宋靜，營秀，吳丹鳳，李瑞華

(蚌埠醫(yī)學(xué)院口腔醫(yī)學(xué)院，安徽 蚌埠 233030)

惡性腫瘤是嚴重危害人類健康的重大疾病之一，口腔癌是頭頸部惡性癌的一種，其中90%是口腔鱗狀細胞癌，其致死率高，并且其治療常伴有功能缺陷和毀容[1]。微小RNA(microRNA，miRNA)近來受到了人們的關(guān)注。microRNAs是一類長18～24 nt的小分子非編碼RNA，它能夠介導(dǎo)基因的表達，調(diào)控轉(zhuǎn)錄水平，進而影響miRNA的翻譯過程。最近研究表明，miRNA對基因表達的調(diào)控在多種細胞過程中發(fā)揮作用[2]。miRNA-181a-5p作為miRNAs家族成員之一，是近年來新發(fā)現(xiàn)的一類具有腫瘤抑制作用的miRNA，可以靶向作用于多個腫瘤相關(guān)基因，參與腫瘤的生長、侵襲、轉(zhuǎn)移等[3]。但是miRNA-181a-5p在口腔鱗狀細胞癌細胞增殖、遷移及侵襲過程中發(fā)揮的作用及相應(yīng)機制尚不清楚。本研究選擇口腔癌細胞CAL27為模型，通過轉(zhuǎn)染 miRNA-181a-5p mimic增加口腔癌細胞miRNA-181a-5p的表達水平，以探討miRNA-181a-5p與口腔癌細胞CAL27增殖、侵襲和遷移生物學(xué)特性的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞株 人口腔黏膜角化細胞(human oral keratinocytes，HOK)和口腔癌細胞CAL27均購自中國科學(xué)院上海細胞生物所。

1.1.2 試劑 轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine2000和miRNA-181a-5p mimic(購自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司)、胎牛血清(購自杭州四季青公司)、RPMI1640培養(yǎng)基(購自Hyclone公司)、CCK-8檢測試劑盒(購自碧云天公司)、結(jié)晶紫染液(購自武漢阿斯本生物技術(shù)公司)、DMSO(購自美國Sigma公司)、Transwell侵襲小室(購自美國Corning公司)、Matrigel(購自BD公司)、Trizol試劑(購自Invitrogen公司)、逆轉(zhuǎn)錄(RT)試劑盒(購自Toyobo公司)、PCR試劑盒(購自Fermentas公司)、Bulge-LoopTM miRNA定量聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)引物試劑盒(購自武漢金開瑞生物工程有限公司)。

1.1.3 儀器 恒溫培養(yǎng)箱(美國熱電公司)；酶標檢測儀(Diatek公司)；凈化工作臺(蘇州泰安空氣技術(shù)公司)；普通光學(xué)顯微鏡(日本Olympus公司)；Mini-Prote 電泳儀(美國伯樂公司)；熒光定量PCR儀(Life technologies公司)；高速冷凍離心機(意大利 ALC公司)；流式儀(BD公司)；Milli-QBiocel超純水儀(美國Millipore公司)。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 人口腔黏膜角化細胞HOK及口腔鱗癌CAL27采用RPMI1640 培養(yǎng)液，含10%胎牛血清、1%青霉素、鏈霉素。細胞在37℃、飽和濕度、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當細胞鋪滿瓶底后，使用2.5 g/L-1的胰蛋白酶消化，傳代培養(yǎng)。按照4℃ 1 h，-20℃ 2 h，-70℃ 4 h的順序降溫后保存。

1.2.2 實時定量PCR檢測細胞中miRNA-181a-5p的miRNA表達水平 嚴格按Trizol試劑盒說明書操作，分別從HOK及CAL27細胞中提取總miRNA。按照組織和細胞miRNA抽提試劑盒說明書提取miRNA，第一鏈cDNA的合成采用M-MLV Reverse Transcriptase試劑盒進行(ELK Biotechnology，EQ002)及按照實時定量PCR試劑盒說明書檢測miRNA-181a-5p。以逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板，在實時熒光定量PCR儀上進行PCR擴增。實時熒光定量PCR是在Life technologies公司的StepOneTMReal-Time PCR儀上完成，每個樣品均作3個復(fù)孔，使用EnTurboTMSYBR Green PCR SuperMix試劑盒進行(ELK Biotechnology，EQ001)。PCR反應(yīng)體系：5 μl 2×Master Mix，2.5 μmol/L 5′及3′引物各1 μl，1 μl逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，加滅菌雙蒸水至20 μl。反應(yīng)程序為：95℃預(yù)變性30 s，95℃ 5 s，58℃ 30 s，72℃ 30 s，共40個循環(huán)。溶解曲線反應(yīng)程序：60℃～95℃，每20 s升溫1℃。采用相對定量方法計算miRNA相對表達量，計算公式為：相對miRNA表達量=2-(ΔCT樣品-ΔCT對照)。miRNA-181a-5p 及其內(nèi)參U6的引物購于武漢金開瑞生物工程有限公司，以此測定miRNA-181a-5p的相對表達水平。

1.2.3 miRNA-181a-5p及其陰性對照序列的構(gòu)建 miRNA-181a-5p：5′-GGGGAACATTCAACGCTGT-3′陰性對照序列：5′-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTC-3′(由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成)，陰性對照序列與人類基因組非同源。

1.2.4 實驗分組 實驗隨機分為3組：空白組、miRNA-181a-5p mimic陰性對照組(NC mimic組)和miRNA-181a-5p mimic轉(zhuǎn)染組。其中空白組未應(yīng)用任何試劑，陰性對照組和 miRNA-181a-5p 轉(zhuǎn)染組分別應(yīng)用miRNA-181a-5pNC陰性對照序列和miRNA-181a-5p mimic序列進行轉(zhuǎn)染。

1.2.5 microRNA瞬時轉(zhuǎn)染 在轉(zhuǎn)染前1 d，用0.25%胰酶消化CAL27細胞，調(diào)整細胞密度為1×104個/毫升，接種于48孔細胞培養(yǎng)板中，待細胞融合度為 30% ～50% 時進行轉(zhuǎn)染，具體步驟參考脂質(zhì)體Lipofectamine TM 2000 說明書：首先分別將轉(zhuǎn)染物、脂質(zhì)體Lipofectamine2000與RPMI1640培養(yǎng)基按照1∶50的比例混勻，靜置5 min，隨后將兩種混合液體混勻，靜置20 min 即獲得轉(zhuǎn)染復(fù)合物，隨后將混勻物轉(zhuǎn)移至特殊培養(yǎng)皿中(無抗生素、無血清) 培養(yǎng)6 h后更換新鮮含10%胎牛血清的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)(無抗生素) 48 h，獲得的細胞備用。

1.2.6 CCK-8法檢測miRNA-181a-5p對細胞增殖能力的影響 將miRNA-181a-5p mimic以及miRNA-181a-5pNC陰性對照轉(zhuǎn)入CAL27細胞后，重新將各組細胞消化為單細胞懸液。收集對數(shù)生長期的口腔癌細胞CAL27，用無血清的RPMI-1640培養(yǎng)液重懸，調(diào)整細胞密度1×105個/毫升，在96孔板中接種細胞懸液100微升/孔，每組設(shè)定5個復(fù)孔，放置在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱孵育，待細胞貼壁后按轉(zhuǎn)染試劑盒說明書以最適濃度轉(zhuǎn)染，并在轉(zhuǎn)染24 h、48 h、72 h、96 h、120 h時分別取各時段的細胞，加入10 μl CCK-8 溶液，37℃、含5%CO2的培養(yǎng)箱孵育1 h。使用酶標儀檢測波長為450 nm時各孔的吸光度(OD)值，并繪制細胞增殖曲線。實驗重復(fù)進行3次。

1.2.7 miRNA-181a-5p轉(zhuǎn)染的口腔癌細胞CAL27遷移實驗 取對數(shù)生長期CAL27口腔癌細胞，使用2.5 g/L胰消化酶消化后使用無血清RPMI1640培養(yǎng)液，100 μl細胞懸液加入Transwell上室，調(diào)整細胞密度為1～2×105個/毫升的細胞懸液，后將Transwell小室放置于37℃、含5%CO2的培養(yǎng)箱里培養(yǎng)10 h，進行固定細胞及染色。Transwell小室放于含500 μl PBS的24孔板中，用移液器移除Transwell小室下層腔室，輕輕吸棄Transwell上室內(nèi)的液體，Transwell小室放于600 μl細胞固定液中，濕棉簽輕輕擦除Transwell濾膜上層中未遷移的殘留口腔癌細胞，PBS液洗滌濾膜3次，甲醇固定30 min后行0.1%結(jié)晶紫染色20 min，PBS沖洗。熒光顯微鏡下觀察并拍照，計數(shù)穿過微孔移到濾膜下層的小室下表面附著的遷移細胞總數(shù)，選取中央及四周5個視野計數(shù)并取其平均值。

1.2.8 miRNA-181a-5p轉(zhuǎn)染的口腔癌細胞CAL27侵襲實驗 將Transwell小室的底部上表面鋪適量厚度的8 mg/ml的基質(zhì)膠，40℃進行風(fēng)干。以1～2×106個/毫升細胞接種于24孔板，培養(yǎng)至匯合度75%時，更換無血清RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)過夜。調(diào)整細胞至1～2×105個/毫升，取100 μl加入上室內(nèi)，600 μl含血清的RPMI1640培養(yǎng)基加入下室，放置于37℃、50 ml/L CO2的培養(yǎng)箱里培養(yǎng)24 h，進行固定細胞及染色。Transwell小室放于含500 μl PBS的24孔板中，用移液器移除Transwell小室下層腔室，輕輕吸棄Transwell上室內(nèi)的液體，Transwell小室放于600 μl細胞固定液中，濕棉簽輕輕擦除Transwell濾膜上層中未侵襲的殘留口腔癌細胞，PBS液洗滌濾膜3次，甲醇固定30 min后行0.1%結(jié)晶紫染色20 min，PBS沖洗。熒光顯微鏡下觀察并拍照，計數(shù)小室下表面附著的侵襲細胞數(shù)，選取中央及四周5個視野計數(shù)并取其平均值。

2 結(jié)果

2.1 miRNA-181a-5p在HOK及CAL27細胞的表達 miRNA-181a-5p在人口腔癌細胞CAL27中表達量顯著低于人正?？谇火つそ腔毎鸋OK(P<0.05)，見圖1。提示 miRNA-181a-5p在人口腔癌細胞CAL27中呈低表達。

圖1 miRNA-181a-5p在HOK和CAL27中的表達水平

2.2 轉(zhuǎn)染miRNA-181a-5p對口腔癌細胞CAL27增殖生物學(xué)特性的影響 CCK-8法測定細胞的生長曲線，結(jié)果顯示miRNA-181a-5p轉(zhuǎn)染組明顯抑制了細胞的增殖，與空白組、陰性對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，空白組、陰性對照組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見圖2。

圖2 轉(zhuǎn)染miRNA-181a-5p對口腔癌細胞 CAL27增殖特性的影響

2.3 轉(zhuǎn)染miRNA-181a-5p對口腔癌細胞CAL27遷移生物學(xué)特性的影響 體外遷移實驗結(jié)果顯示，與空白組、陰性對照組相比，轉(zhuǎn)染miRNA-181a-5p mimic后，CAL27細胞的遷移能力顯著降低(P<0. 05)，而空白組與陰性對照組的差異無統(tǒng)計學(xué)意義，見圖3。

2.4 轉(zhuǎn)染miRNA-181a-5p對口腔癌細胞CAL27侵襲生物學(xué)特性的影響 侵襲基底膜實驗結(jié)果顯示：miRNA-181a-5p轉(zhuǎn)染能夠降低CAL27細胞的侵襲能力，結(jié)果見圖4。與空白組、陰性對照組相比，miRNA-181a-5p轉(zhuǎn)染組CAL27細胞的侵襲能力顯著降低(P<0.05)。

3 討論

微小 RNA(microRNA，miRNA)是當前研究的熱點之一，有報道揭示[2]，miRNA通過作為抑癌基因或致癌基因的功能，促進了人類癌癥的發(fā)生發(fā)展。miRNA廣泛參與了口腔癌的調(diào)控中，但是具體機制尚不明確，需進一步探討，為臨床診療提供新方向。例如，miRNA-34a在衰老過程中大量增加，在人類癌癥中經(jīng)常下調(diào)。此外，miRNA-34a的異位過表達抑制了腫瘤的生長[4]。這一信息促使我們研究miRNA-181a-5p在口腔鱗狀細胞癌發(fā)育中的表達和作用，因為miRNA-181a-5p在口腔鱗狀細胞的衰老過程中被發(fā)現(xiàn)顯著升高。

A

圖3 轉(zhuǎn)染miRNA-181a-5p對口腔癌細胞 CAL27遷移特性的影響

注：A為Transwell濾膜下層細胞；A1為空白組；A2為陰性組；A3為轉(zhuǎn)染組。

B

圖4 轉(zhuǎn)染miRNA-181a-5p對口腔癌細胞 CAL27侵襲特性的影響

注：B為Transwell濾膜下層細胞結(jié)晶紫染色；B1為空白組；B2為陰性組；B3為轉(zhuǎn)染組。

人類miRNA-181家族主要有6個前體序列：hsa-miRNA-181a-1、hsa-miRNA-181a-2、hsa-miRNA-181b-1、hsa-miRNA-181b-2、hsa-miRNA-181c 和hsa-miRNA-181d，分別表達8種成熟序列：hsa-miRNA-181a-5p、hsa-mi RNA-181a-3p、hsa-miRNA-181a-2-3p、hsa-miRNA-181b-5p、hsa-miRNA-181b-3p、hsa-miRNA-181c-5p、hsa-miRNA-181c-3p 和hsa-miRNA-181d-5p。hsa-mi RNA-181a-5p 是miRNA-181a的成熟體形式之一，研究發(fā)現(xiàn)其可參與卵巢癌的發(fā)生等多種生物學(xué)過程[5]。miRNA-181a在癌癥方面研究廣泛，有研究發(fā)現(xiàn)miRNA-181a 在胃癌[6]、乳腺癌[7]、唾腺樣囊性癌[8]、食管癌[9]、肝癌[10]、腸癌[11]、卵巢癌[12]、乳腺癌[13]及結(jié)腸直腸癌[14]等腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要的調(diào)控功能。miRNA-181a在基因組中表現(xiàn)進化保守性，參與細胞的分化調(diào)控，它能夠減少多種細胞增殖并誘導(dǎo)細胞凋亡，且在不同組織細胞中具有差異性的表達[15]。miRNA-181家族可作為抑癌因子參與調(diào)控細胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移過程，在胃癌發(fā)生發(fā)展的過程中，Hashimoto Y等[16]上調(diào)miRNA-181c 和miRNA-340 表達后，胃癌細胞增殖明顯降低，提示miRNA-181c能夠通過抑制腫瘤細胞增殖從而在胃癌發(fā)生發(fā)展的過程中發(fā)揮抑癌基因的作用。Cui M等[17]研究表明，miRNA-181c在胃癌及血液標本中過表達后能顯著抑制胃癌細胞增殖，且miRNA-181c的表達與組織分級、臨床分期和不良預(yù)后的關(guān)系緊密。miRNA-181家族參與多種腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移過程。有研究報道[18]miRNA-181家族都能夠在惡性膠質(zhì)瘤遷移侵襲的過程中扮演抑癌基因的角色。Parikh A等[12]報道揭示與早期卵巢癌比較，晚期卵巢癌miRNA-181a表達明顯異常，但是miRNA-181a的表達與卵巢癌患者短時間復(fù)發(fā)及不良預(yù)后關(guān)系緊密，過表達miRNA-181a后提高卵巢癌細胞增殖、遷移、侵襲及誘導(dǎo)化療藥物出現(xiàn)耐藥性，促進腫瘤向遠處傳播擴散，低表達miRNA-181a 后則出現(xiàn)相反的情況，表明miRNA-181a在卵巢癌遷移侵襲的過程中發(fā)揮促癌基因的作用。Wang Y等[19]研究表明在乳腺癌組織中，過表達miRNA-181家族進而下調(diào)其靶點 ATM 的表達，從而提高乳腺癌腫瘤干細胞的活性，提高其遷移侵襲的能力。

在日益老化的口腔角化上皮細胞中，miRNA-181a是過表達的 miRNAs 之一，細胞老化過程與腫瘤發(fā)生發(fā)展的過程完全不同，腫瘤抑制通路介導(dǎo)了此過程，從而推斷miRNA-181a可能與口腔鱗狀細胞癌的發(fā)生發(fā)展關(guān)系緊密。Shin等[20]在正常口腔黏膜角化上皮細胞和眾多口腔癌細胞中檢測了miRNA-181a表達水平，結(jié)果證明與正常口腔黏膜角化上皮細胞中表達量相比較，miRNA-181a在所有口腔鱗狀細胞癌細胞中的表達量呈低表達；而將轉(zhuǎn)染有能上調(diào)miRNA-181a mimic的腫瘤細胞與空白組細胞相比較，揭示前者細胞的增殖、遷移及侵襲能力都受到顯著抑制，證實miRNA-181a能夠抑制腫瘤的惡性行為，并有可能成為癌癥治愈的一種新靶標。

miRNA-181a-5p是miRNA-181a家族中重要的一類成員，與腫瘤關(guān)系頗為密切，其表達異常可引起細胞功能障礙。目前關(guān)于miRNA-181a-5p在口腔鱗狀細胞癌中的表達情況及在口腔鱗狀細胞癌中的功能研究比較少見。為了明確miRNA-181a-5p對口腔鱗狀細胞癌增殖、遷移及侵襲等生物學(xué)特性的作用，本研究運用脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染方法將 miRNA-181a-5p mimic轉(zhuǎn)染入口腔癌細胞CAL27，通過CCK-8法檢測轉(zhuǎn)染miRNA-181a-5p mimic后對口腔癌細胞CAL27的增殖生物學(xué)特性的改變，通過Transwell 法檢測細胞遷移、Transwell 法檢測細胞侵襲。結(jié)果表明，與空白組相比，轉(zhuǎn)染組其增殖、遷移及侵襲生物學(xué)特性明顯下降，miRNA-181a-5p的高表達可明顯抑制口腔癌細胞CAL27增殖、遷移及侵襲，證實miRNA-181a-5p在口腔癌細胞CAL27增殖遷移侵襲過程中發(fā)揮負性調(diào)控作用，但對于其具體機制還不明確，本課題將在后續(xù)的實驗中進行更深層次的探討。

綜上所述，本研究證實miRNA-181a-5p的表達參與口腔鱗狀細胞癌的發(fā)生發(fā)展過程，miRNA-181a-5p的高表達可對口腔癌細胞CAL27發(fā)揮負性調(diào)控作用。高表達 miRNA-181a-5p可抑制CAL27的細胞增殖、遷移及侵襲能力。本研究表明 miRNA-181a-5p在口腔癌中發(fā)揮抑癌作用，其可能會成為口腔癌治療的新靶點。隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，將有助于我們探索miRNA與口腔腫瘤的作用機制，這也成為口腔癌臨床治療中提供新的方向及挑戰(zhàn)。