǒng)計(jì)分析CCDC66在結(jié)直腸癌芯片中的表達(dá)水平與患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)CCDC66低表達(dá)與患者腫瘤的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，提示CCDC66在結(jié)直腸癌中的表達(dá)下調(diào)可能具有促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移的作用。轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤最具破壞性的行為，是結(jié)直腸癌患者治療失敗和死亡的主要原因，是多因素參與的復(fù)雜過(guò)程，包括早期腫瘤血管形成促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)、腫瘤細(xì)胞從原發(fā)部位脫落侵入基質(zhì)[11]、癌細(xì)胞運(yùn)動(dòng)進(jìn)入脈管系統(tǒng)運(yùn)行、形成癌栓并躲避免疫系統(tǒng)攻擊、穿出血管到繼發(fā)部位、新生血管生成繼續(xù)增殖形成轉(zhuǎn)移灶[12]。其中腫瘤新生血管生成與轉(zhuǎn)移灶形成具有密切的關(guān)系，新生血管不僅能夠提供營(yíng)養(yǎng)供原發(fā)腫瘤生長(zhǎng)，而且為腫瘤轉(zhuǎn)移提供了通道，轉(zhuǎn)移后又為轉(zhuǎn)移瘤生長(zhǎng)提供營(yíng)養(yǎng)，如果沒(méi)有腫瘤新生血管生成，轉(zhuǎn)移就不會(huì)發(fā)生。目前認(rèn)為腫瘤血管生成的本質(zhì)是血管生成調(diào)控的失衡，使血管生成因子合成分泌增多而抑制血管形成的因子合成減少[13]。本研究進(jìn)一步分析CCDC66表達(dá)與腫瘤微血管密度的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)高表達(dá)CCDC66 的結(jié)直腸癌組織的MVD計(jì)數(shù)明顯低于CCDC66低表達(dá)組，提示CCDC66在結(jié)直腸癌中的表達(dá)下調(diào)可能具有促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移的作用，CCDC66表達(dá)下調(diào)可能促進(jìn)了結(jié)直腸癌組織的血管生成。有文獻(xiàn)報(bào)道CCDC66缺氧條件在結(jié)直腸癌細(xì)胞株中的表達(dá)進(jìn)一步下調(diào)[7]，惡性腫瘤由于生長(zhǎng)旺盛，常存在不同程度的缺氧，缺氧的酸中毒環(huán)境會(huì)擾亂血管生成因子和抑制因子的表達(dá)平衡，促進(jìn)腫瘤的侵襲性和轉(zhuǎn)移[14-15]，表明CCDC66可能參與了缺氧對(duì)血管生成的調(diào)控。

綜上，本研究發(fā)現(xiàn)CCDC66在結(jié)直腸癌中表達(dá)下調(diào)，并且與患者腫瘤的轉(zhuǎn)移有關(guān)，低表達(dá)CCDC66的腫瘤組織具有更高的腫瘤微血管密度，可能是一新的血管生成抑制因子，對(duì)其對(duì)血管調(diào)控機(jī)制的進(jìn)一步闡明，有望為血管生成治療提供新的靶點(diǎn)。