汪 亮，丁良梅，劉 娣*

（1.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 畜牧研究所，哈爾濱 150086；2.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 博士后工作站，哈爾濱 150086）

環(huán)境溫度是影響生豬生長、繁殖的重要限制性因素之一。在低溫環(huán)境下，豬只經(jīng)常會(huì)發(fā)生低溫病，導(dǎo)致仔豬死亡、母豬生長緩慢，進(jìn)而影響生豬生產(chǎn)［1］。民豬是在我國東北地區(qū)培育的能夠適應(yīng)寒冷環(huán)境的地方優(yōu)秀豬種［2］，研究民豬抗寒的分子機(jī)制及其遺傳方式對(duì)于挖掘其優(yōu)秀的遺傳特性、促進(jìn)優(yōu)良基因利用和推動(dòng)生豬生產(chǎn)具有重要意義。

表觀遺傳學(xué)是指不通過DNA序列的改變，而是通過DNA甲基化、染色體構(gòu)象變化等方式將親代對(duì)環(huán)境的反應(yīng)傳遞給后代，使后代獲得對(duì)類似環(huán)境的適應(yīng)性［3］的一種遺傳方式。精子是雄性個(gè)體向后代傳遞遺傳信息的唯一渠道，而睪丸支持細(xì)胞（sertoli cells，ST）是構(gòu)成曲細(xì)精管的唯一體細(xì)胞，為精子發(fā)育提供環(huán)境條件［4-5］。因此，ST細(xì)胞中的基因表達(dá)差異會(huì)影響精子發(fā)生，并進(jìn)一步通過受精作用影響后代表型［6］。

DNA甲基轉(zhuǎn)移酶3B（DNA methyltransferase 3B，DNMT3B）可以通過在基因組CpG二核苷酸胞嘧啶的第5位碳原子上加一個(gè)甲基改變基因組甲基化狀態(tài)，以此抑制或關(guān)閉基因的表達(dá)，發(fā)揮調(diào)節(jié)作用［7-9］。前期研究表明，環(huán)境溫度的改變會(huì)明顯改變ST細(xì)胞中的DNMT3B基因的表達(dá)，進(jìn)一步研究其對(duì)ST細(xì)胞遷移和下游基因的影響，特別是對(duì)組蛋白相關(guān)基因、熱應(yīng)激相關(guān)基因和細(xì)胞增殖凋亡相關(guān)基因的影響，對(duì)人們了解該基因?qū)影l(fā)育環(huán)境的影響及精子傳遞是否與民豬抗寒性狀相關(guān)具有重要意義。

1 材料

1.1 試驗(yàn)細(xì)胞

ST細(xì)胞，購自通派（上海）生物科技有限公司。

1.2 主要試劑及儀器

RNAiso Plus（9109，TaKaRa）、反轉(zhuǎn)錄試劑盒（RR047A，TaKaRa），購自哈爾濱寶士德生物科技有限公司；熒光定量試劑 UltraSYBR Mixture（01170／30105），購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；胎牛血清（FBS，A6806-31 NQBB），澳大利亞產(chǎn)；DMEM／F-12培養(yǎng)基（10092007，CORNING），美國產(chǎn)；Annexin V-FITC／PI，購自上海翊圣生物科技有限公司；PCR儀（TC-512），購自德國Biometro公司；電泳儀（DYY-12C），購自北京市六一儀器廠；凝膠成像系統(tǒng)（HR-7752），購自美國BIO-RAD公司；熒光定量PCR儀（Stepone），購自美國Applied Biosystems公司；二氧化碳培養(yǎng)箱（CB150），購自德國BINDER公司。

2 方法

2.1 DNMT3B真核表達(dá)載體的構(gòu)建

2.1.1 ST細(xì)胞總RNA提取及反轉(zhuǎn)錄 采用TRIzol法提取對(duì)數(shù)期細(xì)胞總RNA，測定總RNA濃度和純度，按TaKaRa反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書操作。

1）基因組DNA除去反應(yīng)體系：5×gDNA Eraser Buffer 2μL，gDNA Eraser 1μL，模板RNA 1μg，加RNase Free Water至10μL。PCR反應(yīng)條件：42℃2 min，16℃2 min。

2）逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系的配制及反應(yīng)體系：RT Primer Mix 1μL，5×PrimeScript Buffer 2 4μL，PrimeScript RT Enzyme MixⅠ1μL，RNase Free Water 4μL，加入步驟1）反應(yīng)液10μL。PCR反應(yīng)條件：42℃15 min，84℃5 s，16℃1 min。獲得cDNA，于-20℃保存，用于后續(xù)試驗(yàn)。

2.1.2 DNMT3B基因的克隆測序 在NCBI中檢索豬DNMT3B（NM_001348900.1）的CDS序列信息。利用Primer5.0軟件分別設(shè)計(jì)上、下游引物，引物序列見表1。

表1 DNMT3B基因CDS區(qū)擴(kuò)增引物序列

以2.1.1中得到的cDNA為模板，利用表1的引物擴(kuò)增獲取DNMT3B基因cDNA全長編碼區(qū)序列。PCR擴(kuò)增體系：2×Taq Master Mix 10μL，10μmol／L上下游引物各0.5μL，模板1μL，ddH2O補(bǔ)至20μL。降落PCR擴(kuò)增程序：94℃5 min；94℃30 s，63℃30 s，72℃2 min，26個(gè)循環(huán)；94℃30 s，50℃30 s，72℃2 min，20個(gè)循環(huán)；72℃5 min；16℃1 min。以10 000 bp Marker作為參照，取6μL PCR產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測。參照北京全式金生物公司試劑盒（EasyPure Quick Gel Extraction Kit，貨號(hào)為EG101-01）說明書操作，純化回收上述PCR產(chǎn)物，連接到pGM-T Vector（TIANGEN），構(gòu)建pGM-T-DNMT3B質(zhì)粒。連接體系：10×T4 DNA ligase Buffer 1μL，T4 DNA ligase 1μL，pGM-T載體1μL，目的基因膠回收產(chǎn)物4μL，ddH2O 3μL，在PCR儀中16℃過夜連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，挑取單克隆，經(jīng)菌液PCR鑒定后，選取陽性克隆送至北京擎科生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測序，測序結(jié)果用DNAMan、Premier 5.0等軟件進(jìn)行分析。

2.1.3 pcDNA3.1-DNMT3B真核表達(dá)載體的構(gòu)建 擴(kuò)大培養(yǎng)測序正確的單克隆菌液，按照TIANGEN質(zhì)粒小提試劑盒說明書提取pGM-T-DNMT3B質(zhì)粒，利用HindⅢ和EcoRⅠ兩種限制性內(nèi)切酶對(duì)pGM-T-DNMT3B重組質(zhì)粒及pcDNA3.1（＋）進(jìn)行雙酶切，反應(yīng)體系：HindⅢ0.5μL；EcoRⅠ0.5μL；10×Buffer 1μL；Plasmid 1μL；ddH2O 7μL。反應(yīng)條件：37℃10 min。經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后回收酶切后含DNMT3B基因產(chǎn)物及pcDNA3.1（＋）載體酶切后產(chǎn)物。兩者通過T4連接酶16℃過夜連接，經(jīng)轉(zhuǎn)化、涂板，單克隆鑒定陽性菌落（方法同2.1.2），最終獲得pcDNA3.1-DNMT3B真核表達(dá)載體。

2.2 細(xì)胞劃痕法測定DNMT3B基因過表達(dá)對(duì)細(xì)胞遷移的影響

將對(duì)數(shù)生長期ST細(xì)胞調(diào)整為細(xì)胞密度約10×105個(gè)／mL，接種于60 mm細(xì)胞培養(yǎng)皿中。次日將構(gòu)建的綠色熒光蛋白真核表達(dá)載體pEGFP-N1空質(zhì)粒、pcDNA3.1（＋）空質(zhì)粒組、pcDNA3.1-DNMT3B重組質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染到ST細(xì)胞中（轉(zhuǎn)染步驟按照Lipofectamine 2000說明書進(jìn)行）。24 h后將轉(zhuǎn)染綠色熒光蛋白真核表達(dá)載體pEGFP-N1空質(zhì)粒的細(xì)胞倒置于熒光顯微鏡下觀察，確定轉(zhuǎn)染效率；同時(shí)將轉(zhuǎn)染pcDNA3.1（＋）空質(zhì)粒組及pcDNA3.1-DNMT3B重組質(zhì)粒的ST細(xì)胞按5×104個(gè)／孔的密度接種于35 mm細(xì)胞培養(yǎng)皿，每組分別設(shè)3個(gè)重復(fù)。當(dāng)培養(yǎng)皿底部被單層細(xì)胞覆蓋時(shí)進(jìn)行細(xì)胞劃痕試驗(yàn)，步驟如下：用10μL無菌槍頭在單層細(xì)胞表面輕輕劃兩條平行直線，用DPBS緩沖液輕輕沖洗脫落下來的細(xì)胞2次，向培養(yǎng)皿中加入含1%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，放置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中。細(xì)胞劃痕后分別在第0，24，48，72小時(shí)檢測細(xì)胞遷移情況，用倒置顯微鏡在同一視野50倍鏡下對(duì)劃痕拍照。采用Motic Image 2000 1.3軟件測量不同時(shí)間點(diǎn)各組劃痕寬度，0小時(shí)記為S0，t小時(shí)記為St，將對(duì)照組細(xì)胞相對(duì)遷移速率設(shè)為1，各試驗(yàn)組細(xì)胞相對(duì)遷移速率為遷移距離與對(duì)照組遷移距離的比值。

2.3 DNMT3B基因過表達(dá)對(duì)下游基因表達(dá)的影響

2.3.1 定量引物設(shè)計(jì)及DNMT3B基因在ST細(xì)胞中的過表達(dá) 將pcDNA3.1-DNMT3B重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到對(duì)數(shù)生長期的ST細(xì)胞中，以pcDNA 3.1（＋）質(zhì)粒為對(duì)照組（轉(zhuǎn)染步驟按照Lipofectamine 2000說明書進(jìn)行），參照Real-time PCR引物設(shè)計(jì)原則，分別設(shè)計(jì)豬cDNA中DNMT3A、DNMT3B、常染色質(zhì)組蛋白賴氨酸N-甲基轉(zhuǎn)移酶2（Euchomatic hiST 細(xì) 胞 onelisine N-methyltransferase 2，EHMT2）、組蛋白脫乙酰酶1（histone deacetylase 1，HDAC1）、血紅素加氧酶1（heme oxygenase 1，HMOX1）、熱休克轉(zhuǎn)錄因子1（heat shock transcription factor 1，HSF1）、熱休克蛋白70（heat shock protein 70，HSP70）、熱休克蛋白90（heat shock protein 90，HSP90）、熱休克蛋白1［heat shock protein family B（small）member 1，HSPB1］、tRNA-天冬氨酸甲基化酶（tRNA aspartic acid methyltransferase 1，TRDMT1）、CSD結(jié)構(gòu)域的E1蛋白（cold shock domain containing E1，CSDE1）、特異性促凋亡因子DNA損傷誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄蛋白3（DNA damage inducible transcript 3，DDIT3）、蛋白精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶5（protein arginine methyltransferase 5，PRMT5）、P53、Caspase3、C-myc基因定量引物，引物序列見表2。

表2 基因定量引物序列

2.3.2 下游基因的熒光定量檢測 用TRIzol法 提取細(xì)胞總RNA，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄，得到cDNA，于-20℃保存。基因定量引物（見表2）進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)，反應(yīng)體系：cDNA樣品0.5μL，2×SYBR Green PCR Mixture 10μL，上下游引物各0.5μL，滅菌水補(bǔ)充至20μL，每個(gè)樣品重復(fù)3次。擴(kuò)增條件：95℃10 min；95℃15 s；60℃1 min；72℃30 s，40個(gè)循環(huán)；溶解曲線程序：95℃15 s；60℃1 min；95℃15 s；60℃1 min。用相對(duì)定量分析方法，以β-ACTIN基因?yàn)閮?nèi)參，計(jì)算各基因相對(duì)表達(dá)量。

2.4 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)組內(nèi)均設(shè)置3個(gè)重復(fù)，每個(gè)試驗(yàn)均重復(fù)3次。試驗(yàn)數(shù)據(jù)用GraphPad Prism 5.0、Motic Image 2000 1.3軟件進(jìn)行分析，采用單因素方差分析法進(jìn)行差異顯著性分析，當(dāng)P＜0.05時(shí)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果與分析

3.1 細(xì)胞總RNA的提取

采用TRIzol法提取細(xì)胞總RNA，1%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果見圖1?？俁NA電泳顯示出3條清晰亮帶，由上至下分別為28S、18S、5S。經(jīng)紫外分光光度計(jì)測定，提取的總RNA質(zhì)量較好，可用于后續(xù)基因表達(dá)量的檢測。

3.2 DNMT3B基因真核過表達(dá)載體的構(gòu)建

3.2.1 豬DNMT3B基因PCR擴(kuò)增結(jié)果 以豬ST細(xì)胞cDNA為模板進(jìn)行DNMT3B基因CDS區(qū)PCR擴(kuò)增，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果見圖2。DNMT3B基因在2 000～3 000 bp之間獲得的片段與預(yù)期片段（2 571 bp）大小相符，清晰條帶。

3.2.2 pGM-T-DNMT3B重組質(zhì)粒構(gòu)建及雙酶切鑒定結(jié)果 將純化獲得的目的片段連接到pGM-T Vector載體上，轉(zhuǎn)化純化重組質(zhì)粒，用HindⅢ和BamHⅠ對(duì)獲得的pGM-T-DNMT3B質(zhì)粒雙酶切鑒定，酶切產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果見圖3。在2 000～3 000 bp中間位置獲得與預(yù)期條帶（2 571 bp）大小相符的條帶，證明重組質(zhì)粒已成功連接。經(jīng)膠回收得到單一清晰條帶，其菌液送往測序公司進(jìn)行測序。

3.2.3 pcDNA3.1-DNMT3B重組質(zhì)粒鑒定 將雙酶切后純化的DNMT3B基因片段與雙酶切后純化的pcDNA3.1（＋）質(zhì)粒片段進(jìn)行連接、轉(zhuǎn)化反應(yīng)，構(gòu)建成pcDNA3.1-DNMT3B重組質(zhì)粒，以轉(zhuǎn)化重組質(zhì)粒的菌液提取質(zhì)粒并用HindⅢ和EcoRⅠ進(jìn)行酶切鑒定。瓊脂糖凝膠電泳檢測，在2 000～3 000 bp之間獲得了DNMT3B基因片段，證明pcDNA3.1-DNMT3B重組質(zhì)粒構(gòu)建成功，見圖4。

3.3 過表達(dá)DNMT3B基因?qū)?xì)胞遷移速率的影響

采用細(xì)胞劃痕方法檢測DNMT3B基因過表達(dá)對(duì)細(xì)胞相對(duì)遷移速率的影響，以pcDNA3.1（＋）空載體及轉(zhuǎn)染細(xì)胞組作為對(duì)照組和空白組，分別在0，24，48，72小時(shí)拍照，觀察到24，48小時(shí)時(shí)轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-DNMT3B重組質(zhì)粒的細(xì)胞遷移能力明顯低于空白組和pcDNA3.1（＋）空載體組。結(jié)果表明：過表達(dá)DNMT3B基因的ST細(xì)胞24小時(shí)時(shí)劃痕的相對(duì)遷移率低于pcDNA3.1（＋）空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組及未轉(zhuǎn)染組細(xì)胞，為空白組遷移速率的0.512倍，差異顯著（P ＜0.05）；48小時(shí)時(shí)為空白組遷移速率的0.620倍且差異顯著（P ＜0.05）；72小時(shí)時(shí)為空白組遷移速率的0.799倍，但差異不顯著。遷移速率結(jié)果見表3，DNMT3B基因過表達(dá)對(duì)豬ST細(xì)胞遷移的影響見圖5。

表3 DNMT3B過表達(dá)對(duì)豬ST細(xì)胞相對(duì)遷移距離的影響

3.4 過表達(dá)DNMT3B基因的ST細(xì)胞中下游基因相對(duì)表達(dá)量變化

Real-time PCR檢測各組cDNA中DNMT3A、DNMT3B、EHMT2、HDAC1、HMOX1、HSF1、HSP70、HSP90、HSPB1、TRDMT1、CSDE1、DDIT3、PRMT5、P53、Caspase3、C-myc基因相對(duì)表達(dá)量，并用SPSS13.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素一維方差分析，結(jié)果見圖6。伴隨著DNMT3B基因的過表達(dá)，DNMT3A、EHMT2、HDAC1、CSDE1、HSF1、P53、Caspase3、C-myc相對(duì)表達(dá)量升高，其中DNMT3A、HSF1、P53、C-myc相對(duì)表達(dá)量顯著升高（P ＜0.05），分別為正常豬ST細(xì)胞的1.57，1.51，1.78，1.47倍；TRDMT1相對(duì) 表 達(dá) 量 略降 低；PRMT5、HSP70、HSP90、HMOX1、HSPB1、DDIT3相對(duì)表達(dá)量不變。

4 討論

4.1 DNMT3B基因過表達(dá)對(duì)細(xì)胞遷移的影響

細(xì)胞遷移能力反映了細(xì)胞在特定環(huán)境下生長和運(yùn)動(dòng)的能力，細(xì)胞劃痕試驗(yàn)是檢測細(xì)胞遷移能力的方法。細(xì)胞的劃痕修復(fù)能力能夠反映細(xì)胞在某些特定環(huán)境或特定基因表達(dá)變化時(shí)的生長活性。本試驗(yàn)檢測了ST細(xì)胞在正常培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染pcDNA 3.1空質(zhì)粒和過表達(dá)DNMT3B基因條件下ST細(xì)胞的遷移情況，結(jié)果表明，DNMT3B基因的過表達(dá)會(huì)明顯抑制ST細(xì)胞的遷移，并且這種抑制作用隨著時(shí)間的增加而逐漸減弱。目前已知DNMT3A、DNMT3B具有DNA從頭甲基化功能，可以增加DNA某些區(qū)段的甲基化水平，抑制或關(guān)閉相關(guān)基因的表達(dá)。朱慧等［10］在肝細(xì)胞癌的研究中發(fā)現(xiàn)，通過轉(zhuǎn)染HbsAg基因抑制DNMT3B基因表達(dá)后肝癌細(xì)胞的增值受到抑制。而董高宏等［11］的研究則證明DNMT3B基因可能是通過Hippo信號(hào)通路發(fā)揮其對(duì)細(xì)胞生長的抑制作用。但彭芳等［12］在宮頸癌的研究中卻發(fā)現(xiàn)，DNMT3B表達(dá)的升高會(huì)促進(jìn)人宮頸癌細(xì)胞的生長和侵襲。這些研究表明，DNMT3B基因?qū)?xì)胞生物學(xué)行為的調(diào)控可能與細(xì)胞類型、生長環(huán)境等因素間存在復(fù)雜的相互作用關(guān)系，是調(diào)節(jié)細(xì)胞活力和運(yùn)動(dòng)的極為重要的基因。

4.2 DNMT3B基因過表達(dá)對(duì)下游基因影響分析

在檢測的下游基因中包含了EHMT2和HDAC1，這兩種基因與組蛋白修飾相關(guān)，它們的表達(dá)情況可以間接反映細(xì)胞核中染色體的包裝狀態(tài)。細(xì)胞通過這些組蛋白相關(guān)基因的表達(dá)來調(diào)節(jié)染色體上其他基因的表達(dá)與抑制。S.C.Hyun等［13］通過siRNA干擾敲低某些癌細(xì)胞中的EHMT2基因，結(jié)果抑制了膀胱癌、肺癌、前列腺癌和乳腺癌細(xì)胞的生長。而在大量醫(yī)學(xué)研究中都發(fā)現(xiàn)，HDAC1廣泛參與腫瘤細(xì)胞的生長、凋亡、侵襲和遷移等過程，干擾HDAC1表達(dá)能夠降低子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力［14］。本試驗(yàn)在ST細(xì)胞中過表達(dá)DNMT3B基因后檢測EHMT2和HDAC1基因的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)這兩種基因的表達(dá)量僅略有升高，表明DNMT3B對(duì)其影響不大，DNMT3B對(duì)下游基因表達(dá)的影響并非通過調(diào)節(jié)組蛋白完成。

熱應(yīng)激蛋白（heat shock proteins，HSPs）家族中的HSP70和HSP90、CSDE1、HSF1、HSPB1等基因是與動(dòng)物溫度應(yīng)激相關(guān)基因，是細(xì)胞在受到溫度、PH值和滲透壓等環(huán)境刺激時(shí)合成的一種保護(hù)性蛋白［15-17］。這些蛋白雖然成為熱應(yīng)激蛋白，但當(dāng)生物體處在寒冷環(huán)境時(shí)這些蛋白的基因表達(dá)也會(huì)做出相應(yīng)的調(diào)整。本試驗(yàn)中CSDE1、HSF1的表達(dá)有明顯增高。說明DNMT3B能夠通過對(duì)特定熱應(yīng)激蛋白類基因的甲基化作用影響動(dòng)物對(duì)壓力環(huán)境的反應(yīng)。

凋亡基因Caspase3基因、癌基因P53基因和C-myc基因都在細(xì)胞增殖和凋亡過程中起著重要作用［18-19］。Caspase3基因是細(xì)胞凋亡的標(biāo)記基因之一，功能涉及DNA修復(fù)和DNA完整性的監(jiān)護(hù)。當(dāng)Caspase3表達(dá)量增高時(shí)，引發(fā)裂解核小體間的DNA斷裂，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡［20］。C-myc具有抑制細(xì)胞分化及促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)化的作用，在對(duì)未成熟胸腺細(xì)胞中C-myc表達(dá)研究中發(fā)現(xiàn)，過度表達(dá)的C-myc蛋白會(huì)導(dǎo)致胚胎胸腺細(xì)胞出現(xiàn)明顯凋亡［21］。P53是一種抑癌基因，其蛋白可以調(diào)節(jié)細(xì)胞周期、保持基因組穩(wěn)定性并避免細(xì)胞發(fā)生癌變［22-23］。因此這3種基因表達(dá)的上調(diào)表明DNMT3B具有抑制細(xì)胞生長的作用，這與本試驗(yàn)中DNMT3B抑制細(xì)胞遷移的結(jié)論相同。

5 結(jié)論

本試驗(yàn)通過在ST細(xì)胞中過表達(dá)DNMT3B基因，研究了其對(duì)細(xì)胞遷移生長和下游基因表達(dá)的影響，結(jié)果表明，DNMT3B基因具有廣泛細(xì)胞生物學(xué)作用，它的過量表達(dá)具有促進(jìn)癌基因表達(dá)、抑制細(xì)胞生長和遷移并提高特定熱應(yīng)激蛋白類基因表達(dá)量的作用。由此也可以推測，當(dāng)動(dòng)物遭遇逆境時(shí)DNMT3B基因表達(dá)量的變化將可能影響動(dòng)物對(duì)環(huán)境的適應(yīng)能力。