唐 攀，陳 潔，晏 英,，胡嘉琪，徐 冉,，張吉泉,，湯 磊,*

1貴州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，貴陽(yáng) 550025；2貴州醫(yī)科大學(xué) 貴州省化學(xué)合成藥物研發(fā)利用工程技術(shù)研究中心，貴陽(yáng) 550004

徐長(zhǎng)卿Cynanchumpaniculatum(Bunge)Kitagawa為蘿摩科鵝絨藤屬多年生草本植物，其干燥根和根莖入藥，味辛、性溫，歸肝、腎經(jīng)，具有祛風(fēng)化濕、止痛止癢的功能，用于治療風(fēng)濕痹痛、胃痛脹滿、牙痛、腰痛、跌打傷痛、風(fēng)疹、濕疹等癥[1]。全世界約有蘿摩科植物180屬，2 200種，分布于世界熱帶、亞熱帶和少數(shù)溫帶地區(qū)。我國(guó)約有44屬、245種、33變種，分布于西南及東南部以及少數(shù)西北與東北各省區(qū)。其主要成分丹皮酚具有抗炎鎮(zhèn)痛、抗病毒、抗菌、抗蛇毒、免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、保護(hù)心血管等作用[2]。臨床應(yīng)用廣泛，已開(kāi)發(fā)的徐長(zhǎng)卿注射液用于鎮(zhèn)痛、消炎及類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎[3]，復(fù)方徐長(zhǎng)卿洗劑聯(lián)合西藥用于各型濕疹的臨床治療[4]，復(fù)方徐長(zhǎng)卿合劑作鼻腔沖洗，治療常年性變態(tài)性鼻炎[5]。研究發(fā)現(xiàn)，從徐長(zhǎng)卿中分離得到的一系列seco-pregnane類C21甾體化合物具有很強(qiáng)的抗煙草花葉病毒(TMV)活性，該類化合物能高選擇性地抑制TMV亞基因組RNA的表達(dá)，而對(duì)病毒基因組RNA沒(méi)有影響，同時(shí)，化合物還能明顯抑制TMV的長(zhǎng)距離移動(dòng)[6]，說(shuō)明該類C21甾體化合物對(duì)TMV新穎的作用機(jī)制為抗病毒制劑研究帶來(lái)新的機(jī)遇。為了繼續(xù)尋找具有抗TMV活性的化學(xué)成分，我們對(duì)黔產(chǎn)徐長(zhǎng)卿根莖的化學(xué)成分進(jìn)行了研究，并對(duì)化合物進(jìn)行了抗TMV活性測(cè)試。

1 儀器與材料

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(東京理化，N-1300D-WD)，Bruker AV-600 MHz 核磁共振儀(德國(guó)布魯克公司)；四甲基硅烷(TMS)為內(nèi)標(biāo)；Bruker HTC/Esquire 質(zhì)譜儀(德國(guó)布魯克公司)；高效液相色譜儀為Agilent 1200型(美國(guó)安捷倫科技司)；色譜柱Waters sunfire C18(10 × 150 mm，4.6 × 250 mm)(沃特世公司)；BP211D電子天平(Sartorouius公司)；高速冷凍離心機(jī)(2K15型，德國(guó)Sigma公司)，酶標(biāo)儀(美國(guó)BIOTEK公司)，Sephadex LH-20(三菱公司)；C18反相硅膠(日本 YMC 公司)；正相硅膠和薄層色譜板(青島海洋化工廠)；核磁用氘代試劑(美國(guó)CIL氘代試劑)；液相用水(娃哈哈純凈水20181109)；色譜級(jí)甲醇、乙腈(科密歐試劑公司)；化學(xué)實(shí)驗(yàn)用溶劑為工業(yè)重蒸溶劑，顯色劑為8%的硫酸乙醇溶液。

供試毒源：TMV(U1)普通株系，購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院武漢病毒研究所。保存于-20 ℃，臨用時(shí)取出用0.01 M PB稀釋至50 μg/mL。供試寄主：心葉煙(Nicotianaglutinosa)，為TMV枯斑寄主，普通煙K326(NicotianatabacumK326)，溫室中繁育，種子均購(gòu)于中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所。

樣品采自貴州省黔東南州，經(jīng)過(guò)貴陽(yáng)中醫(yī)學(xué)院孫慶文老師鑒定為徐長(zhǎng)卿Cynanchumpaniculatum，憑證標(biāo)本(XCQ201809)保存于貴州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)實(shí)驗(yàn)室。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 化合物提取與分離

干燥徐長(zhǎng)卿根莖50 kg，用90%的乙醇回流提取3次，提取溫度為每次時(shí)間為3 h，濃縮回收酒精得粗提物約10 kg，加水混溶成渾濁液體，分別用石油醚、乙酸乙酯等體積萃取3次，回收乙酸乙酯得浸膏2.130 kg。乙酸乙酯部分經(jīng)過(guò)硅膠柱層析，用石油醚/丙酮(30∶1→0∶1)快速梯度洗脫得到Fr1～Fr6 共6個(gè)部分，其中Fr2(56g)以石油醚醚/丙酮(10∶1～5∶1)梯度洗脫，分成3個(gè)亞部分Fr2-1～Fr2-3，F(xiàn)r2-1反復(fù)經(jīng)過(guò)通過(guò)凝膠柱層析(甲醇)得化合物11(51.7 mg)，F(xiàn)r2-2經(jīng)過(guò)凝膠柱層析(甲醇)后再通過(guò)硅膠柱層析以石油醚醚/丙酮(7∶1)洗脫得到化合物12(29.6 mg)和13(19.5 mg)；Fr3(130 g)再次以二氯甲烷/甲醇(30∶1～5∶1)梯度洗脫，分成4個(gè)亞部分，分別為Fr3-1～Fr3-4。其中 Fr3-2經(jīng)過(guò)反相柱層析洗脫(甲醇∶水= 75∶25)得化合物1(15mg)，再經(jīng)過(guò)硅膠柱層析(石油醚/丙酮=5∶1)及高效液相色譜色譜 HPLC分離(流動(dòng)相為甲醇∶水= 80∶20，流速為3 mL/min)得化合物3(12.2 mg)和4(9.8 mg)；Fr3-3通過(guò)凝膠柱層析(氯仿∶甲醇= 1∶1)得化合物2(23.1 mg)，F(xiàn)r3-4經(jīng)過(guò)反相柱層析洗脫(甲醇∶水= 65∶35)，再經(jīng)過(guò)高效液相色譜色譜HPLC制備分離(流動(dòng)相為甲醇∶水= 80%∶20%，流速為3 mL/min)得化合物7(15.3 mg)和8(7.2 mg)；Fr3-1通過(guò)凝膠柱層析(純甲醇)再經(jīng)過(guò)硅膠柱層析(石油醚/丙酮=8∶1)得化合物9(10.5 mg)；Fr4(310 g)經(jīng)過(guò)二氯甲烷/甲醇(30∶1→5∶1)梯度洗脫，再用反相硅膠柱層析(甲醇∶水= 60∶40)洗脫分成Fr4-1～Fr4-6部分，F(xiàn)r4-6再通過(guò)凝膠柱層析(純甲醇)及高效液相色譜(流動(dòng)相為甲醇∶水=75∶25，流速為3 mL/min)制備分離純化，得到化合物5(11.9 mg)；Fr4-5再經(jīng)過(guò)高效液相色譜(流動(dòng)相為甲醇∶水=75∶25，流速為3 mL/min)制備分離純化得到化合物6(6.8 mg)和10(16.7 mg)。

2.2 化合物活性篩選

2.2.1 化合物對(duì)TMV的鈍化作用實(shí)驗(yàn)

挑選健康長(zhǎng)勢(shì)一致的5～6葉期的心葉煙，暗室放置一夜。將供試化合物與50 μg/mL的TMV 1∶1(V∶V)混合至所需濃度，混勻放置0.5 h。每棵煙挑選大小相似的4～6片葉子，每片葉子的一半摩擦接種化合物與TMV的混合溶液100 μL作為處理；另一半摩擦接種50 μg/mL TMV100 μL作為陽(yáng)性對(duì)照；摩擦接種相應(yīng)濃度DMSO溶液的葉片作為空白。2 h后用無(wú)菌水將葉表面的金剛砂洗凈。放入無(wú)蟲溫室中，3～4天后按公式計(jì)算TMV抑制率=[1-(處理的平均枯斑數(shù)/陽(yáng)性對(duì)照的平均枯斑數(shù))]×100%[7]，每個(gè)化合物重復(fù)三次。

2.2.2 化合物對(duì)煙草的保護(hù)作用實(shí)驗(yàn)

挑選健康長(zhǎng)勢(shì)一致的5～6葉期的心葉煙，暗室放置一夜。每棵煙挑選大小相似的4～6片葉子，供試化合物用無(wú)菌水稀釋為所需濃度，每片葉子的一半均勻施藥100 μL作為處理，24 h后每片葉子摩擦接種50 μg/mL TMV 200 μL，未施藥的一半作為陽(yáng)性對(duì)照，未施藥且摩擦接種相應(yīng)濃度DMSO溶液的葉片作為空白。2 h后用無(wú)菌水將葉表面的金剛砂洗凈。放入無(wú)蟲溫室中，3～4天后按公式計(jì)算TMV抑制率=[1-(處理的平均枯斑數(shù)/陽(yáng)性對(duì)照的平均枯斑數(shù))]×100%，每個(gè)化合物重復(fù)三次。

2.2.3 化合物對(duì)煙草的治療作用實(shí)驗(yàn)

挑選健康長(zhǎng)勢(shì)一致的5～6葉期的心葉煙，暗室放置一夜。每棵煙挑選大小相似的4～6片葉子摩擦接種50 μg/mL TMV 200 μL，2h后每片葉子的一半均勻施藥100 μL作為處理；另一半作為陽(yáng)性對(duì)照；未施藥且摩擦接種相應(yīng)濃度DMSO溶液的葉片作為空白。2 h后用無(wú)菌水將葉表面的金剛砂洗凈。放入無(wú)蟲溫室中，3～4天后按公式計(jì)算TMV抑制率=[1-(處理的平均枯斑數(shù)/陽(yáng)性對(duì)照的平均枯斑數(shù))]×100%，每個(gè)化合物重復(fù)三次。

2.2.4 離體葉圓片法

挑選健康合適的普通煙，暗室放置一夜。每棵煙挑選大小相似的3片葉子，每片葉子摩擦接種0.032 μg/μL TMV 200 μL，10 min后用無(wú)菌水沖洗干凈。6 h后將葉片切成直徑1 cm的圓片，取20片浸入供試化合物溶液中作為處理；另20片浸入25 μL/mL DMSO溶液中作為陽(yáng)性對(duì)照；只摩擦未接種的20片浸入25 μL/mL DMSO溶液中作為空白。放入28 ℃光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，48 h后進(jìn)行TAS-ELISA，測(cè)定OD405值，根據(jù)TMV病毒標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算TMV濃度，按公式計(jì)算TMV抑制率=[1-(處理的TMV濃度/陽(yáng)性對(duì)照的TMV濃度)]×100%[8]，每個(gè)化合物重復(fù)三次。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1白色粉末；ESI-MS：m/z399[M +Na]+，確定分子質(zhì)量376；分子式C21H28O6；1H NMR(600 MHz，CDCl3)δ：6.28(1H，s，H-18)，5.46(1H，d，J= 6.0 Hz，H-6)，5.33(1H，m，H-16)，4.17(1H，t，J= 6.0 Hz，H-15β)，3.86(1H，t，J= 6.0 Hz，H-15α)，3.71(1H，m，H-2)，3.45(1H，d，J= 6.0 Hz，H-17)，3.34(1H，m，H-3)，2.62(1H，m，H-11α)，2.59(2H，m，H-7)，2.44(1H，m，H-8)，2.28(1H，t，J= 11.2 Hz，H-1α)，2.12(2H，m，H-4)，2.06(1H，m，H-12α)，1.55(1H，s，H-21)，1.36(1H，m，H-11β)，1.27(1H，m，H-9)，1.25(1H，m，H-12β)，1.08(1H，t，J= 11.2Hz，H-1β)，0.97(1H，m，H-19)；13C NMR(150 MHz，CDCl3)δ：175.4(C-14)，143.4(C-18)，138.8(C-5)，121.0(C-6)，118.2(C-20)，113.8(C-13)，76.1(C-16)，75.1(C-2)，72.2(C-3)，67.3(C-15)，55.7(C-17)，52.5(C-9)，44.1(C-1)，39.9(C-8)，39.9(C-10)，38.8(C-4)，29.7(C-12)，27.9(C-7)，24.6(C-21)，23.6(C-11)，19.1(C-19)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[9]報(bào)道基本一致，故鑒定化合物1為glaucogenin A。

化合物2白色粉末；ESI-MS：m/z543[M +Na]+，確定分子質(zhì)量520；分子式C28H40O9；1H NMR(600 MHz，CDCl3)δ：6.29(1H，s，H-18)，5.44(1H，d，J= 6.0 Hz，H-6)，5.34(1H，m，H-16)，4.57(1H，dd，J= 1.8，12.0 Hz，H-1′)，4.17(1H，t，J= 6.0 Hz，H-15β)，3.86(1H，t，J= 6.0 Hz，H-15α)，3.73(1H，m，H-2)，3.45(1H，m，H-4′)，3.42(1H，s，H-6′-OCH3)，3.40(1H，m，H-17)，3.30(1H，m，H-3)，3.23(1H，m，H-5′)，3.20(1H，m，H-3′)，2.53(1H，m，H-11α)，2.48(1H，m，H-8)，2.40(1H，m，H-7α)，2.34(1H，m，H-4β)，2.34(1H，m，H-2′α)，2.29(1H，m，H-4α)，2.27(1H，m，H-12α)，2.06(1H，m，H-7β)，2.04(1H，m，H-1α)，1.55(1H，s，H-21)，1.53(1H，m，H-2′β)，1.38(1H，d，J= 6.0 Hz，H-6′)，1.28(1H，m，H-11β)，1.26(1H，m，H-12β)，1.24(1H，t，J= 6.0 Hz，H-9)，1.03(1H，m，H-1β)，0.97(1H，m，H-19)；13C NMR(150 MHz，CDCl3)δ：175.4(C-14)，143.5(C-18)，139.0(C-5)，120.8(C-6)，118.1(C-20)，113.7(C-13)，99.9(C-1′)，86.8(C-3)，80.5(C-4′)，75.2(C-16)，75.2(C-3′)，71.9(C-2)，69.7(C-5′)，67.5(C-15)，56.4(C-17)，55.7(C-7′)，52.6(C-9)，43.8(C-1)，39.9(C-8)，39.2(C-10)，37.4(C-4)，35.5(C-2′)，29.7(C-12)，28.0(C-7)，24.6(C-21)，23.6(C-11)，18.9(C-6′)，17.7(C-19)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[10]報(bào)道基本一致，故鑒定化合物2為glaucogenin A 3-O-β-D-cymaropyranoside。

化合物3白色粉末；ESI-MS：m/z467[M +Na]+，確定分子質(zhì)量444；分子式C27H28N2O4；1H NMR(600 MHz，CDCl3)δ：7.74(2H，d，J= 6.0 Hz，H-2′，H-6′)，7.56(1H，t，J= 7.2 Hz，H-4′)，7.47(2H，t，J= 7.6 Hz，H-3′，H-5′)，7.32～7.08(10H，m)，6.84(1H，d，J= 8.4 Hz，H-5)，6.12(1H，d，J= 9.6 Hz，H-5)，4.81(1H，m，H-7)，4.37(1H，m，H-4)，3.96(1H，dd，J= 12.0，4.8 Hz，H-3β)，3.84(1H，dd，J= 12.0，4.8 Hz，H-3α)，3.23(1H，dd，J= 12.0，6.0 Hz，H-10β)，3.08(1H，dd，J= 12.0，6.0 Hz，H-10α)，2.75(2H，m，H-11)，2.05(3H，s，1-H-OCH3)；13C NMR(600 MHz，CDCl3)δ：170.8(C-2)，170.3(C-6)，167.1(C-9)，136.7(C-1′′)，136.7(C-1′′′)，133.7(C-1′)，131.9(C-4′)，129.3(C-3′′)，129.3(C-5′′)，129.3(C-3′)，129.3(C-5′)，129.1(C-3′′′)，129.1(C-5′′′)，128.8(C-2′′)，128.8(C-6′′)，128.7(C-2′)，128.7(C-6′)，128.6(C-2′′′)，128.6(C-6′′′)，127.1(C-4′′)，126.8(C-4′′′)，64.6(C-3)，55.0(C-7)，49.4(C-4)，38.5(C-10)，37.4(C-10)，20.8(C-1)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[11]報(bào)道基本一致，故鑒定化合物3為N-(N-benzoyl-S-phenylalaninyl)-S-phenylalaninol acetate。

化合物4白色粉末；ESI-MS：m/z529[M +Na]+，確定分子質(zhì)量506；分子式C32H30N2O4；1H NMR(600 MHz，CDCl3)δ：7.73(1H，d，J= 9.0 Hz，H-2′)，7.73(1H，d，J= 9.0 Hz，H-6′)，7.69(1H，d，J= 9.0 Hz，H-2′′′′)，7.69(1H，d，J= 9.0 Hz，H-6′′′′)，7.54(1H，t，J= 6.0 Hz，H-4′′′′)，7.46～7.23(15H，m)，6.69(1H，d，J= 9.6 Hz，H-4)，6.56(1H，d，J= 7.2 Hz，H-7)，4.96(1H，q，J= 7.2 Hz，H-6)，4.64(1H，m，H-3)，4.08(1H，dd，J= 1.8，9.6 Hz，H-2)，3.34(1H，dd，J= 9.0，14.4 Hz，H-10)；13C NMR(150 MHz，CDCl3)δ：171.9(C-5)，167.4(C-8)，167.2(C-1)，137.2(C-1′′′)，135.8(C-1′′)，134.2(C-1′)，133.3(C-1′′′′)，132.0(C-4′′′′)，131.4(C-4′)，129.3(C-3′′)，129.3(C-5′′)，129.2(C-3′′′)，129.2(C-5′′′)，128.9(C-2′′)，128.9(C-6′′)，128.7(C-2′′′′)，128.7(C-6′′′′)，128.7(C-2′′′)，128.7(C-6′′′)，128.4(C-2′)，128.4(C-6′)，127.4(C-4′′)，127.1(C-3′)，127.1(C-5′)，127.1(C-3′′′′)，127.1(C-5′′′′)，126.8(C-4′′′)，65.4(C-2)，54.5(C-6)，50.3(C-3)，37.5(C-9)，37.3(C-10)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[12]報(bào)道基本一致，故鑒定化合物4為N-(N-benzoyl-S-phenylalaninyl)-S-phenylalaninol benzoate。

化合物5白色粉末；ESI-MS：m/z307[M +Na]+，確定分子質(zhì)量284；分子式C19H24O2；1H NMR(600 MHz，CDCl3)δ：6.20(1H，s，H-6)，6.20(1H，s，H-7)，5.71(1H，s，H-4)，2.48(1H，m，H-2β)，2.46(1H，m，H-16β)，2.38(1H，m，H-2α)，2.15(1H，m，H-12β)，2.12(1H，m，H-16α)，2.03(1H，m，H-1β)，2.02(1H，m，H-15α)，1.89(1H，m，H-8)，1.74(1H，m，H-12α)，1.72(1H，m，H-1α)，1.71(1H，m，H-15β)，1.70(1H，m，H-11α)，1.53(1H，m，H-14)，1.47(1H，m，H-11β)，1.33(1H，m，H-9)，1.16(1H，s，H-19)，0.98(1H，s，H-18)；13C NMR(150 MHz，CDCl3)δ：219.5(C-17)，199.4(C-3)，162.9(C-5)，138.4(C-7)，128.8(C-6)，124.2(C-4)，50.8(C-14)，48.7(C-9)，48.3(C-13)，37.0(C-10)，36.1(C-8)，35.6(C-16)，33.9(C-1)，33.9(C-1)，31.3(C-12)，21.4(C-15)，20.0(C-11)，16.3(C-19)，13.7(C-18)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[13]報(bào)道基本一致，故鑒定化合物5為androst-4,6-dien-3,17-dione。

化合物6白色粉末；ESI-MS：m/z337[M +Na]+，確定分子質(zhì)量314；分子式C21H30O2；1H NMR(600 MHz，CDCl3)δ：6.14(1H，dd，J= 9.8，2.6 Hz，H-6)，6.12(1H，d，J= 9.8 Hz，H-7)，5.69(1H，s，H-4)，3.77(1H，m，H-20)，2.45(1H，m，H-2β)，2.36(1H，m，H-2α)，2.25(1H，m，H-12β)，2.05(1H，m，H-1β)，2.03(1H，m，H-15α)，2.02(1H，m，H-16α)，1.76(1H，m，H-8)，1.74(1H，m，H-12α)，1.72(1H，m，H-11α)，1.70(1H，m，H-1α)，1.68(1H，m，H-15β)，1.67(1H，m，H-16β)，1.53(1H，m，H-14)，1.47(1H，m，H-11β)，1.32(1H，m，H-9)，1.27(1H，d，J= 6.0 Hz，H-20)，1.16(3H，s，H-19)，0.98(3H，s，H-18)；13C NMR(150 MHz，CDCl3)δ：199.6(C-3)，163.8(C-5)，141.2(C-7)，128.0(C-6)，123.6(C-4)，70.0(C-20)，58.1(C-14)，53.9(C-17)，50.7(C-9)，42.7(C-13)，38.6(C-12)，37.3(C-8)，36.1(C-10)，34.0(C-1)，33.9(C-2)，25.5(C-16)，23.6(C-15)，23.6(C-21)，20.4(C-11)，16.3(C-19)，12.5(C-18)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[14]報(bào)道基本一致，故鑒定化合物6為20-hydroxy-4,6-diene-gestrol-3-one。

化合物7黃色粉末；ESI-MS：m/z307[M +Na]+，確定分子質(zhì)量284；分子式C16H12O5；1H NMR(600 MHz，CDCl3)δ：13.03(1H，s，5-OH)，7.92(2H，m，H-2′，6′)，7.58(3H，m，H-3′，4′，5′)，6.68(1H，s，H-8)，6.63(1H，s，H-3)，4.09(3H，s，OCH3-6)；13C NMR(CDCl3，150 MHz)δ：183.0(C-4)，164.1(C-2)，155.2(C-7)，153.3(C-5)，152.1(C-9)，131.9(C-4′)，130.4(C-1′)，130.4(C-6)，129.1(C-3′)，129.1(C-5′)，126.3(C-2′)，126.3(C-6′)，105.9(C-3)，105.3(C-10)，93.4(C-8)，60.9(OCH3-6)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[15]報(bào)道基本一致，故鑒定化合物7為5,7-dihydroxy-6-methoxyflavone。

化合物8黃色粉末；ESI-MS：m/z307[M +Na]+，確定分子質(zhì)量284；分子式C16H12O5；1H NMR(600 MHz，CDCl3)δ：12.52(1H，s，OH-5)，7.92(1H，m，H-2′，6′)，7.59(1H，m，H-3′，4′，5′)，6.72(1H，s，H-3)，6.48(1H，s，H-6)，4.07(1H，s，OCH3-6)；13C NMR(150 MHz，CDCl3)δ：182.5(C-4)，163.5(C-2)，157.8(C-7)，155.3(C-5)，148.9(C-9)，132.0(C-4′)，131.3(C-1′)，129.3(C-3′)，129.3(C-5′)，126.9(C-8)，126.2(C-2′)，126.2(C-6′)，105.3(C-3)，105.3(C-10)，98.9(C-6)，62.1(OCH3-8)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[16]報(bào)道基本一致，故鑒定化合物8為5,7-dihydroxy-8-methoxyflavone。

化合物9無(wú)色粉末；ESI-MS：m/z218[M +Na]+，確定分子質(zhì)量195；分子式C11H17NO2；1H NMR(600 MHz，CDCl3)δ：9.66(1H，s，H-2-CHO)，6.96(1H，d，J= 4.8 Hz，H-3)，6.26(1H，d，J= 4.8 Hz，H-4)，4.40(2H，m，H-1′)，3.67(3H，s，H-6)，1.61(2H，m，H-2′)，1.60(2H，m，H-3′)，1.36(3H，s，H-4′)，1.31(3H，s，H-5′)；13C NMR(150 MHz，CDCl3)δ：179.3(C-1)，135.2(C-2)，131.5(C-5)，125.0(C-3)，109.7(C-4)，51.7(C-6)，48.0(C-1′)，34.9(C-2′)，30.2(C-4′)，26.4(C-3′)，23.4(C-5′)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[17]報(bào)道基本一致，故鑒定化合物31為5-(hydroxymethyl)-1-isopentyl-1H-pyrrole-2-carbaldehyde。

化合物10白色粉末；ESI-MS：m/z207[M +Na]+，確定分子質(zhì)量184；分子式C10H16O3；1H NMR(600 MHz，CDCl3)δ：6.91(1H，t，J= 6.0 Hz，H-3)，5.91(1H，q，J= 6.0 Hz)，5.27(1H，d，J= 18.0 Hz，H-8α)，5.12(1H，d，J= 12.0 Hz，H-8β)，2.26(2H，m，H-4)，1.83(3H，s，H-9)，1.67(2H，m，H-5)，1.33(3H，s，H-10)；13C NMR(150 MHz，CDCl3)δ：173.1(C-1)，144.7(C-7)，144.3(C-8)，127.2(C-2)，112.4(C-3)，73.2(C-6)，40.4(C-5)，27.9(C-10)，23.7(C-4)，12.0(C-9)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[18]報(bào)道基本一致，故鑒定化合物10為mono-terpenes。

化合物11白色粉末；ESI-MS：m/z247[M +Na]+，確定分子質(zhì)量224；分子式C11H12O5；1H NMR(600 MHz，DMSO-d6)δ：12.12(1H，s，H-3′-COOH)，8.86(1H，s，3-OH)，7.51(1H，d，J= 18.0 Hz，H-1′)，6.99(2H，s，H-1)，6.99(2H，s，H-5)，6.43(1H，d，J= 18.0 Hz，H-2′)，3.82(3H，s，H-2-OCH3)，3.82(3H，s，H-4-OCH3)；13C NMR(150 MHz，DMSO-d6)δ：168.0(C-3′)，148.0(C-2)，148.0(C-4)，144.8(C-1′)，138.0(C-3)，124.6(C-6)，116.1(C-2′)，106.1(C-1)，106.1(C-5)，56.1(OCH3-2)，56.1(OCH3-4)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[19]報(bào)道基本一致，故鑒定化合物11為4-hydroxy-3,5-dimethoxybenzoic acid。

化合物12白色粉末；ESI-MS：m/z265[M +Na]+，確定分子質(zhì)量242；分子式C12H18O5；1H NMR(600 MHz，DMSO-d6)δ：6.51(2H，s，H-2，6)，3.91(6H，s，H-3，5-OCH3)，3.80(1H，m，H-8)，3.75(1H，d，J= 8.4 Hz，H-7)，3.24(3H，s，7-H-OCH3)，0.97(d，J= 6.6 Hz，H-9)；13C-NMR(125 MHz，DMSO-d6)δ：147.1(C-3，5)，134.6(C-4)，129.5(C-1)，104.3(C-2)，104.3(C-6)，89.3(C-7)，71.5(C-8)，56.6(OCH3-7)，56.3(OCH3-3)，56.3(OCH3-5)，18.1(C-9)。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[20]報(bào)道基本一致，故可鑒定化合物12為pavonisol。

化合物13白色粉末；ESI-MS：m/z221[M+Na]+，確定分子質(zhì)量198；分子式C9H10O5；1H NMR(600 MHz，DMSO-d6)δ：7.40(2H，s，H-2，6)，3.97(6H，s，H-3，5-OCH3)；13C NMR(150 MHz，DMSO-d6)δ：170.6(C=O)，146.7(C-3)，146.7(C-5)，140.0(C-1)，120.0(C-4)，107.4(C-2)，107.4(C-6)，56.5(OCH3-3)，56.5(OCH3-5)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[21]報(bào)道基本一致，故鑒定化合物13為4-hydroxy-3,5-dimethoxy-benzoic acid。

3.2 抗煙草花葉病毒活性結(jié)果

采用2.2的三種半葉枯斑法和離體葉圓片法對(duì)分離得到的化合物1～10進(jìn)行抗TMV活性測(cè)試，以寧南霉素作為陽(yáng)性對(duì)照藥物。測(cè)試結(jié)果見(jiàn)表1。從活性結(jié)果來(lái)看，化合物1～4和9均有鈍化的抗TMV活性，但是化合物1～3均不具有保護(hù)活性，說(shuō)明化合物1～3的抗TMV活性不是由植物系統(tǒng)獲得抗性產(chǎn)生?；衔?具有保護(hù)活性，說(shuō)明其抗TMV活性除了作用于TMV病毒外，還由植物系統(tǒng)獲得抗性產(chǎn)生。以上化合物活性均與離體葉圓片法活性相同，并首次發(fā)現(xiàn)化合物3、4、9具有抗TMV活性。

表1 化合物1～10的抗TMV活性結(jié)果

注：寧南霉素為陽(yáng)性對(duì)照藥物，a50 μg/mL，b50 μg/mL，c200 μg/mL，d200 μg/mL。

Note:Ningnanmycin was used as positive control drug,a50 μg/mL,b50 μg/mL,c200μg/mL,d200 μg/mL.

4 結(jié)論

通過(guò)應(yīng)用多種色譜方法從蘿藦科植物徐長(zhǎng)卿根莖的乙醇提取物中分離得到 13個(gè)單體化合物，化合物2～5和7～10為首次從該植物中分離得到。對(duì)化合物1～10進(jìn)行抗TMV活性測(cè)試，從活性結(jié)果來(lái)看，化合物1～4和9均有鈍化的抗TMV活性，且化合物4具有保護(hù)活性，說(shuō)明化合物4抗TMV活性除了作用于TMV病毒外，還由植物系統(tǒng)獲得抗性產(chǎn)生。除了seco-pregnane類C21甾體化合物外，首次發(fā)現(xiàn)化合物3、4、9具有抗TMV活性，豐富抗TMV化合物結(jié)構(gòu)的多樣性。本研究成果豐富了徐長(zhǎng)卿根莖中的化學(xué)成分及生物活性內(nèi)容，為其進(jìn)一步的研究開(kāi)發(fā)提供參考資料。