李金林 萬 亮 陳春艷 胡祥飛 李 鑫 黃 麗 涂宗財，*

（1 國家大宗淡水魚加工技術(shù)研發(fā)中心和江西省淡水魚高值化利用工程技術(shù)研究中心江西師范大學 南昌330022 2 南昌市食品藥品檢驗所 南昌市食品安全檢測與控制重點實驗室 南昌330012 3 南昌大學食品科學技術(shù)國家重點實驗室 南昌330047）

眾所周知，生鮮魚肉沒有香味，僅有淡淡的魚腥味或土腥味，常常通過熱加工的方式（如油煎、烘烤、烹飪等）來改善魚肉風味[1-2]。 經(jīng)熱加工的魚肉往往具有濃郁的香味[3-4]，其原因是熱加工過程中發(fā)生了一系列反應(yīng)， 魚肉中的非揮發(fā)性成分轉(zhuǎn)化為具有風味的成分， 其中多不飽和脂肪酸（PUFAs）氧化是魚肉形成風味物質(zhì)非常重要的反應(yīng)之一[5]。研究表明，魚肉不僅蛋白質(zhì)含量高，而且含有豐富的PUFAs，尤其是ω-3 長鏈多不飽和脂肪酸（ω-3 LCPUFAs）如EPA、DHA 等，由于PUFAs 具有高不飽和度，因此極易氧化[6]。 PUFAs 的氧化形成了風味良好的物質(zhì)，改善了魚肉風味[7-9]。作者前期研究也表明， 油煎過程中長鏈多不飽和脂肪酸含量下降，大量風味物質(zhì)形成[10]。 另外，PUFAs 的氧化破壞了魚肉的營養(yǎng)， 影響了脂溶性維生素吸收，甚至產(chǎn)生不良風味，也影響了食品的貨架期和安全性[6，11]。開展魚肉熱加工過程中ω-3 LCPUFAs的氧化研究具有非常重要的意義。

脂肪氧化主要有3 個途徑，分別是酶促氧化、光促氧化和自動氧化[12-13]。 在熱加工過程中，魚肉組織中脂肪同時受熱和脂肪氧化酶的作用， 由于其反應(yīng)機理各不相同， 所形成的產(chǎn)物及其對風味的影響也不盡相同， 目前暫無對兩種作用方式下脂肪氧化對比研究的報道。 為探討熱加工過程中魚肉脂肪氧化形成風味物質(zhì)的過程， 本文采用固相微萃?。⊿PME）與氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（GC-MS）技術(shù)， 以魚肉典型脂肪酸即ω-3 LCPUFAs 為代表，模擬魚肉熱加工過程中脂肪酸發(fā)生的反應(yīng)（酶促氧化及熱促氧化）， 通過對反應(yīng)產(chǎn)物對比分析，研究魚肉脂肪氧化形成風味物質(zhì)的原理。 本研究結(jié)果為制備風味良好、 食用安全的魚制品提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

標準品（二十碳五烯酸甲酯、二十二碳五烯酸甲酯、二十二碳六烯酸甲酯），上海安譜實驗科技股份有限公司；香精標品，Sigma-Aldrich （上海，中國）；硫酸銨、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀（分析純），天津市永大化學試劑有限公司；吐溫80，氫氧化鉀（分析純），德州市富凱化工有限責任公司。

1.2 儀器與設(shè)備

SPME 裝置及萃取頭， 美國Supelco 公司；7890A/5975 氣質(zhì)聯(lián)用儀，美國Agilent；恒溫磁力攪拌器，金壇市城東新瑞儀器廠；冷凍干燥機，北京亞泰科隆儀器技術(shù)有限公司；IKA 均質(zhì)機，德國IKA/艾卡；低溫高速離心機，湖南凱達科學儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 脂肪氧化酶的制備 參照Hsieh 等[14]的方法，略作調(diào)整。取草魚肉粉碎，加入40 倍體積磷酸鹽緩沖溶液（濃度為0.05 mol/L，pH 為7.4），在4℃水浴中9 600 r/min 轉(zhuǎn)速下均質(zhì)2 min，隨后在4℃及1 200 r/min 速率下離心15 min， 最后采用硫酸銨沉淀純化，冷凍干燥得到粗脂肪氧化酶粉末，置于-20 ℃下備用。

1.3.2 脂肪氧化試驗 酶促氧化[15]：取脂肪酸甲酯標品15 μL， 加入到15 mL 樣品瓶中， 加入5 mL 濃度0.05 mol/L，pH 7.4 的磷酸鹽緩沖溶液，再加入10 mg 粗脂肪氧化酶及10 μL 吐溫80， 混勻器下混合15 s 后置于30 ℃水浴中酶解30 min，酶解時采用磁力攪拌器攪拌。

熱促氧化：取脂肪酸甲酯標品15 μL，加入到15 mL 樣品瓶中，加入5 mL 濃度0.05 mol/L，pH 7.4 的磷酸鹽緩沖溶液后置于沸水浴中加熱30 min。

1.3.3 風味成分萃取 采用固相微萃取裝置進行風味成分的萃取，樣品經(jīng)處理后，將萃取針插入樣品瓶并將萃取頭推出進行風味成分的萃取，30 ℃恒溫萃取30 min，然后采用GC-MS 進行檢測[16]。

1.3.4 氣相色譜-質(zhì)譜條件 色譜條件：色譜柱為Agilent DB-wax 毛細管柱 （30 m×0.25 μm×0.25 mm）；進樣口溫度250 ℃，載氣He，流速1.0 mL/min， 采用不分流模式； 升溫程序為起始溫度40℃，保持3 min，以5 ℃/min 的速度升至240 ℃，保持15 min[17]。

質(zhì)譜條件：EI 電離源，電離電壓70 eV，離子源溫度230 ℃，四極桿溫度150 ℃。

1.3.5 風味成分的鑒定與含量計算 按照參考文獻[18]，將各組分質(zhì)譜信息與NIST 08 質(zhì)譜庫進行對照， 將各組分線性保留指數(shù)與文獻中線性保留指數(shù)進行對比，初步確定各組分的成分，最后采用香精標品進一步確認， 以質(zhì)譜解析所得質(zhì)譜峰面積代表各組分的含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 ω-3 LCPUFAs 氧化產(chǎn)物的鑒定

為探索熱加工過程中魚肉脂肪氧化形成風味的過程，以魚肉典型脂肪酸即ω-3 LCPUFAs（EPA、DPA、DHA）為代表，模擬魚肉熱加工過程中脂肪在低溫酶促和高溫熱促作用下氧化形成風味物質(zhì)過程，經(jīng)檢測，風味物質(zhì)GC-MS 總離子流圖見圖1，產(chǎn)物鑒定結(jié)果見表1。

由表1 可知，EPA、DPA 和DHA 經(jīng)低溫脂肪氧化酶作用或加熱處理后均產(chǎn)生了豐富的風味物質(zhì)，包括醛、酮、醇、酯、呋喃、芳香族化合物、烷烴及少數(shù)的其它成分。綜合兩個反應(yīng)，EPA 經(jīng)過處理后產(chǎn)物中共鑒定出73 種風味物質(zhì)，其中醛13 種，酮5 種，醇9 種，呋喃2 種，酯6 種，芳香族化合物30 種，烷烴4 種和其它4 種。 除EPA 甲酯為反應(yīng)物外，其它72 種風味物質(zhì)均為反應(yīng)后形成的化合物。 DPA 經(jīng)兩種方式處理后形成了87 種產(chǎn)物，含醛18 種，酮9 種，醇13 種，呋喃4 種，酯4 種，芳香族化合物30 種，烷烴3 種和其它6 種。 DHA 經(jīng)處理后形成70 種產(chǎn)物，含醛11 種，酮6 種，醇7種，呋喃1 種，酯5 種，芳香族化合物31 種，烷烴4 種和其它5 種。 不同類型產(chǎn)物表現(xiàn)出不同的風味（詳見表1），其中醛、酮、醇表現(xiàn)出蔬菜、水果、鮮花和油脂等令人愉悅的香甜風味； 少量酮和醇還具有土腥味和蘑菇味， 類似于魚體散發(fā)的土腥味和魚腥味，這些產(chǎn)物包括2-辛酮、2-壬酮、3-辛烯-2-酮、 反-2-戊醇、3-辛醇、1-辛烯-3-醇和十二醇等， 其中1-辛烯-3-醇是淡水魚和海水魚均含有的物質(zhì)[19]，表明EPA、DPA 或DHA 經(jīng)處理后形成了魚肉特有的風味。呋喃是典型的風味物質(zhì)，其賦予食物令人愉快的香味，如2-乙基呋喃具有焦香、麥芽香，2-乙?；秽哂刑鹞?、香脂味、杏仁香、可可香、焦香和咖啡香等風味[20]。 芳香族化合物僅少數(shù)具有良好風味， 如對傘花烴具有柑橘味、萜香和香料味等風味，苯甲醛具有甜味、苦杏仁味和櫻桃味等風味， 而其它芳香族化合物多數(shù)具有塑料味、橡膠味或試劑味等不良風味。由于魚及魚制品中也分離鑒定出大量的芳香族化合物[5，21]，因此芳香族化合物也是魚或魚制品風味的重要組成部分。 烷烴氣味較單一，一般不作為風味物質(zhì)。由于魚肉中含有大量的EPA、DPA 和DHA， 經(jīng)處理后會形成大量的風味物質(zhì)。因此，脂肪氧化酶的存在及加熱處理均是魚肉形成風味物質(zhì)重要條件。

圖1 EPA、DPA 和DHA 低溫酶促與熱促氧化產(chǎn)物GC-MS 總離子流圖Fig.1 GC-MS total ion chromatogram of compounds formed by oxidation of EPA， DPA and DHA catalyzed by lipoxidase under low temperature or heating treatment

2.2 脂肪酸種類對氧化產(chǎn)物的影響

不同ω-3 LCPUFAs 經(jīng)低溫脂肪氧化酶解或加熱處理后形成產(chǎn)物的類型、 數(shù)量及含量對比情況見圖2。 由圖2 可知，EPA、DPA 和DHA 3 種脂肪酸經(jīng)兩種方式處理后共產(chǎn)生8 大類107 種成分，其中共有產(chǎn)物20 種。 各種脂肪酸氧化產(chǎn)物的類型基本相同，均含8 大類產(chǎn)物，其中含量最大的產(chǎn)物是芳香族化合物，其它產(chǎn)物（不含其它）含量的大致順序為醛＞酮＞醇或烷烴＞呋喃或酯，表明3種脂肪酸經(jīng)兩種方式處理所發(fā)生的反應(yīng)類型基本相同。 大量研究表明， 魚肉中醇類及羰基化合物（即醛、酮、醇）由魚肉中的多不飽和脂肪酸經(jīng)氧化形成[22-24]，因此本研究中的醇類及羰基化合物可認為是脂肪酸的氧化產(chǎn)物。 呋喃是一類重要的風味化合物，其產(chǎn)生的途徑有3 種，包括脂肪的氧化、美拉德反應(yīng)和碳水化合物的降解[20]。 由于本研究反應(yīng)體系中反應(yīng)物僅有脂肪酸一種， 因此可以推測本研究中的產(chǎn)物呋喃是由脂肪酸經(jīng)氧化形成。本研究中脂肪氧化型產(chǎn)物（醛、酮、醇、呋喃）占總產(chǎn)物含量的6.0%～63.7%， 由此可知氧化反應(yīng)是EPA、DPA 和DHA 形成風味物質(zhì)的主要反應(yīng)之一。 另外，相同條件下處理相同時間，3 種脂肪酸形成的產(chǎn)物含量不同，表明反應(yīng)速率不同，一般產(chǎn)物含量越高表明反應(yīng)速度越快。 本研究中產(chǎn)物含量順序為EPA＞DHA＞DPA， 推測3 種脂肪酸的反應(yīng)速率為EPA＞DHA＞DPA，表明DPA 結(jié)構(gòu)比EPA和DHA 穩(wěn)定，這可能由3 種脂肪酸的結(jié)構(gòu)存在細小差別所決定[25]。

表1 ω-3 LCPUFAs 低溫酶解 與熱促作用 下形成的氧 化產(chǎn)物（峰面積，×106）（n=2）Table 1 Oxidation products of ω-3 LCPUFAs catalyzed by lipoxidase under low temperature or heating treatment（peak area， × 106）（n=2）

（續(xù)表1）

（續(xù)表1）

（續(xù)表1）

（續(xù)表1）

圖2 EPA、DPA 和DHA 低溫酶促和熱促氧化產(chǎn)物的數(shù)量及含量情況Fig.2 Quantity and contents of products formed from oxidation of EPA， DPA and DHA catalyzed by lipoxidase under low temperature or heating treatment

2.3 處理方式對氧化產(chǎn)物的影響

經(jīng)不同方式處理，相同ω-3 LCPUFAs 的反應(yīng)產(chǎn)物類型分布略有不同（見圖2）。 當采用低溫脂肪氧化酶處理時， 芳香族化合物占比最大，在EPA、DPA 和DHA 的反應(yīng)產(chǎn)物中占比分別達91.56%，50.8%和78.9%；當采用加熱處理時，相比脂肪氧化酶處理，醛、酮的含量及其產(chǎn)物占比均呈上升趨勢，氧化產(chǎn)物（醛、酮、醇、呋喃）總含量上升，芳香族化合物含量下降。 由表1 可知，醛、酮、醇和呋喃均表現(xiàn)出良好風味， 而芳香族化合物僅少數(shù)表現(xiàn)出良好風味，多數(shù)為不良風味。 因此，加熱更有利于良好風味物質(zhì)的形成， 這也是熱加工成為魚肉或魚脂形成良好風味有利條件的原因[5]。

3 結(jié)論

EPA、DPA 和DHA 分別經(jīng)低溫脂肪氧化酶處理和加熱處理形成的產(chǎn)物類型相同，包括醛、酮、醇、酯、呋喃、芳香族化合物、烷烴及其它，含量最大成分為芳香族化合物。 不同類型產(chǎn)物表現(xiàn)出不同的風味特征，不同處理方式形成產(chǎn)物風味不同。低溫脂肪氧化酶處理主要形成芳香族化合物，加熱處理形成比例更高的脂肪氧化型產(chǎn)物， 更利于形成令人愉快的風味。 相同條件下不同脂肪酸氧化形成產(chǎn)物數(shù)量與含量不同， 產(chǎn)物含量順序為EPA＞DHA＞DPA， 推測DPA 結(jié)構(gòu)比DHA 和EPA更穩(wěn)定。 3 種脂肪酸的碳鏈數(shù)或飽和度不同，處理方式不同， 但產(chǎn)物的類型相同且有20 個共有成分，其內(nèi)在的機理有待進一步研究。 而且，在魚肉組織中，脂肪酸以甘油三酯形式存在，脂肪酸在甘油三酯中位置也會影響脂肪酸的氧化以及反應(yīng)進程[25]，其在魚肉組織中的氧化機理也需進一步探討。