伍明江，張德芹，李 盼，石旭柳，劉 璐

1遵義醫(yī)藥高等專(zhuān)科學(xué)校藥學(xué)系，遵義 563006；2天津中醫(yī)藥大學(xué) 中醫(yī)藥研究院，天津 301617；3河北農(nóng)業(yè)大學(xué)渤海校區(qū)理工學(xué)院，黃驊 061100；4北京中醫(yī)藥大學(xué)東方學(xué)院中藥學(xué)院，廊坊 065001

胰島素抵抗是2型糖尿病主要的發(fā)病機(jī)制之一，脂肪細(xì)胞作為胰島素敏感的靶細(xì)胞之一，在胰島素抵抗和2型糖尿病的發(fā)病中起著重要作用。腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)是細(xì)胞內(nèi)能量代謝重要的一種調(diào)節(jié)因子，是研究糖尿病及其他代謝相關(guān)疾病的核心，其參與機(jī)體胰島素敏感性的調(diào)節(jié)，AMPK的激活能降低血糖、改善糖脂代謝紊亂和減輕胰島素抵抗。

檉柳黃素是槲皮素甲基化代謝產(chǎn)物[1,2]，在番石榴葉[3]、銀杏[4]、艾納香[5]等中藥中具有分布。在我們前期研究中發(fā)現(xiàn)，檉柳黃素是槲皮素體內(nèi)主要的甲基化代謝產(chǎn)物，主要存在于尿液和糞便中[6]。槲皮素具有顯著改善胰島素抵抗作用[7,8]，而檉柳黃素作為槲皮素體內(nèi)的主要代謝產(chǎn)物，研究其對(duì)胰島素抵抗的影響很有必要。據(jù)報(bào)道，檉柳黃素具有抗炎[9]、抗氧化[10]、抗腫瘤[11]、抗血栓[12]、心肌保護(hù)[13]等作用，但檉柳黃素在改善胰島素抵抗及其作用機(jī)制的研究尚未見(jiàn)報(bào)道，為了闡明槲皮素體內(nèi)主要甲基化代謝產(chǎn)物檉柳黃素對(duì)胰島素抵抗的影響，本實(shí)驗(yàn)擬通過(guò)建立3T3-L1脂肪細(xì)胞胰島素抵抗模型，觀察檉柳黃素對(duì)細(xì)胞增殖分化、Glu的攝取和細(xì)胞內(nèi)TG的影響，并進(jìn)一步探索AMPK信號(hào)通路中與糖脂代謝相關(guān)基因和蛋白在改善胰島素抵抗中的作用機(jī)制。該研究為檉柳黃素在糖脂代謝紊亂性疾病方面的作用及其作用機(jī)制探討奠定了一定的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 細(xì)胞株

小鼠3T3-L1脂肪前體細(xì)胞，購(gòu)自于北京醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所。

1.1.2 藥物與試劑

檉柳黃素(天津萬(wàn)象恒遠(yuǎn)科技有限公司，批號(hào)20160828)；地塞米松、MTT噻唑藍(lán)、羅格列酮、DMSO、油紅O、IBMX(美國(guó)Sigma公司，批號(hào)分別為D1756、M2128、R2408、V900090、O0625、I5879)；FastQuant cDNA第一鏈合成試劑盒，SYBR Green試劑盒(天根生化科技北京有限公司，批號(hào)分別為KR106-02和FP205-02)；DMEM(高糖)(美國(guó)HyClone公司，批號(hào)SH30022.01)；胎牛血清，胰蛋白酶(美國(guó)Gibco公司，批號(hào)分別為16000044、25210056)；PS，Trizol Reagent(美國(guó) Invitrogen公司，批號(hào)分別為15070066、15596018)；重組人源胰島素(北京索萊寶科技有限公司，批號(hào)I8830)；葡萄糖含量測(cè)定試劑盒(北京普利萊基因技術(shù)有限公司，批號(hào)E1010)；甘油三酯含量測(cè)定試劑盒(北京諾博萊德科技有限公司，批號(hào)0510A17)；Phospho-AMPKα 抗體、Phospho-ACC 抗體、Phospho-PKB 抗體、Fatty Acid Synthase 抗體、β-Actin 抗體(美國(guó)CST公司，批號(hào)分別為2531S、11818T、4060T、3180T、4970T)；PPARα抗體(美國(guó)ABcam公司，批號(hào)ab24509)；Goat Anti-Rabbit IgG(H+L)HRP(美國(guó)Affinity公司，批號(hào)S0001)；引物合成(上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司)。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器

OLYMPUS CKX31型倒置相差顯微鏡(日本Olympus公司)；IL-161HI型二氧化碳培養(yǎng)箱(施都凱儀器設(shè)備上海有限公司)；ClightCycler480II型實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(瑞士Roche公司)；Varioskan Flash型全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀(美國(guó)Thermo公司)；Nanodrop型超微量分光光度計(jì)(美國(guó)Thermo公司)；SW-CJ-2D型雙人單面凈化工作臺(tái)(蘇州凈化設(shè)備有限公司)；JY300C型電泳儀及水平電泳槽(北京市六一儀器廠)；MultiGel-21型多功能冷光熒光影像定量分析系統(tǒng)(臺(tái)灣TOPBIO公司)；ImageQuant 350 型熒光化學(xué)發(fā)光成像儀(美國(guó)GE公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 MTT法檢測(cè)檉柳黃素對(duì)3T3-L1脂肪細(xì)胞存活率的影響

待96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)至覆蓋板底70～80%左右，配制濃度分別為0、0.195、0.390、0.781、1.563、3.125、6.250、12.500、25.000、50.000 μg/mL的待測(cè)樣品，棄掉原培養(yǎng)液，加入樣品，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)，48 h后按20 μL/孔加入5×MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，取出后吸去舊培養(yǎng)液，加入150 μL/孔DMSO，放于酶標(biāo)儀中，振蕩30 s，測(cè)定OD在492 nm處的吸收值。

1.2.2 3T3-L1脂肪細(xì)胞油紅O染色鑒定

將培養(yǎng)液換成含有0.5 mmol/L IBMX、1 μmol/L地塞米松和10 μg/mL胰島素的高糖DMEM完全培養(yǎng)液進(jìn)行誘導(dǎo)分化，培養(yǎng)48 h后，換為含10 μg/mL胰島素的高糖DMEM完全培養(yǎng)液培養(yǎng)，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，換為高糖DMEM完全培養(yǎng)液維持培養(yǎng)，培養(yǎng)至第12 天，約90%細(xì)胞分化為成熟脂肪細(xì)胞，收集，PBS洗3次，加10%中性甲醛固定30 min，油紅O染料室溫下孵育15 min，脫色液(60%異丙醇)洗3次，倒置顯微下觀察細(xì)胞分化情況。

1.2.3 3T3-L1脂肪細(xì)胞胰島素抵抗模型的建立

3T3-L1脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化成功后，分別在高糖DMEM完全培養(yǎng)液(含1 μmol/L地塞米松)中繼續(xù)培養(yǎng)24、48、72 h，按照葡萄糖含量測(cè)定試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)細(xì)胞對(duì)葡萄糖攝取情況。

1.2.4 檉柳黃素對(duì)細(xì)胞Glu攝取量和細(xì)胞內(nèi)TG含量的測(cè)定

1.2.4.1 細(xì)胞對(duì)Glu攝取量測(cè)定

誘導(dǎo)成功后，將培養(yǎng)液換成含有1 μmol/L地塞米松的DMEM(高糖)完全培養(yǎng)基孵育24 h，使用含有1 μmol/L地塞米松的DMEM(高糖)完全培養(yǎng)基配制藥物并進(jìn)行細(xì)胞換液，孵育48 h，根據(jù)葡萄糖含量測(cè)定試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)細(xì)胞對(duì)葡萄糖攝取情況。

1.2.4.2 細(xì)胞內(nèi)TG含量測(cè)定[14]

按照“1.2.4.1”操作，根據(jù)甘油三酯含量測(cè)定試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定細(xì)胞內(nèi)甘油三酯含量。

1.2.5 qRT-PCR檢測(cè)AMPK信號(hào)通路相關(guān)基因的表達(dá)

1.2.5.1 抽提總RNA及cDNA的合成

細(xì)胞誘導(dǎo)成功后，在高糖DMEM完全培養(yǎng)液(含1 μmol/L地塞米松)中繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，使用含有1 μmol/L地塞米松的DMEM(高糖)完全培養(yǎng)液配制藥物，設(shè)置正常對(duì)照組、模型對(duì)照組、羅格列酮組及藥物組，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，用Trizol 法抽提細(xì)胞中的總RNA，測(cè)定總RNA濃度及OD在260 nm和280 nm的比值，按FastQuant cDNA第一鏈合成試劑盒說(shuō)明進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，合成cDNA。

1.2.5.2 引物設(shè)計(jì)及合成

根據(jù)NCBI公布的小鼠基因序列，設(shè)計(jì)上下游引物，引物序列見(jiàn)表1。

1.2.5.3 qRT-PCR

根據(jù)SuperReal PreMix Plus(SYBR Green)試劑盒說(shuō)明應(yīng)用于實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，采用2-△△CT方法計(jì)算各基因相對(duì)含量，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.6 檉柳黃素與AMPK信號(hào)通路相關(guān)蛋白分子對(duì)接

結(jié)合AMPK信號(hào)通路，在PDB數(shù)據(jù)庫(kù)(www.rcsb.org)中搜索相關(guān)蛋白，通過(guò)Discovery Studio 4.5軟件對(duì)靶蛋白進(jìn)行處理，使用Chembio 3D軟件構(gòu)建各化合物的三維結(jié)構(gòu)，導(dǎo)入Discovery Studio 4.5軟件。采用不同對(duì)接方法(CDOCKER、LibDock、LigandFit)將結(jié)晶復(fù)合物中小分子配體對(duì)接到蛋白結(jié)晶中，然后與原結(jié)晶復(fù)合物中的小分子進(jìn)行均方根偏差(RMSD)值比較，以此驗(yàn)證和選擇對(duì)接方法。

表1 AMPK信號(hào)通路相關(guān)基因引物序列

1.2.7 Western blot檢測(cè)AMPK信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)

誘導(dǎo)成功后，在高糖DMEM完全培養(yǎng)液(含1 μmol/L地塞米松)中繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，使用含有1 μmol/L地塞米松的DMEM(高糖)完全培養(yǎng)液配制藥物，設(shè)置正常組、模型組、陽(yáng)性對(duì)照組及藥物組，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，收集細(xì)胞，去培養(yǎng)液后用預(yù)冷的PBS沖洗3遍，加入配好的裂解液，刮下細(xì)胞后在EP管中冰上充分裂解30 min，期間渦旋3次。4 ℃下以12 000 rpm離心10 min，用BCA檢測(cè)試劑盒測(cè)蛋白質(zhì)濃度，樣品分別加5×緩沖液(稀釋成1×)，渦旋，99 ℃煮10 min，冷卻到室溫后-20 ℃保存。依次進(jìn)行SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉及抗體孵育、發(fā)光及顯影，采用Image J軟件對(duì)條帶進(jìn)行灰度分析，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.8 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果

2.1 MTT法檢測(cè)檉柳黃素對(duì)3T3-L1脂肪細(xì)胞存活的影響

隨著藥物濃度的增加，檉柳黃素對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用逐漸增強(qiáng)，通過(guò)計(jì)算，檉柳黃素IC50為33.79±13.60 μg/mL，結(jié)果見(jiàn)表2。

2.2 油紅O染色鑒定

誘導(dǎo)分化前3T3-L1細(xì)胞呈不規(guī)則梭形成纖維細(xì)胞形態(tài)，細(xì)胞內(nèi)無(wú)脂滴；誘導(dǎo)分化后細(xì)胞呈橢圓形、圓形，并分化為成熟脂肪細(xì)胞，細(xì)胞內(nèi)脂滴明顯，分布于細(xì)胞核周?chē)图tO染色后，脂滴呈紅色，鑒定結(jié)果見(jiàn)圖1。

表2 檉柳黃素對(duì)3T3-L1脂肪細(xì)胞存活的影響

圖1 T3-L1脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)前(A)和誘導(dǎo)后(B)顯微圖

2.3 3T3-L1脂肪細(xì)胞胰島素抵抗模型的建立

3T3-L1脂肪細(xì)胞的誘導(dǎo)分化成功后，在地塞米松中孵育48 h，模型組細(xì)胞對(duì)葡萄糖的攝取較正常對(duì)照組顯著降低(P<0.05)；在地塞米松中孵育72 h，模型組細(xì)胞對(duì)葡萄糖的攝取較正常對(duì)照組顯著降低(P<0.01)，表明誘導(dǎo)分化后3T3-L1脂肪細(xì)胞在地塞米松中孵育48～72 h后胰島素抵抗模型建立成功，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 3T3-L1脂肪細(xì)胞胰島素抵抗中的Glu攝取

注：與正常組比較，*P<0.05；**P<0.01。

Note:Compared with normal group,*P<0.05;**P<0.01.

2.4 細(xì)胞對(duì)Glu的攝取

與模型組比較，檉柳黃素低、高兩個(gè)劑量組均對(duì)3T3-L1脂肪細(xì)胞葡萄糖的攝取顯著增加(P<0.01)，表明檉柳黃素具有促進(jìn)3T3-L1脂肪細(xì)胞對(duì)Glu的攝取，結(jié)果見(jiàn)表4。

2.5 細(xì)胞內(nèi)TG的含量

與模型組比較，檉柳黃素高劑量組對(duì)3T3-L1脂肪細(xì)胞內(nèi)甘油三酯有顯著降低(P<0.05)，表明檉柳黃素具有降低3T3-L1脂肪細(xì)胞內(nèi)TG的作用，結(jié)果見(jiàn)表5。

2.6 qRT-PCR檢測(cè)AMPK信號(hào)通路相關(guān)基因的表達(dá)

與模型組比較，檉柳黃素顯著提高AMPK基因的表達(dá)(P<0.01)，以及顯著降低FAS基因的表達(dá)(P<0.05)，結(jié)果見(jiàn)表6和圖2。

2.7 檉柳黃素與AMPK信號(hào)通路相關(guān)蛋白分子對(duì)接

檉柳黃素與AMPK、FAS、PPARα和PKB蛋白均具有一定的分子對(duì)接結(jié)合能力，其中能與FAS蛋白上多個(gè)氨基酸殘基靶點(diǎn)結(jié)合，主要有范德華力、π鍵、氫鍵等結(jié)合鍵，表明檉柳黃素與FAS蛋白對(duì)接較好，檉柳黃素與FAS蛋白分子對(duì)接模擬圖見(jiàn)圖3。

表4 化合物對(duì)3T3-L1脂肪細(xì)胞Glu攝取的影響

注：與模型組比較，**P<0.01。

Note:Compared with modell group,**P<0.01.

表5 化合物對(duì)3T3-L1脂肪細(xì)胞內(nèi)TG含量的影響

注：與模型組比較，*P<0.05；**P<0.01。

Note:Compared with modell group,*P<0.05;**P<0.01.

表6 3T3-L1脂肪細(xì)胞AMPK信號(hào)通路相關(guān)基因的mRNA相對(duì)表達(dá)量

注：與模型組比較，*P<0.05；**P<0.01。

Note:Compared with model group,*P<0.05;**P<0.01.

圖2 檉柳黃素對(duì)AMPK信號(hào)通路相關(guān)基因的影響

圖3 檉柳黃素與FAS蛋白分子對(duì)接3D(A)和2D(B)模擬圖

圖4 檉柳黃素對(duì)AMPK信號(hào)通路相關(guān)蛋白的影響

2.8 Western blot檢測(cè)AMPK信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)

與模型組比較，檉柳黃素可增加磷酸化AMPK(P-AMPK)、磷酸化ACC(P-ACC)、磷酸化PKB(P-PKB)和PPARα蛋白的表達(dá)，可抑制FAS蛋白的表達(dá)，但無(wú)顯著性差異，結(jié)果見(jiàn)圖4、5和表7。

3 結(jié)論

檉柳黃素給予劑量增大到25 μg/mL時(shí)，細(xì)胞存活下降；油紅O染色法鑒定誘導(dǎo)分化前后3T3-L1脂肪細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞誘導(dǎo)分化后出現(xiàn)明顯的紅色脂滴；利用地塞米松孵育48～72 h后，模型細(xì)胞對(duì)葡萄糖的攝取量(或消耗量)明顯減少(P<0.01)，胰島素抵抗模型建立；藥效學(xué)研究考察發(fā)現(xiàn)檉柳黃素作用48 h后，細(xì)胞對(duì)Glu的攝取顯著增加(P<0.01)，細(xì)胞內(nèi)TG含量顯著降低(P<0.05或P<0.01)，說(shuō)明檉柳黃素具有一定的降糖調(diào)脂作用。

表7 3T3-L1前體細(xì)胞AMPK信號(hào)通路相關(guān)蛋白的相對(duì)表達(dá)量

圖5 檉柳黃素對(duì)AMPK信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)

AMPK是生物能量代謝調(diào)節(jié)的關(guān)鍵分子，是研究糖脂代謝紊亂及其他相關(guān)代謝疾病的核心，它表達(dá)于各種代謝相關(guān)器官中，能被機(jī)體各種刺激激活，對(duì)機(jī)體保持葡萄糖平衡起著重要的調(diào)節(jié)作用[15]。磷酸化的AMPK能開(kāi)啟GLUT4的基因表達(dá)，而GLUT4數(shù)量的增加，促進(jìn)了細(xì)胞對(duì)Glu的攝?。籄CC和FAS分別是脂肪酸合成的限速酶和合成酶，它們的表達(dá)影響著脂肪的含量，AMPK的活化能磷酸化ACC抑制其發(fā)揮作用，同時(shí)還通過(guò)抑制ACC基因的表達(dá)限制脂肪酸的合成[16]，激活A(yù)MPK導(dǎo)致SREBP-lc基因表達(dá)的降低，從而抑制FAS基因的表達(dá)，影響TG的生成[17]；Adiponectin能增加骨骼肌細(xì)胞脂肪酸氧化和糖吸收，可以激活A(yù)MPK，而Leptin參與糖、脂肪及能量代謝的調(diào)節(jié)，增加能量釋放，抑制脂肪細(xì)胞的合成[18]；IRS-1、IRS-2屬于胰島素底物受體，其表達(dá)水平的降低可導(dǎo)致胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)障礙進(jìn)而引發(fā)胰島素抵抗[19]；PKB表達(dá)的降低，會(huì)使胰島素信號(hào)傳遞受阻，導(dǎo)致葡萄糖攝取和糖原合成減少[20]；而PPARα的表達(dá)，增加脂肪酸氧化，減少細(xì)胞內(nèi)TG的含量。

在進(jìn)行檉柳黃素對(duì)3T3-L1脂肪細(xì)胞作用機(jī)制探討中，我們選擇AMPK信號(hào)通路主要相關(guān)基因和蛋白進(jìn)行研究，這些基因或因子直接或間接影響AMPK的表達(dá)，從而影響葡萄糖和脂肪水平。通過(guò)檉柳黃素對(duì)10個(gè)基因進(jìn)行qRT-PCR的研究，發(fā)現(xiàn)檉柳黃素顯著提高AMPK基因的表達(dá)(P<0.01)和顯著降低FAS基因的表達(dá)(P<0.05)，可見(jiàn)，檉柳黃素影響AMPK信號(hào)通路，對(duì)FAS基因的表達(dá)具有顯著抑制作用，從而影響TG的生成；在進(jìn)行Western blot研究前，將檉柳黃素與相關(guān)蛋白進(jìn)行分子對(duì)接，以此預(yù)測(cè)化合物與蛋白的結(jié)合能力[21,22]，其中檉柳黃素與FAS蛋白結(jié)合較好；Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示檉柳黃素均可增加磷酸化AMPK、磷酸化ACC、磷酸化PKB和PPARα蛋白和抑制FAS蛋白的表達(dá)，但無(wú)顯著性差異。

檉柳黃素作為槲皮素體內(nèi)的主要代謝產(chǎn)物，在對(duì)3T3-L1脂肪細(xì)胞胰島素抵抗的改善方面具有與槲皮素相似的作用。上述結(jié)果說(shuō)明，檉柳黃素具有增加3T3-L1脂肪細(xì)胞對(duì)Glu的攝取和降低細(xì)胞內(nèi)TG含量，其作用機(jī)制可能與AMPK信號(hào)通路中相關(guān)基因和蛋白表達(dá)有關(guān)，具體機(jī)制還需進(jìn)一步研究。該研究闡明了槲皮素體內(nèi)代謝產(chǎn)物檉柳黃素具有調(diào)節(jié)糖脂代謝紊亂的作用，為檉柳黃素降糖調(diào)脂方面的研究和開(kāi)發(fā)奠定了基礎(chǔ)。