姚 笛，徐 磊，李佳慧

黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院，大慶 163319

酵素是以動(dòng)植物等為原料，經(jīng)微生物發(fā)酵制得的具有特定生物活性的產(chǎn)品[1]。酵素含有大量的微生物代謝產(chǎn)物，其中酶、氨基酸等營(yíng)養(yǎng)成分含量豐富，因此，酵素具有延緩衰老、抑菌及提高機(jī)體免疫力等功能[2,3]。酵素在發(fā)酵過(guò)程中的抗氧化活性研究是近年來(lái)關(guān)注的焦點(diǎn)，Chen[4]和Dong[5]等對(duì)火龍果酵素發(fā)酵過(guò)程中的抗氧化活性與功能變化規(guī)律進(jìn)行了研究；Guan等[6]研究了藍(lán)莓酵素發(fā)酵過(guò)程中抗氧化性能的變化；Wang等[7]對(duì)桑葚酵素的多酚和原花青素等生物活性成分的含量進(jìn)行測(cè)定，并分析了DPPH自由基清除作用、ABTS自由基清除作用和SOD活性等指標(biāo)。多項(xiàng)研究結(jié)果表明不同酵素的抗氧化活性存在差別，這可能與不同酵素中的微生物群落構(gòu)成和豐度有關(guān)，但是，迄今關(guān)于酵素的微生物菌群多樣性和抗氧化活性的相關(guān)性研究未見報(bào)道[8]。

發(fā)酵食品的微生物多樣性研究方法主要有傳統(tǒng)培養(yǎng)法、底物利用分析法和分子生物學(xué)等方法[9]。目前，對(duì)于酵素樣品的微生物多樣性研究十分貧乏，Jiao等[10]運(yùn)用PCR-DGGE技術(shù)分析了木瓜酵素自然發(fā)酵過(guò)程中的微生物多樣性。然而，隨著高通量測(cè)序技術(shù)的飛速發(fā)展[11]，第二代測(cè)序技術(shù)已經(jīng)能夠?qū)⒎€(wěn)定可逆的終止法邊合成邊測(cè)序反應(yīng)應(yīng)用在樣品中[12]。因此，利用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)不同酵素的微生物多樣性進(jìn)行分析切實(shí)可行。

研究酵素的抗氧化活性與微生物多樣性的相關(guān)性對(duì)于酵素發(fā)酵菌種的選擇至關(guān)重要。發(fā)酵菌種很大程度上決定著酵素的生理活性和安全性，并能縮短發(fā)酵時(shí)間[13]，同時(shí)也直接影響產(chǎn)品的生產(chǎn)工藝和品質(zhì)[14]，而結(jié)合微生物多樣性和抗氧化活性，從酵素中篩選有益菌種的研究未見報(bào)道，因此，本研究以火龍果酵素、藍(lán)莓酵素、桑葚酵素為樣品，測(cè)定其pH值和總酚含量，以DPPH自由基、羥自由基清除能力為指標(biāo)分析其抗氧化活性，同時(shí)，利用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)其中的16S rDNA基因V3-V4區(qū)和ITS基因1-2區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增測(cè)序，分析樣品中細(xì)菌和真菌的群落結(jié)構(gòu)組成[15]，結(jié)合pH值、總酚含量、羥自由基和DPPH清除能力，探討微生物多樣性與抗氧化活性的相關(guān)性，從而為酵素功能特性的闡釋和優(yōu)質(zhì)酵素的開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與主要試劑

新鮮的火龍果、桑葚、藍(lán)莓、檸檬等均購(gòu)自大型超市。

DPPH購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；羥自由基測(cè)定試劑盒購(gòu)自南京建成科技有限公司；E.Z.N.ATM Mag-Bind Soil DNA Kit購(gòu)自O(shè)mega公司；Qubit3.0 DNA檢測(cè)試劑盒購(gòu)自Life公司；2×Taq Master Mix購(gòu)自Vazyme公司；Magic Pure Size Selection DNA Beads為Transgen公司產(chǎn)品；碳酸鈉等試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純；酵素發(fā)酵桶為特百惠(Tupperware Brands Corporation)公司產(chǎn)品。

1.2 儀器與設(shè)備

Q32866型Qubit?ubi熒光計(jì)，Invitrogen公司；T100TMThermal Cyeler型PCR儀，BIO-RAD公司；DELTA320型精密pH計(jì)，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；A360型紫外可見分光光度計(jì)，翰藝儀器(上海)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 酵素的制作

將火龍果去皮切塊，按照火龍果∶蔗糖∶檸檬汁=5∶5∶1的比例放入酵素發(fā)酵桶中，混合均勻，發(fā)酵三個(gè)月；將桑葚、藍(lán)莓洗凈，自然晾干，按水果∶蔗糖∶檸檬汁=5∶5∶1的比例放入酵素發(fā)酵桶中，混合均勻，25 ℃發(fā)酵三個(gè)月。

1.3.2 pH值的測(cè)定

利用pH計(jì)校準(zhǔn)后測(cè)定三種酵素的pH值。

1.3.3 總酚含量測(cè)定

在100 μL樣品中加入45.9 mL去離子水，然后與1 mL Folin-Ciocalteau試劑混合，反應(yīng)3 min，再向其中加入3 mL 20%的Na2CO3溶液，25 ℃恒溫水浴振蕩2 h，然后測(cè)定760 nm下的吸光度，總酚含量是借助沒食子酸等價(jià)物來(lái)表示，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線的方程y=0.091 7x+0.020 8，R2=0.999 6計(jì)算總酚含量(y表示吸光度，x表示樣品濃度)。

1.3.4 羥自由基清除能力測(cè)定

將三種酵素樣品分別混勻，取1 mL樣品進(jìn)行羥自由基清除能力的測(cè)定，按照試劑盒操作說(shuō)明進(jìn)行，羥自由基清除率按照如下公式進(jìn)行計(jì)算：

1.3.5 DPPH自由基的清除能力測(cè)定

將4 mL DPPH(0.025 g/L)溶液中加入1 mL樣品中，室溫下避光30 min，然后測(cè)定其在517 nm下的吸光度值，DPPH自由基的清除能力按照如下公式進(jìn)行計(jì)算。

1.3.6 微生物多樣性的測(cè)定

1.3.6.1 樣品處理

將三種酵素樣品分別混勻，取4 mL樣品分多次加入2 mL滅菌離心管中，10 000 rpm室溫下離心3 min，棄上清液，再將離心管倒置在吸水紙上，保持1 min，至沒有液體流出，取離心管內(nèi)沉淀備用。

1.3.6.2 DNA提取

利用E.Z.N.ATM Mag-Bind Soil DNA Kit對(duì)樣品中的DNA進(jìn)行提取，具體方法參照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。利用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA的完整性，Qubit 3.0 DNA檢測(cè)試劑盒測(cè)定DNA濃度。

1.3.6.3 PCR擴(kuò)增和純化

以檢測(cè)合格的DNA樣品為模板，以341F(CCCTACACGACGCTCTTCCGATCTG)和805R(GA CTGGAGTTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA)為引物，對(duì)細(xì)菌16s rDNA的V3-V4區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增；同時(shí)以ITS1F(CCCTACACGACGCTCTTCCGATCTN)和ITS2R(GTGACTGGAGTTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA)為引物，對(duì)真菌ITS區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物利用Magic Pure Size Selection DNA Beads進(jìn)行純化，具體操作按照說(shuō)明書進(jìn)行。

1.3.6.4 測(cè)序

利用Qubit 3.0 DNA檢測(cè)試劑盒對(duì)回收的PCR產(chǎn)物進(jìn)行精確定量，按照每個(gè)樣品的測(cè)序量要求進(jìn)行混合，將接頭序列添加至目標(biāo)區(qū)域外端后，氫氧化鈉變性產(chǎn)生單鏈DNA片段，利用Illumina HISeq平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序。

1.3.7 序列及相關(guān)性分析

測(cè)序獲得的原始數(shù)據(jù)利用QIIME進(jìn)行質(zhì)控過(guò)濾及OTU聚類，然后與RDP等數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，對(duì)各個(gè)樣品的OTU在門和屬水平等級(jí)上的群落組成進(jìn)行注釋和α-多樣性分析。微生物多樣性與抗氧化活性等環(huán)境因子的CCA分析采用Canoco 4.5進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 三種酵素的pH值和總酚含量

三種酵素發(fā)酵前后的pH值和總酚含量如表1所示，由表可知，三種酵素發(fā)酵后的pH值均降低，其中，藍(lán)莓酵素(T3)的pH值最低，酵素的pH較低是由于發(fā)酵過(guò)程中微生物利用糖產(chǎn)生了大量的有機(jī)酸；酵素的總酚含量比發(fā)酵前明顯升高，其中，藍(lán)莓酵素的總酚含量最高，火龍果酵素(T1)最低，桑葚酵素(T2)的兩項(xiàng)指標(biāo)居于中等水平。

表1 酵素的pH值和總酚含量

注：T1：火龍果酵素；T2：桑葚酵素；T3：藍(lán)莓酵素。上角標(biāo)字母相同表示差異不顯著，P>0.05；上角標(biāo)字母不相同表示差異顯著，P<0.05。

Note:T1:Pitaya Jiaosu;T2:Mulberry Jiaosu;T3:Blueberry Jiaosu.Same superscript letters indicate no significant difference,P> 0.05;Different superscript letters indicate significant difference,P<0.05.

2.2 三種酵素的抗氧化活性

三種酵素發(fā)酵前后的DPPH自由基和羥自由基清除能力如表2所示，由表可知，發(fā)酵后藍(lán)莓酵素的DPPH自由基和羥自由基清除能力最高，說(shuō)明其抗氧化活性較好，火龍果酵素的抗氧化活性較低，桑葚酵素的抗氧化活性居于中等水平。比較發(fā)酵前后三種酵素的自由基清除能力可知，經(jīng)微生物作用后酵素的抗氧化活性明顯增強(qiáng)。

表2 酵素的抗氧化活性

注：T1：火龍果酵素；T2：桑葚酵素；T3：藍(lán)莓酵素。上角標(biāo)字母相同表示差異不顯著，P>0.05；上角標(biāo)字母不相同表示差異顯著，P<0.05。

Note:T1:Pitaya Jiaosu;T2:Mulberry Jiaosu;T3:Blueberry Jiaosu.Same superscript letters indicate no significant difference,P> 0.05;Different superscript letters indicate significant difference,P<0.05.

2.3 三種酵素中細(xì)菌和真菌的α-多樣性分析

對(duì)樣品進(jìn)行α-多樣性分析，可反映出微生物群落的多樣性與豐度。三種酵素樣品中細(xì)菌和真菌的α-多樣性分析結(jié)果如圖1、2、3和表3所示。根據(jù)Shannon、Ace和Chao指數(shù)分析可知，隨著測(cè)序量的增加，細(xì)菌和真菌的稀釋曲線均趨向平坦，說(shuō)明實(shí)驗(yàn)測(cè)序量合理，可涵蓋酵素樣品中的物種總數(shù)，反映樣品內(nèi)細(xì)菌、真菌等微生物信息全貌，其中藍(lán)莓酵素的細(xì)菌測(cè)序量少于其他兩種酵素，而真菌的測(cè)序量高于其他兩種酵素，這與樣品中的物種構(gòu)成和豐度相關(guān)。由表3可知，三種酵素的覆蓋率均大于98%，覆蓋率表示檢測(cè)樣品文庫(kù)覆蓋率(Max=1)，數(shù)值越大表示更真實(shí)的反映樣品情況。三種酵素的細(xì)菌Shannon指數(shù)均大于真菌的Shannon指數(shù)，說(shuō)明三種酵素的細(xì)菌多樣性高于真菌多樣性，其中藍(lán)莓酵素細(xì)菌和真菌的Shannon指數(shù)最高，分別為4.03和2.37，說(shuō)明藍(lán)莓酵素的微生物多樣性高于其他兩種酵素。根據(jù)Chao指數(shù)可確定酵素樣品的物種豐度，細(xì)菌中藍(lán)莓酵素的Chao指數(shù)最高，為9 721.56，說(shuō)明藍(lán)莓酵素的細(xì)菌豐度高于其他兩種酵素，真菌中火龍果酵素的Chao指數(shù)最高，為7 883.88，說(shuō)明火龍果酵素的真菌豐度高于其他兩種酵素。Ace指數(shù)與Chao指數(shù)的算法不同，也能反映OTU的數(shù)目和物種豐度。綜上所述，三種酵素樣品原料的差異性可誘導(dǎo)微生物群落多樣性的不同。

圖1 酵素中細(xì)菌(A)與真菌(B)的Shannon指數(shù)

圖2 酵素中細(xì)菌(A)與真菌(B)的Ace指數(shù)

圖3 酵素中細(xì)菌(A)與真菌(B)Chao指數(shù)

表3 酵素中細(xì)菌和真菌的α-多樣性指標(biāo)統(tǒng)計(jì)

2.4 OTU分布韋恩圖分析

韋恩圖用于表示多個(gè)樣本共有和特有 OTU的情況[16]。如圖4所示，三種酵素樣品的細(xì)菌OTU總數(shù)為2 122，對(duì)3種酵素含有的細(xì)菌和真菌分別進(jìn)行基于OTU的韋恩分析，發(fā)現(xiàn)T1(火龍果酵素)有757個(gè)細(xì)菌OTU，T2(桑葚酵素)有705個(gè)細(xì)菌OTU，T3(藍(lán)莓酵素)有965個(gè)細(xì)菌OTU，其中T1、T2共有117個(gè)細(xì)菌OTU，T2、T3共有127個(gè)細(xì)菌OTU，T1、T3共有149個(gè)細(xì)菌OTU，T1、T2、T3具有88個(gè)共有細(xì)菌OTU。T3(藍(lán)莓酵素)的特有細(xì)菌OTU數(shù)目最多。三種酵素樣品的真菌OTU 總數(shù)為2592，T1有1140個(gè)真菌OTU，T2有669個(gè)真菌OTU，T3有1012個(gè)真菌OTU，其中T1、T2具有116個(gè)共有真菌OTU，T2、T3具有70個(gè)共有真菌OTU，T1、T3共有78個(gè)真菌OTU，T1、T2、T3共有36個(gè)真菌OTU。T1(火龍果酵素)的特有真菌OTU數(shù)目最多。

圖4 酵素樣品中細(xì)菌(A)及真菌(B)的OTU分布韋恩圖

2.5 群落結(jié)構(gòu)組分分析

基于各樣本物種豐度通過(guò)Bray-Curtis算法構(gòu)建樣本聚類樹[17]，與物種豐度柱狀圖結(jié)合能直觀的看出樣本間的關(guān)系及物種構(gòu)成。由圖5可知，在細(xì)菌的門水平群落結(jié)構(gòu)組分中共分析了29個(gè)細(xì)菌門，三種酵素的細(xì)菌門水平的群落構(gòu)成相似，其中變形菌門(Proteobacteria)豐度最高，其次是厚壁菌門(Firmicutes)，第三是放線菌門(Actinobacteria)；在細(xì)菌屬水平群落結(jié)構(gòu)組分中共分析了50個(gè)細(xì)菌屬，其中火龍果酵素與藍(lán)莓酵素的細(xì)菌屬水平的群落構(gòu)成相似，桑葚酵素的菌屬豐度與其他兩種酵素有一定差別，總的來(lái)說(shuō)，高豐度的細(xì)菌是中慢生根瘤菌屬(Mesorhizobium)和鹽單胞菌屬(Halomonas)。由圖6可知，在真菌門水平群落結(jié)構(gòu)組分分布中共分析了11個(gè)真菌門，三種酵素的真菌門水平的群落構(gòu)成相似，優(yōu)勢(shì)真菌均為子囊菌門(Ascomycota)，其中藍(lán)莓酵素的未分類菌門(unclassified)也占有一定比例；在真菌屬水平群落結(jié)構(gòu)組分分布中共分析了50個(gè)真菌屬，其中火龍果酵素和桑葚酵素的優(yōu)勢(shì)真菌為奧默柯達(dá)酵母屬(Kodamaea)，藍(lán)莓酵素的優(yōu)勢(shì)真菌為帚枝霉屬(Sarocladium)和漢遜酵母屬(Hanseniaspora)。

圖5 不同酵素樣本間細(xì)菌門水平(A)和屬水平(B)的相對(duì)豐度

圖6 不同酵素樣本間真菌門水平(A)和屬水平(B)的相對(duì)豐度

2.6 物種豐度的聚類分析

Heatmap的顏色變化可反映群落分布的豐度信息。將門、屬水平上的分類信息進(jìn)行組間豐度相似性聚類，通過(guò)顏色梯度及相似程度來(lái)反映樣品在各分類水平上群落組成的相似性和差異性[18]。

由菌群組成的熱圖(圖7、8)可知，紅色代表豐度高，藍(lán)色代表豐度低，在細(xì)菌群落構(gòu)成中火龍果酵素和藍(lán)莓酵素歸屬同一分支，桑葚酵素與其他兩種酵素差距較大，如酸桿菌門(Acidobacteria)、梭桿菌門(Fusobacteria)、苯基桿菌屬(Phenylobacterium)、弧菌屬(Vibrio)在火龍果和藍(lán)莓酵素中豐度較低，但在桑葚酵素中豐度較高。

火龍果酵素和桑葚酵素的真菌群落構(gòu)成差異較小，歸屬同一分支，藍(lán)莓酵素與另外兩種酵素差異較大，如類原生動(dòng)物門(Rozellomycota)、梅奇酵母屬(Metschnikowia)、接合酵母屬(Zygosaccharomyces)、畢赤酵母屬(Pichia)在火龍果酵素和桑葚酵素中豐度較低，在藍(lán)莓酵素中豐度較高。

2.7 酵素的抗氧化活性與部分微生物群落豐度之間的相關(guān)性分析

酵素的抗氧化活性與微生物群落豐度的相關(guān)性分析如圖9和10所示，由圖可知，酵素的pH值、總酚含量、羥自由基清除能力、DPPH自由基清除能力與其微生物群落構(gòu)成有一定的相關(guān)性。與pH值呈正比的細(xì)菌有假單胞菌屬(Pseudomonas)、魏斯氏菌屬(Weissella)、紫桿菌屬(Porphyrobacter)、中慢生根瘤菌屬(Mesorhizobium)；真菌有奧默柯達(dá)酵母屬(Kodamaea)、漢遜酵母屬(Hanseniaspora)、假絲酵母屬(Candida)、酵母屬(Saccharomyces)、短梗霉屬(Aureobasidium)、棒孢酵母屬(Clavispora)。與總酚含量呈正比的細(xì)菌有伯克氏菌屬(Limnobacter)、梭狀芽孢桿菌屬(Clostridium)、鏈球菌屬(Streptococcus)、鹽單胞菌屬(Halomonas)、短單胞菌屬(Brevundimonas)；真菌有帚枝霉屬(Sarocladium)、梅奇酵母屬(Metschnikowia)、鐮刀菌屬(Fusarium)、接合酵母屬(Zygosaccharomyces)。與羥自由基清除能力呈正比的細(xì)菌有假單胞菌屬(Pseudomonas)、魏斯氏菌屬(Weissella)、短單胞菌屬(Brevundimonas)、梭狀芽孢桿菌屬(Clostridium)、伯克氏菌屬(Limnobacter)、鏈球菌屬(Streptococcus)；真菌有假絲酵母屬(Candida)、酵母屬(Saccharomyces)、短梗霉屬(Aureobasidium)、梅奇酵母屬(Metschnikowia)、棒孢酵母(Clavispora)、接合酵母屬(Zygosaccharomyces)。與DPPH自由基的清除能力呈正比的細(xì)菌有中慢生根瘤菌屬(Mesorhizobium)、短單胞菌屬(Brevundimonas)、甲基桿菌屬(Methylobacterium)；真菌有奧默柯達(dá)酵母屬(Kodamaea)、漢遜酵母屬(Hanseniaspora)、未分類酵母屬。

圖7 不同酵素樣本間具有豐度差異的細(xì)菌門(A)和屬(B)水平熱圖

圖8 不同酵素樣本間具有豐度差異的真菌門(A)和屬(B)水平熱圖

圖9 酵素的細(xì)菌屬水平群落與抗氧化活性的關(guān)系

圖10 酵素的真菌屬水平群落與抗氧化活性的關(guān)系

3 討論

本文結(jié)合不同酵素的抗氧化活性與微生物群落組成的差別，探討兩者之間的相關(guān)性。酵素具有一定的抗氧化活性，但不同原料來(lái)源的酵素的抗氧化活性存在差異。羥自由基是一種活性氧，在體內(nèi)可與金屬離子作用，形成高氧化態(tài)，清除體內(nèi)羥自由基可有效控制高氧化狀態(tài)，而DPPH自由基相較于超氧自由基等更加穩(wěn)定，能更好的評(píng)價(jià)抗氧化活性。本文結(jié)合不同酵素的總酚含量及DPPH、羥自由基清除率評(píng)價(jià)其抗氧化性。三種酵素中，藍(lán)莓酵素的自由基清除能力最強(qiáng)，并與總酚含量成正相關(guān)，這與蔣增良等研究藍(lán)莓酵素的抗氧化性與多酚含量呈正相關(guān)性的結(jié)果吻合[19]。酵素中自由基清除率的上升可能是由于多酚含量的增加和多糖的共同作用[20]，還有研究表明，多酚分子中活性酚羥基具有較強(qiáng)的還原力，即具有較強(qiáng)的抗氧化活性[19]。

本文利用高通量測(cè)序技術(shù)探討不同酵素的微生物多樣性，從結(jié)果可以看出，不同酵素在門水平上差異不大，其中變形菌門和厚壁菌門是細(xì)菌的優(yōu)勢(shì)菌門，子囊菌門為真菌的優(yōu)勢(shì)菌門；不同酵素在屬水平上差異較大，其中火龍果酵素和藍(lán)莓酵素在細(xì)菌屬水平上較為相近，火龍果酵素和桑葚酵素在真菌屬水平上較為相近，例如中慢生根瘤菌屬為優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬，優(yōu)勢(shì)真菌為奧默柯達(dá)酵母屬和漢遜酵母屬。這表明果蔬的營(yíng)養(yǎng)成分不同，最終使不同酵素在細(xì)菌和真菌的構(gòu)成上存在差異。

雖然不同酵素的抗氧化活性研究已有較多報(bào)道，但對(duì)于不同酵素的微生物多樣性與抗氧化活性之間的相關(guān)性分析未見報(bào)道。本研究表明，三種酵素的抗氧化活性與細(xì)菌的相關(guān)性較小，DPPH、羥自由基的清除率與兩個(gè)細(xì)菌菌屬(中慢生根瘤菌屬、甲基桿菌屬)等呈現(xiàn)正相關(guān)；與真菌的相關(guān)性較大，如奧默柯達(dá)酵母屬、漢遜酵母屬等多個(gè)真菌菌屬與抗氧化指標(biāo)呈現(xiàn)正相關(guān)。

4 結(jié)論

三種酵素中藍(lán)莓酵素的總酚含量和抗氧化活性最高，pH值最低。三種酵素共獲得2 122個(gè)細(xì)菌OTU和2 592個(gè)真菌OTU，α-多樣性分析發(fā)現(xiàn)樣品中的細(xì)菌群落多樣性均高于真菌群落多樣性，三種酵素的細(xì)菌群落豐富度高于真菌群落豐富度。三種酵素的優(yōu)勢(shì)菌門為變形菌門(Proteobacteria)和子囊菌門(Ascomycota)，其中慢生根瘤菌屬(Mesorhizobium)和漢遜酵母屬(Hanseniaspora)等菌屬的豐度較高且差異較大。微生物群落構(gòu)成與pH值、總酚含量、羥自由基清除能力、DPPH自由基清除能力具有一定的相關(guān)性。不同微生物與抗氧化活性的相關(guān)性分析結(jié)果可為微生物酵素產(chǎn)品的研發(fā)優(yōu)化提供有用參考。