趙 芳，陳坤琳，邢光東，錢 勇，曹少先，李隱俠，孟春花，張建麗，張 俊，桂紅兵，仲躋峰，王慧利

（江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 畜牧研究所，南京 210014）

胚胎干細(xì)胞（embryonic stem cells，ESCs）是從哺乳動物囊胚內(nèi)細(xì)胞團(tuán)（inner cell mass，ICM）中分離出來的多能性細(xì)胞，具有無限增殖、自我更新和分化成所有主要細(xì)胞系的能力［1］。在體內(nèi)，多能性是胚胎發(fā)育過程中出現(xiàn)的一種短暫狀態(tài)；但在體外需要在培養(yǎng)器皿的底部鋪上特殊的培養(yǎng)基質(zhì)才能使ESCs黏附和增殖。在細(xì)胞培養(yǎng)基質(zhì)的基礎(chǔ)上通過補充外源性關(guān)鍵因子可以誘導(dǎo)ESCs無限期維持自我更新狀態(tài)及多能性，進(jìn)而開展胚胎發(fā)生、組織分化、藥物篩選、疾病建模、移植治療及轉(zhuǎn)基因動物工程等科學(xué)研究［2-4］。因此，細(xì)胞外基質(zhì)在ESCs培養(yǎng)及研發(fā)應(yīng)用中意義重大。

目前，人和小鼠ESCs的培養(yǎng)常用飼養(yǎng)層細(xì)胞，如小鼠胚胎成纖維細(xì)胞（mouse embryonic fibroblasts，MEFs）或無飼養(yǎng)層的細(xì)胞外基質(zhì)，如基質(zhì)膠（Matrigel），作為細(xì)胞外基質(zhì)，家畜ESCs的培養(yǎng)體系主要借鑒了人和嚙齒動物ESCs的研究方法。MEFs飼養(yǎng)層的制備需經(jīng)過絲裂霉素C或γ射線照射處理，而Matrigel是從Engelbreth-Holm-Swarm小鼠肉瘤中提取的，主要由層黏連蛋白、Ⅳ型膠原、硫酸肝素蛋白多糖、巢蛋白和生長因子組成。MEFs飼養(yǎng)層和Matrigel在制備過程中均表現(xiàn)出批次間的可變性［5］。在培養(yǎng)人或家畜ESCs時，由于MEFs和Matrigel存在異質(zhì)性及批次不穩(wěn)定性問題，易引發(fā)ESCs分化或癌化［6］。因此，明確培養(yǎng)條件、優(yōu)化細(xì)胞外基質(zhì)有助于更精確地探索ESCs自我更新和分化的分子基礎(chǔ)。本試驗設(shè)置了MEFs、Matrigel和 貼附因子（attachment factor，AF）3種細(xì)胞培養(yǎng)板，通過分析小鼠ESCs（mESCs）的形態(tài)變化、克隆集落形成及多能性調(diào)控因子的表達(dá)，綜合評定3種不同處理對mESCs多能性維持的影響，為建立和優(yōu)化家畜ESCs培養(yǎng)體系提供參考和借鑒。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

6周齡SPF級ICR雌性小鼠20只和雄性小鼠3只，購自南京市江寧區(qū)青龍山動物繁殖場。小鼠飼養(yǎng)在溫度20～26℃、濕度40%～70%、光照／黑暗12 h／12 h、自由飲水的標(biāo)準(zhǔn)化實驗動物環(huán)境中。

1.2 試驗試劑及儀器

Anti-Sox2（sc17320）、Anti-Oct4（sc5279），購自SantaCruz公司；mLIF（HY-P7084）、絲裂霉素-C（HY-13316），購自MCE公司；PD0325901（S1036）、CHIR99021（S1263），購自Selleck公司；Matrigel（354277，CORNING），購自睿捷生物公司；β-巰基乙醇（M 6250）、小鼠胚胎培養(yǎng)基（KSOM，MR-121-D），購自Sigma生物公司；胎牛血清（SH30396，Hyclone）、Dulbecco’s Modified Eagle Medium（DMEM，11965-092）、Dulbecco’s Modified Eagle Medium-F12（DMEM-F12，11330-032）、Neurobasal Medium（21103-049）、N2 Supplement（17502-048）、B-27 Supplement（12587-010）、血清替代物（A3181502）、0.05% Trypsin-EDTA（25300-062）、GlutaMAX（35050-061）、非必需氨基酸（11140-050）、Attachment Factor（AF，S006100）、青霉素-鏈霉素（15140-122）、Knock-Out Serum Replacement（A3181502）、磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS），購自Thermo Fisher Scientific公司；BCIP／NBT堿性磷酸酯酶顯色試劑盒（C3206），購自碧云天生物公司；血清促性腺激素（pregnant mare serum gonadotropin，PMSG）、人體絨膜促性腺激素（human chorionic gonadotropin，hCG），購自寧波第二激素廠。

500 mL N2B27細(xì)胞培養(yǎng)液的配制：240 mL DMEM／F12 ＋240 mL Neurobasal＋2.5 mL N2 supplement＋5 mL B27 supplement＋1% GlutaMAX ＋1% 非必需氨基酸 ＋0.1 mmol／Lβ-巰基乙醇 ＋1% 青霉素-鏈霉素 ＋5% 血清替代物＋10 ng／mL mLIF＋3μmol／L CHIR99021＋1μmol／L PD0325901。

細(xì)胞培養(yǎng)箱（型號為Thermo ScientificTM8000），購自賽默飛公司；倒置熒光顯微鏡（Nikon ECLIPSE Ti），購自尼康儀器有限公司。

1.3 小鼠囊胚獲得、mESC建系培養(yǎng)及飼養(yǎng)層的制備

雌鼠每只腹腔注射10 U PMSG，48 h后注射10 U hCG，與公鼠合籠；合籠第2天觀察雌鼠是否有陰道栓，將見栓雌鼠記為孕0.5天；在孕1.5天，頸椎脫臼法處死合籠雌鼠；打開腹腔取出雙側(cè)輸卵管放于M2操作液中，用32號無菌注射器吸取M2培養(yǎng)液，在體視顯微鏡下小心沖洗輸卵管，收集2-細(xì)胞階段胚胎，置于含有5%KSR的KSOM培養(yǎng)液中，于37℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至囊胚階段；將囊胚接種到預(yù)先鋪有MEFs飼養(yǎng)層的細(xì)胞培養(yǎng)板上，添加N2B27細(xì)胞培養(yǎng)液，置于37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～5 d；在解剖鏡下用拉細(xì)的巴斯德吸管小心切割分離內(nèi)細(xì)胞團(tuán)細(xì)胞（ICM）集落進(jìn)行機(jī)械傳代；培養(yǎng)2～4 d后，出現(xiàn)克隆狀ESCs集落，稱為第1代（記為P1代），用酶消化法進(jìn)行分離、傳代，重新接種于新的MEFs飼養(yǎng)層。

將傳代3代以內(nèi)的原代MEFs以1×106／mL密度接種到細(xì)胞培養(yǎng)板上，添加適量的DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，等細(xì)胞單層覆蓋培養(yǎng)板時用10μg／mL絲裂霉素C處理3 h，用PBS清洗3遍，加入適量N2B27細(xì)胞培養(yǎng)液，置于37℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中，備用。

1.4 Matrigel和AF培養(yǎng)基的制備

將40 μL Matrigel加入預(yù)冷的3.5 mL DMEM-F12中，以250μL／孔加入24孔板中，于室溫下孵育2 h。使用前棄去液體，添加N2B27細(xì)胞培養(yǎng)液，備用。

將AF以250μL／孔加入到24孔板中，于37℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育2 h，然后用PBS清洗1遍，添加N2B27細(xì)胞培養(yǎng)液，備用。

1.5 堿性磷酸酶染色（AP）鑒定

棄掉細(xì)胞培養(yǎng)液，加入PBS清洗細(xì)胞。加入4%多聚甲醛，室溫固定15 min；棄掉多聚甲醛，用PBS清洗2次，每孔加入500μL BCIP／NBT染色液，室溫避光染色15 min～2 h，棄掉染色液；加入PBS清洗，用純化水終止染色，于顯微鏡下觀察，拍照。

1.6 集落形成試驗

mESCs以1 000個細(xì)胞／孔接種于24孔板，加入含5% KSR的N2B27細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)2 d，在顯微鏡下觀察mESCs集落形成情況并計數(shù)。

1.7 免疫熒光染色

用500μL PBS緩慢清洗細(xì)胞3次，每次5 min；加入200μL 4%多聚甲醛固定細(xì)胞，室溫放置15～30 min；用PBS洗細(xì)胞3次，每次5 min；用0.5% Triton X-100通透20 min，PBS洗3次，每次5 min；用封閉液封閉細(xì)胞1 h；添加一抗（按照一抗稀釋比例進(jìn)行稀釋），4℃避光過夜；用PBS清洗3次，每次5 min；添加二抗（按照二抗稀釋比例進(jìn)行稀釋），室溫避光孵育1 h；PBS清洗細(xì)胞3次，每次5 min；加200μL Hoechst 33342避光染色5 min，用PBS清洗細(xì)胞，在顯微鏡下觀察，拍照。

1.8 qRT-PCR

根據(jù)NCBI核酸數(shù)據(jù)庫中相應(yīng)基因mRNA全序列，利用Primer premier 5.0軟件設(shè)計引物。引物由擎科生物公司合成，引物序列見表1。采用TRIzol法提取肝臟樣品中的總RNA，用紫外分光光度計檢測RNA質(zhì)量和濃度，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄及熒光定量PCR擴(kuò)增。被檢樣品均重復(fù)3次，取平均值；以GAPDH作為內(nèi)參基因，利用2-△△Ct法（2-△△Ct表示處理組目的基因的表達(dá)量相對于對照組的變化倍數(shù)）計算各基因的相對表達(dá)量，△Ct ＝Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因，△△Ct＝（Ct處理組目的基因-Ct處理組內(nèi)參基因）-（Ct對照組目的基因-Ct對照組內(nèi)參基因）。

表1 實時熒光定量PCR引物

1.9 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)采用SPSS軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，采用t檢驗進(jìn)行比較，以P ＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 mESCs細(xì)胞形態(tài)特征

見圖1。 由圖1可以看出：從囊胚孵化物（圖1A、B）分離的mESCs細(xì)胞排列緊密，呈集落狀生長，克隆呈突起圓頂狀，邊緣遮光性強，與周圍的飼養(yǎng)層細(xì)胞界限分明，為Na?ve-ESCs（圖1C～E）；AP染色后mESCs細(xì)胞克隆呈現(xiàn)紅色，邊緣飼養(yǎng)層細(xì)胞未著色作為陰性對照，說明mESCs細(xì)胞克隆AP染色陽性（圖1F）。

2.2 MEFs、Matrigel及AF處理對mESCs細(xì)胞形態(tài)及集落形成的影響

用含5% KSR的N2B27培養(yǎng)液培養(yǎng)mESCs，分別比較MEFs飼養(yǎng)層、Matrigel及AF細(xì)胞培養(yǎng)板對mESCs細(xì)胞形態(tài)特征及克隆集落形成的影響，結(jié)果見圖2。

由圖2可以看出：MEFs飼養(yǎng)層能很好地維持mESCs圓頂狀形態(tài)；Matrigel處理細(xì)胞培養(yǎng)板培養(yǎng)的mESCs邊緣遮光性好，但形態(tài)不是規(guī)則的圓頂狀；AF細(xì)胞培養(yǎng)板培養(yǎng)的mESCs中有少量mESCs形態(tài)呈扁平狀，類似于Primed狀態(tài)的EpiSCs；另外，AF細(xì)胞培養(yǎng)板培養(yǎng)的mESCs黏附數(shù)量少，形成的集落數(shù)量顯著少于MEFs飼養(yǎng)層和Matrigel細(xì)胞培養(yǎng)板。

2.3 MEFs飼養(yǎng)層、Matrigel和AF處理對多能性調(diào)控因子蛋白表達(dá)的影響

利用免疫熒光檢測不同處理mESCs中多能性調(diào)控因子Oct4和Sox2蛋白的表達(dá)情況，結(jié)果見圖3。

由圖3可以看出，3種不同處理mESCs均檢測到多能性調(diào)節(jié)因子Oct4和Sox2蛋白的表達(dá)。

2.4 MEFs、Matrigel及AF處理細(xì)胞培養(yǎng)板對多能性調(diào)控因子mRNA表達(dá)的影響

分別收集Matrigel和AF細(xì)胞培養(yǎng)板培養(yǎng)的mESCs，用qRT-PCR檢測mESCs中多能性調(diào)控因子的mRNA表達(dá)，結(jié)果見圖4。

由圖4可以看出：Matrigel細(xì)胞培養(yǎng)板培養(yǎng)的mESCs中Oct4 mRNA表達(dá)略高于AF，但差異不顯著（P＞0.05）；而Matrigel細(xì)胞培養(yǎng)板培養(yǎng)的mESCs中Nanog和Sox2的mRNA表達(dá)水平顯著或極顯著高于AF（P＜0.05或P＜0.01）。

3 討論

ESCs增殖及自我更新需要穩(wěn)定的微環(huán)境，微環(huán)境改變會影響ESCs多能性維持而觸發(fā)分化。細(xì)胞外基質(zhì)是干細(xì)胞自我更新和增殖的重要微環(huán)境，對細(xì)胞外基質(zhì)的優(yōu)化有助于明確ESCs培養(yǎng)必需的微環(huán)境和建立穩(wěn)定的ESCs培養(yǎng)體系。為深入研究和優(yōu)化ESCs培養(yǎng)體系，本試驗對MEFs、Matrigel和AF制作的培養(yǎng)基底進(jìn)行了比較分析。

目前，MEFs是最常用的干細(xì)胞培養(yǎng)基底。MEFs飼養(yǎng)層的優(yōu)勢在于能夠分泌出誘導(dǎo)多能干細(xì)胞未分化生長所必需的細(xì)胞因子［7］。然而，MEFs飼養(yǎng)層制備要求高，MEFs的代數(shù)、密度及增殖滅活方式均會影響MEFs飼養(yǎng)層質(zhì)量，從而影響細(xì)胞因子的分泌。細(xì)胞因子表達(dá)和分泌的不一致，很難確定哪些成分是在未分化狀態(tài)下支持ESCs所必需的［8］。此外，γ照射飼養(yǎng)層細(xì)胞不僅會阻礙其增殖，還會導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，進(jìn)而改變可溶性因子的分泌和細(xì)胞外基質(zhì)的沉積，這些因素都可能對ESCs的自我更新和一致性培養(yǎng)產(chǎn)生負(fù)面影響［9］。因此，MEFs飼養(yǎng)層細(xì)胞微環(huán)境的不確定性限制了人們深入解析ESCs生物學(xué)特性的分子機(jī)制。本試驗中，MEFs飼養(yǎng)層可以高效制備mESCs，并有效維持mESCs圓頂狀的Na?ve狀態(tài)。然而，對于人類干細(xì)胞或家畜干細(xì)胞培養(yǎng)，MEFs飼養(yǎng)層可能分泌異種物質(zhì)而引發(fā)免疫應(yīng)答和分化［6］，因此，建立一種成分明確且穩(wěn)定的細(xì)胞外基質(zhì)有助于開展人類干細(xì)胞及家畜干細(xì)胞的研究及應(yīng)用。

Matrigel是基于無飼養(yǎng)層理念研發(fā)出來并廣泛應(yīng)用于人干細(xì)胞體外培養(yǎng)的細(xì)胞培養(yǎng)基底。本試驗中，Matrigel細(xì)胞培養(yǎng)板培養(yǎng)的mESCs克隆形態(tài)不是規(guī)則的Na?ve圓頂狀，且克隆集落生成效率慢于MEFs。目前，Matrigel成功用于人類ESCs和PSC誘導(dǎo)培養(yǎng)，但不能有效用于牛胚胎干細(xì)胞建系及傳代培養(yǎng)［10］。此外，由于MEFs和Matrigel存在異種成分，使得這兩種基底培養(yǎng)的干細(xì)胞難以應(yīng)用于臨床治療。AF的主要成分是明膠，本試驗中利用AF包被培養(yǎng)皿后接種mESCs，在5% KSR濃度的N2B27培養(yǎng)液條件下能維持mESCs的增殖和多能性，但有少量mESCs的形態(tài)接近于Primed的扁平狀。

ESCs的自我更新及多能性由復(fù)雜的基因調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)控制，其中轉(zhuǎn)錄因子Oct4、Sox2和Nanog發(fā)揮至關(guān)重要的作用而被作為ESCs多能性標(biāo)記。Oct4在ESCs多能性維持中發(fā)揮不可或缺的作用；Oct4水平升高或降低50%，可分別分化為表達(dá)內(nèi)胚層、中胚層或滋養(yǎng)外胚層標(biāo)記的細(xì)胞［11］。Sox2通過其高度保守的HMG-box結(jié)構(gòu)域與DNA結(jié)合，與其他多能性調(diào)控因子Oct4和Nanog合作，主要發(fā)揮轉(zhuǎn)錄抑制作用而參與ES細(xì)胞多能性及誘導(dǎo)分化調(diào)控［12］。Nanog是胚胎發(fā)育初期在Oct4啟動表達(dá)后維持ICM多能性的又一必需基因，Nanog高表達(dá)與ESCs多能性的維持緊密相關(guān)。Nanog主要通過與靶基因調(diào)控區(qū)結(jié)合，選擇性抑制分化基因表達(dá)或促進(jìn)多能性基因表達(dá)，維持ESCs多能性和自我更新。Nanog與甲基化羥化酶TET1、TET2結(jié)合并調(diào)控其活性，增加Esrrb和Oct4的5-羥甲基化水平，啟動它們的表達(dá)以誘導(dǎo)重編程及維持多能性［13］。本試驗中，在含5% KSR的N2B27培養(yǎng)條件下，與Matrigel相比，AF細(xì)胞培養(yǎng)板培養(yǎng)的mESCs中Oct4、Sox2和Nanog的轉(zhuǎn)錄表達(dá)均下調(diào)。這一結(jié)果提示AF細(xì)胞培養(yǎng)板培養(yǎng)的mESCs更易于發(fā)生分化。此外，鑒于不同種屬ESCs對培養(yǎng)體系要求不同，如Lif重組蛋白能有效維持mESCs的多能性［14］，而生長因子FGF-2在豬、牛胚胎干細(xì)胞建系及多能性維持中起重要作用［10，15］，如何使Matrigel、AF細(xì)胞培養(yǎng)板適用于大家畜胚胎干細(xì)胞分離及培養(yǎng)，還需要針對ESCs的種屬特性對培養(yǎng)體系進(jìn)行進(jìn)一步探索、優(yōu)化。

4 結(jié)論

Matrigel和AF作為細(xì)胞外基質(zhì)培養(yǎng)的mESCs具有一定的多能性，傳代后細(xì)胞黏附數(shù)量和集落形成數(shù)量少于MEFs基底；此外，AF基底培養(yǎng)的mESCs易于發(fā)生分化，因此，需要在培養(yǎng)體系及細(xì)胞傳代密度上有所調(diào)整。