謝麗源，蘭秀華，唐 杰，彭衛(wèi)紅，甘炳成

四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院土壤肥料研究所，成都 610066

羊肚菌(Morchellaspp.)是一種珍稀名貴食用菌，由于其菌蓋表面有不規(guī)則多面凹陷皺褶似羊肚而得名[1]。羊肚菌含有豐富的氨基酸，是植物性蛋白質(zhì)的重要來源之一，同時還含有多糖、生物酶類、礦物質(zhì)元素等[2,3]有調(diào)節(jié)機體免疫力、抗疲勞、抑制腫瘤、抗菌、抗病毒、降血脂、抗氧化等多種功效[4-6]。課題組通過10多年攻關(guān)實現(xiàn)了羊肚菌大田商業(yè)化栽培的成功，并先后通過四川省農(nóng)作物品種審定委員會審定羊肚菌品種9個。隨著羊肚菌人工栽培技術(shù)日益成熟，羊肚菌菌體蛋白的開發(fā)和利用越來越受到重視，但目前原材料選擇存在隨機性和普遍性，也沒有一定的標(biāo)準(zhǔn)，并且評價羊肚菌菌體蛋白質(zhì)營養(yǎng)價值的研究及深入分析還不多見。而對于不同品種間的氨基酸營養(yǎng)價值以及營養(yǎng)差異一直未作評價，不同羊肚菌品種間營養(yǎng)價值和鮮味是否存在一定差異，這些問題都將影響羊肚菌品種有效利用。本文以不同羊肚菌品種作為研究材料，對游離氨基酸和5′-核苷酸含量進行測定，采用模式譜和等鮮濃度等方法對其進行營養(yǎng)價值和口感評價，從而為其在羊肚菌食用價值和藥用價值的開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院微生物研發(fā)中心馴化，并經(jīng)過四川省農(nóng)作物品種審定委員會審定羊肚菌品種9個，如表1所示。9個羊肚菌品種在四川新都基地栽培，采用統(tǒng)一栽培模式、相同栽培配方和采收標(biāo)準(zhǔn)得到的羊肚菌子實體，經(jīng)烘干、粉碎待用。

表1 供試羊肚菌品種

1.2 主要儀器與試劑

Fw-80高速粉碎機(北京啟宏瑞達科技有限公司)；DZF-6020真空干燥箱(上海精宏實驗設(shè)備有限公司)；超純水裝置(Millipore公司)；L-8900氨基酸自動分析儀(日本Hitachi公司)；ALC-Z10.3電子天平(北京賽多利斯天平有限公司)；UV1800分光光度計(日本島津公司)；LC-20高效液相色譜儀(日本島津公司)混合氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品，色氨酸標(biāo)準(zhǔn)品(美國Sigma公司)；乙腈、甲醇均為色譜純(奧克生物科技有限公司)，茚三酮、鹽酸、氫氧化鉀等常規(guī)試劑(科龍化工)。

1.3 氨基酸測定

稱取1 g樣品，加入水解管中，加入100 mL 6 mol/L 的鹽酸，封管后，于100 ℃水解24 h，水解后樣品經(jīng)處理后通過L-8900氨基酸自動分析儀進行氨基酸分析[7]。

測試條件：分離柱(4.6 mm×60.0 mm)柱溫為55 ℃，反應(yīng)器溫度為130 ℃，洗脫液流速為0.40 mL/min，三酮流速為0.35 mL/min，進樣量為20 μL。

色氨酸的測定：參考GB/T 15400-1994《飼料中色氨酸的測定方法 分光光度法》。

稱取樣品0.1 mg，置于50 mL容量瓶中，緩慢加入25 mL氫氧化鉀溶液，置于40℃水解16～18 h，取出水解液，離心4 000 rpm轉(zhuǎn)速離心15 min。取2 mL上清液置具塞試管中，加入5 mL二甲氨基苯甲醛溶液，搖勻，以硫酸溶液作為空白，室溫放置30 min，再加入0.2 mL亞硝酸鈉溶液，室溫放置25 min，在590 nm測定樣品吸光度值。

1.4 營養(yǎng)評價方法

根據(jù)1973年世界衛(wèi)生組織/聯(lián)合國糧農(nóng)組織(WHO/FAO)修訂的理想蛋白質(zhì)人體必需氨基酸模式譜，計算樣品中的下列指標(biāo)：

1.4.1 必需氨基酸(essential amino acid，AA)占總氨基酸的質(zhì)量分數(shù)[8]

EAA=樣品必需氨基酸含量/樣品總氨基酸含量×100%

1.4.2 氨基酸比值(ratio of amino acid，RAA)[9]

RAA=待測氨基酸的EAA值/模式譜中氨基酸的相應(yīng)EAA值即樣品中某種必需氨基酸的含量與WHO/FAO 模式譜中相應(yīng)氨基酸含量的比值。由于胱氨酸和酪氨酸分別由蛋氨酸和苯丙氨酸轉(zhuǎn)變而成，因此將苯丙氨酸和酪氨酸,蛋氨酸和胱氨酸分別合并計算。

1.4.3 氨基酸比值系數(shù)(ratio coefficient of amino acid，RC)[10]

RC=RAA/RAA平均值，RC大于1表明該種必需氨基酸相對過剩，RC等于1表明其組成比例與模式譜一致，RC小于1表明該種必需氨基酸相對不足，RC 最小者為第一限制氨基酸。

1.4.4 比值系數(shù)分(score of ratio coefficient of amino acid，SRC)[11]

SRC=100-CV×100，其中CV為RC的變異系數(shù)。當(dāng)SRC=100 時，表明該食用菌中必需氨基酸的組成比例與模式譜一致，SRC越接近100，表明食用菌的營養(yǎng)價值越高，SRC越小，則營養(yǎng)價值越低。

1.5 5′-核苷酸檢測

取羊肚菌干品1 g，加入25 mL蒸餾水，煮沸1min，冷卻至室溫后于12 000 rpm離心15 min，取出上清液，廢渣以相同方法重提一次，合并上清液，定容至50 mL。取上清液過0.22 μm微孔濾膜，高效液相色譜儀進行檢測[12]。色譜條件：C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動相：KH2PO4緩沖液，259 nm紫外掃描檢測，柱溫30 ℃；進樣量10 μL。

1.6 等鮮濃度值計算

等鮮濃度值(equivalent umami concentration，EUC)常用來表征食品的鮮味程度，指在100 g干重的食物中，以谷氨酸鈉(monosodium glutamate，MSG)的量來表示呈鮮物質(zhì)的總量，計算公式如下[13]：

Y=∑aibi+1218(∑aibi)(∑ajbj)

式中：Y是EUC值，單位是g MSG/100 g；ai為呈鮮氨基酸(天冬氨酸ASP和谷氨酸Glu)的質(zhì)量分數(shù)%，aj為呈鮮核苷酸5′-肌苷酸[(5′-IMP)、5′-鳥苷酸(5′-GMP)、5′-黃苷酸(5′-XMP)、5′-腺苷酸(5′-AMP)]的質(zhì)量分數(shù)%，bi為呈鮮氨基酸相對MSG的鮮味程度值(Glu=1，Asp=0.077)；bj為呈味核苷酸相對5′-核苷酸的值(5′-IMP=1、5′-GMP=2.3、5′-XMP=0.61、5′-AMP=0.18)，1218為協(xié)同作用常數(shù)(濃度單位為g/100 g)。

1.7 數(shù)據(jù)處理

采用IBM SPSS Statistics 22.0進行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同羊肚菌品種游離氨基酸差異分析

采用氨基酸自動分析儀對樣品溶液進行測定，9個羊肚菌品種氨基酸組成及含量如表2所示。羊肚菌品種均含有18種氨基酸，必需氨基酸齊全，但氨基酸總量有明顯差異，范圍在17.23～26.16%之間，由高到低為M9、M7、M10、M8、M6、M5、M1、M4、M3；不同品種間必需氨基酸含量/氨基酸總量(essential amino acid/total amino acids，E/T)值和必需氨基酸含量/非必需氨基酸含量(essential amino acid/non-essential amino acid，E/N)值差別不大，分別在35.47%-37.53%和 54.94%～60.09%。根據(jù)FAO/WHO提出的理想蛋白模式，質(zhì)量較好的蛋白質(zhì)是E/T為40%左右，E/N在60%以上[11]。由表2可知，羊肚菌樣品均未達到理想模式E/T和E/N要求。

表2 不同羊肚菌品種氨基酸組成及含量(%)

2.2 不同羊肚菌品種呈味氨基酸差異分析

不同氨基酸賦予食品鮮、甜、苦等味道，共同組成食用菌獨特滋味。Glu和Asp是鮮味氨基酸中的特征氨基酸，其組成和含量決定口味的鮮美和可口程度[14]。由表3可知，Glu在羊肚菌中含量最高，其次為Asp，可見羊肚菌鮮味氨基酸含量豐富，含量比例均在20%以上，口感鮮美。同時，Glu和Asp還具有藥用價值，是藥用氨基酸的主要成分，在治療神經(jīng)損傷、改善兒童智力發(fā)育和緩解疲勞，調(diào)節(jié)腦和神經(jīng)代謝方面起到作用。甜味氨基酸包括Ser、Gly、Ala、Pro等四種氨基酸，羊肚菌品種間含量比例差別不大，20.64%～23.65%。苦味氨基酸是由必需氨基酸組成，包括His、Val、Phe、Ile、Leu、Met、Arg，品種間含量比例范圍為35.34%～38.08%。由表3還可知，呈味氨基酸含量比例大小為苦味氨基酸>鮮味氨基酸>甜味氨基酸，且鮮甜味氨基酸的總量占苦味氨基酸的比例為1.20 ～1.35倍。由此可見，不同羊肚菌品種間鮮味氨基酸、苦味氨基酸和甜味氨基酸含量比例差別不大，風(fēng)味差別不明顯；同時還發(fā)現(xiàn)，鮮甜味氨基酸占比較大，Glu、Asp、Arg、Gly、Phe、Tyr、Met、Leu、Lys等藥用氨基酸含量豐富，說明羊肚菌具有不錯的口感和保健功能，具有較大的開發(fā)價值。

表3 呈味氨基酸含量及組成比例

2.3 不同羊肚菌品種必需氨基酸配比及營養(yǎng)評價

氨基酸比值系數(shù)法是氨基酸營養(yǎng)評價的常用方法。該方法以氨基酸平衡理論為基礎(chǔ)，評價目標(biāo)物質(zhì)的必需氨基酸比例是否接近或符合WHO/FAO的氨基酸模式要求，其比例越接近，目標(biāo)物質(zhì)的營養(yǎng)價值越高[15]。將9個羊肚菌品種必需氨基酸EAA值與WHO/FAO模式譜中相應(yīng)氨基酸的EAA值進行比較，結(jié)果見表4。羊肚菌樣品中Thr、Val以及Phe+Tyr的EAA值均高于WHO/FAO模式譜，Trp均低于模式譜，除此之外，其他氨基酸模式在不同品種有較大差異，M3、M4、M5、M6、M7、M8、M9、M10的Ile和Leu EAA值高于模式譜，M1、M7、M9和M10的Met+Cys EAA值高于模式譜，M1、M4、M5、M6、M8和M9的Lys比例高于模式譜。由此說明羊肚菌氨基酸模式與人體需求有一定差別，需要給予補充，才能提高利用率。

根據(jù)EAA含量及比例計算RAA、RC和SRC，可以對食物的營養(yǎng)價值進行直觀的評價。由表5中RC值可知，不同品種過剩和不足的氨基酸不盡相同，但總的來說，Thr、Val及Phe+Tyr在羊肚菌中均相對過剩，而Trp均表現(xiàn)為相對不足，是羊肚菌的第一限制氨基酸，這與大多數(shù)研究表明一般的植物性食物都缺少Trp相一致[16]。

SRC是引入氨基酸平衡理論結(jié)合FAO/WHO評價模式建立的蛋白質(zhì)評價指標(biāo)。9個羊肚菌品種的SRC值由高到低分別為M10(66.08)、M9(63.58)、M8(62.49)、M6(61.52)、M7(60.03)、M5(59.48)、M4(59.18)、M1(57.77)、M3(57.33)，但差別不大，均在60%左右。由此說明不同羊肚菌品種間營養(yǎng)價值差別不大。

表4 不同羊肚菌品種必需氨基酸的EAA值

表5 不同羊肚菌品種中必需氨基酸的RAA、RC和SRC值

2.4 不同羊肚菌品種核苷酸差異分析

5′-核苷酸是典型的呈鮮味物質(zhì)，這些呈味核苷酸不僅具有顯著的增鮮作用，而且對于動物性食品的各種滋味也有一定的增鮮作用。對不同羊肚菌品種進行5′-核苷酸檢測，結(jié)果如表6所示。由表6可知，羊肚菌品種均檢出6種核苷酸5′-CMP、5′-AMP、5′-IMP、5′-GMP、5′-UMP和5′-XMP，總核苷酸(total nucleotide，TNT)范圍跨度較大，從294.479～1230.47 μg/g，且羊肚菌品種均呈現(xiàn)5′-CMP和5′-IMP含量最高，5′-GMP、5′-UMP和5′-AMP含量次之，5′-XMP含量最低的規(guī)律。鮮味核苷酸(umami nucleotide，UNT)表現(xiàn)為M9和M4高于其余羊肚菌品種。

表6 羊肚菌子實體中5′-核苷酸的含量(μg/g)

注：X=平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差，不同字母：5%顯著性差異。

Note:X=Mean ±Standard Error,Different letters:5% significant difference.

2.5 等鮮濃度計算結(jié)果分析

圖1 不同羊肚菌樣品等鮮濃度

研究表明，食用菌令人稱道的鮮味主要來源于5′-核苷酸及呈鮮氨基酸，表征食用菌鮮味的等鮮濃度值(EUC)是由此兩類物質(zhì)計算而得，用以客觀評價食物的呈鮮作用。9個羊肚菌品種的EUC值如圖1所示。由圖1可知，9個羊肚菌品種的EUC值為45.83～216.51 g MSG/100 g，其中M1、M3、M5、M6的EUC值小于100 g MSG/100 g，M4、M7、M8、M9、M10的EUC值大于100 g MSG/100 g，M9號最突出。Mau等[17]對EUC值劃分為四個水平：第一水平為EUC>1 000 g MSG/100 g干重，第二水平為100

3 討論

隨著食用菌產(chǎn)業(yè)的不斷發(fā)展，對于產(chǎn)量和質(zhì)量之間的質(zhì)疑不絕于耳，人們對食用菌的關(guān)注已由“數(shù)量”向“質(zhì)量”轉(zhuǎn)變，因此對食用菌質(zhì)量和風(fēng)味進行評價具有重要意義。食用菌營養(yǎng)和風(fēng)味的差異是由樣品中成分的差異造成，而氨基酸和核苷酸對羊肚菌營養(yǎng)和獨特的風(fēng)味起著重要貢獻。

氨基酸是人體進行新陳代謝的重要物質(zhì)，不僅具有各種不同生理功能，更是主要的呈味物質(zhì)，對食品的風(fēng)味發(fā)揮著十分重要的作用。項目組經(jīng)過多年攻關(guān)，審定羊肚菌品種9個，但不同品種間的營養(yǎng)和風(fēng)味差異還不明確，這不利于羊肚菌品種的有效利用。研究發(fā)現(xiàn)，不同羊肚菌品種氨基酸種類齊全，含量豐富，總量在15%以上，鮮甜味氨基酸含量占比重大，占總量20%以上。同時不同羊肚菌品種間鮮甜味和苦味氨基酸含量差別不大，可見不同品種間風(fēng)味差別不明顯。

在蛋白質(zhì)的質(zhì)量評價中，必需氨基酸的組成及含量是評價蛋白質(zhì)是否優(yōu)質(zhì)的非常重要的指標(biāo)[18]。WHO/FAO氨基酸模式是開展不同品種營養(yǎng)評價的重要標(biāo)準(zhǔn)，被廣泛用于各類果蔬、肉類等營養(yǎng)評價分析[19]。研究表明，不同品種蘇氨酸、纈氨酸及苯丙氨酸+酪氨酸在羊肚菌中均相對過剩，而色氨酸均表現(xiàn)為相對不足，是羊肚菌的第一限制氨基酸，這種限制氨基酸會極大地降低蛋白質(zhì)的整體利用率，導(dǎo)致其他的必需氨基酸在體內(nèi)不能被充分利用而浪費，使得羊肚菌氨基酸模式與WHO/FAO氨基酸模式差別較大。因此，需要在食用時考慮和限制性氨基酸含量較高的食物一同食用，充分補足該類限制性氨基酸，提高羊肚菌中各類必需氨基酸的整體利用率和營養(yǎng)價值。

食物的鮮味是氨基酸類鮮味物質(zhì)和呈味核苷酸物質(zhì)共同作用的結(jié)果。5′-核苷酸對甜味、肉味有增效作用，對咸、酸、苦味及腥、焦味有抑制作用。同時，5′-核苷酸可以增加蘑菇的鮮味，并且與MSG共同存在時，鮮味協(xié)同增強[20,21]。本研究表明，羊肚菌5′核苷酸種類齊全，包括了6個單核苷酸，5′-CMP、5′-AMP、5′-IMP、5′-GMP、5′-UMP和5′-XMP。通過對不同羊肚菌品種等鮮濃度值分析，不同羊肚菌樣品的等鮮濃度差別較大，分屬2個水平，M1、M3、M5處于第三水平(10