田丹丹 周維 李朝生 韋弟 覃柳燕 黃素梅 韋莉萍 龍盛風 何章飛 韋紹龍

摘要：【目的】對香蕉枯萎病拮抗菌GKT04發(fā)酵上清液中的脂肽類抗生素進行分離，分析其抑菌活性相關(guān)成分，為揭示菌株GKT04的抑菌機理及應(yīng)用該菌株防控香蕉枯萎病提供理論依據(jù)。【方法】以解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amy-loliquefaciens）GKT04、香蕉枯萎病菌4號生理小種（Fusarium oxysporum f. sp. cubense race 4，F(xiàn)OC4）和桂蕉1號為試驗材料，利用特異性引物對菌株GKT04中ituA、ituB、ituC、ituD、fenA、fenB、sfp、srfA、bmyA、bmyB和bmyC脂肽類抗生素合成相關(guān)基因進行檢測;利用鹽酸沉淀、甲醇抽提等步驟得到菌株GKT04發(fā)酵上清液中的脂肽類抗生素，利用高效液相色譜（HPLC）對脂肽類抗生素進行分離，對收集的洗脫峰組分進行體外抑制致病菌FOC4效果試驗，對抑菌活性較強的組分進行基質(zhì)協(xié)助激光解吸附離子化—飛行時間質(zhì)譜（MALDI-TOF-MS）分析?！窘Y(jié)果】菌株GKT04脂肽類抗生素粗提物對香蕉枯萎病致病菌FOC4的抑菌圈直徑為24 mm，盆栽防控效果與對照相比病情指數(shù)降低了78.31%;PCR擴增顯示菌株GKT04含有ituA、ituC、ituD、fenA、fenB、srfA、bmyA和bmyB基因，而ituB、sfp和bmyC未擴增出;菌株GKT04脂肽類抗生素粗提物經(jīng)HPLC分離后共收集到4個組分P1、P2、P3和P4，其中組分P1和組分P3對致病菌FOC4的抑菌效果較好，抑菌圈直徑分別為18和15 mm;經(jīng)MALDI-TOF-MS質(zhì)譜分析，組分P1和組分P3分別為脂肽類抗生素fengycins和bacillomycin D。【結(jié)論】解淀粉芽孢桿菌GKT04產(chǎn)生fengycins和bacillomycin D兩類脂肽類抗生素。

關(guān)鍵詞： 香蕉枯萎病;解淀粉芽孢桿菌GKT04;脂肽類抗生素;分離;鑒定

中圖分類號： S668.1? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻標志碼： A 文章編號：2095-1191（2020）05-1122-06

Abstract：【Objective】The lipopeptide antibiotics were isolated from the supernatant of fermented broth of Bacillus amyloliquefaciens GKT04 antagonistic to banana fusarium wilt， analysis of the antifungal activity was conducted for theoretical foundation for revealing the bacteriostasis mechanism of strain GKT04 and control of banana fusarium wilt with strain GKT04. 【Method】B. amyloliquefaciens GKT04， Fusarium oxysporum f. sp. cubense race 4（FOC4） and Guijiao No.1 were used as materials. Eleven primers designed based on the known lipopeptides genes ituA， ituB， ituC， ituD， fenA， fenB， sfp， srfA， bmyA， bmyB and bmyC were used to amplify the corresponding genes from the genome of GKT04 strain. The crude lipopeptides extracts were extracted by acid precipitation and methanol from strain GKT04 fermentation supernatant， the extract was separated by high performance liquid chromatography（HPLC）， and antifungal activity test in vitro on FOC4 of the elution peak components collected was carried out. The components with antimicrobial activity were identified by matrix-assisted laser-desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry（MALDI-TOF-MS） techniques. 【Result】The crude extract of strain GKT04s lipopetide antibiotics inhibited the growth of FOC4， and the diameter was 24 mm. Pot experiments indicated that the disease index of banana seedlings reduced by 78.31% compared with the control. PCR amplification test results showed that GKT04 strain was able to amplify the ituA， ituC， ituD， fenA， fenB， srfA， bmyA and bmyB synthesis genes， but failed to amplify the ituB， sfp and bmyC synthesis genes. Four components（P1， P2， P3 and P4） were collected by HPLC from GKT04 lipopeptide antibiotic crude extract， P1 and P3 exhibited better antimicrobial activity to pathogenic bacteria FOC4? with inhibition zone diameters of 18 and 15 mm respectively. P1 was lipopeptide antibiotic fengycins and P3 was lipopeptide antibiotic bacillomycin D detected by MALDI-TOF-MS analysis. 【Conclusion】The lipopeptide antibiotics produced by Bacillus amyloliquefaciens GKT04 are fengycins and bacillomycin D.

Key words：banana fusariumwilt; Bacillus amyloliquefaciens GKT04; lipopetide antibiotic; isolation; identification

Foundation item： National Key Research and Development Program（2017YFD0202105-04）; Guang-xi Natural Scien-ce Foundation for Youth（2017GXNSFBA198219）;Guangxi Innovation Driven Development Project（Guike AA181180 28-3）;Guangxi Key Research and Development Project （Guike AB19245026）

0 引言

【研究意義】香蕉枯萎病是由尖孢鐮刀菌古巴?；停‵usarium oxysporum f. sp. cubeuse，F(xiàn)oc）侵染香蕉植株而導致植株維管束壞死的土傳真菌病害。利用微生物及其代謝產(chǎn)物抑制土傳真菌病害是目前研究的重點。研究表明，芽孢桿菌及其產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)能有效抑制植物病原真菌的生長（王帥，2009;宋莉莎等，2019;張忠良等，2019），在植物病害的生物防治中具有重要作用。因此，對芽孢桿菌產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)進行分類和鑒別，為了解其抑菌機理及利用其更好地對病害進行生物防治均具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】脂肽類抗生素是芽孢桿菌非核糖體途徑合成的抑制病原真菌生長的主要抑菌物質(zhì)（Tsuge et al.，2001;Romero et al.，2007;Zeriouh et al.，2011），主要包括伊枯草素家簇iturins（iturin A、iturin B、iturin C、iturin D和iturin E;bacillomycin D、bacillomycin F和bacillomycin L;mycosubtilin）、泛革素家簇fengycins（fengycin A和fengycin B）、表面活性素家簇surfactins和一些結(jié)構(gòu)未知的環(huán)肽抗生素（Ongena and Jacques，2008）。iturins主要通過破壞真菌細胞壁和細胞膜來抑制真菌生長，其中iturin A的應(yīng)用最廣泛。iturin A合成酶操縱子有4個開放性閱讀框，分別編碼催化酶ituA、ituB、ituC和ituD。fengycins對絲狀真菌具有強烈的抑制作用，其抑菌機理與iturins相似。編碼fengycins合成的fen操縱子由fenA、fenB、fenC、fenD和fenE 5個基因組成。surfactins雖然對真菌的抗性較弱，但可增強生防菌的定殖和誘導植物抗性。Ongena等（2007）發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌S499分泌的surfactins和fengycins協(xié)同作用誘導植物產(chǎn)生系統(tǒng)抗性。surfactins合成酶由srfAA、srfAB、srfAC和srfAD 4個亞基組成，由srfA操縱子編碼。張榮勝等（2013）發(fā)現(xiàn)解淀粉芽孢桿菌Lx-11產(chǎn)生的脂肽類抗生素為surfactin、fengycin和bacillomycin D。劉宇帥等（2018）利用基質(zhì)協(xié)助激光解吸附離子化—飛行時間質(zhì)譜（MALDI-TOF-MS）分析鑒定解淀粉芽孢桿菌TF28產(chǎn)生的脂肽類物質(zhì)，并發(fā)現(xiàn)fengycins對尖孢鐮刀菌和禾谷鐮刀菌具有較強的抑制活性。張學雯等（2019）利用高效液相色譜—電噴霧飛行時間質(zhì)譜聯(lián)用分析（HPLC-ESI-MS）法將解淀粉芽孢桿菌B10-6-1產(chǎn)生的脂肽類抗生素鑒定為C14bacillocnycin D和C15bacillocnycin D。【本研究切入點】菌株GKT04是從香蕉根部分離獲得的一株內(nèi)生解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens），該菌株及其發(fā)酵上清液對香蕉枯萎病菌4號生理小種（FOC4）具有較強的抑制活性（田丹丹等，2018），但其抑菌機理目前尚不明確。【擬解決的關(guān)鍵問題】利用特異性引物對菌株GKT04中ituA、ituB、ituC、ituD、fenA、fenB、sfp、srfA、bmyA、bmyB和bmyC脂肽類抗生素合成相關(guān)基因進行檢測;利用鹽酸沉淀、甲醇抽提等步驟得到菌株GKT04發(fā)酵上清液中的脂肽類抗生素，利用高效液相色譜（HPLC）對脂肽類抗生素進行分離，對收集的洗脫峰組分進行體外抑制FOC4效果試驗，并對抑菌活性較強的組分進行MALDI-TOF-MS檢測分析，從而實現(xiàn)對菌株GKT04產(chǎn)生的脂肽類抗生素進行分離純化及鑒定，明確該菌株產(chǎn)生的脂肽類抗生素種類，為揭示該菌株的抑菌機理及香蕉枯萎病防控提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）GKT04由廣西農(nóng)業(yè)科學院生物技術(shù)研究所香蕉遺傳改良研究室篩選并保藏;香蕉枯萎病菌4號生理小種（F. oxysporum f. sp. cubense race 4，F(xiàn)OC4）由廣西農(nóng)業(yè)科學院生物技術(shù)研究所香蕉遺傳改良研究室分離并保藏;桂蕉1號（廣西香蕉常規(guī)主栽品種）由廣西農(nóng)業(yè)科學院生物技術(shù)研究所提供。

1. 2 試驗方法

1. 2. 1 脂肽類抗生素粗提物的制備 將平板上的菌株GKT04用接種環(huán)轉(zhuǎn)接到裝有10 mL LB培養(yǎng)基的小瓶中，30 ℃、180 r/min搖床培養(yǎng)9～15 h。按1%的接種量再轉(zhuǎn)接到100 mL新鮮的LB液體培養(yǎng)基中，30 ℃、180 r/min搖床培養(yǎng)48 h。4 ℃下6000 r/min離心20 min除去菌體。上清液中加入6 mol/L鹽酸調(diào)節(jié)pH至2.0～2.5，邊加鹽酸邊輕微攪拌，于4 ℃冰箱過夜，8000 r/min離心30 min，收集沉淀。沉淀干燥后向每管沉淀中加入0.5 mL pH 7.0的甲醇，混勻后萃取4～8 h，然后8000 r/min、4 ℃離心30 min，取上清液。同樣方法萃取2次，合并上清液用0.22 μm濾膜過濾，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1. 2. 2 脂肽類抗生素粗提物對香蕉枯萎病致病菌的抑菌效果 用無菌水將致病菌FOC4的菌落洗脫，得到孢子液。用無菌水將孢子液稀釋至105 CFU/mL。按1%的接種量將FOC4孢子液混合到PDA培養(yǎng)基中倒平板。牛津杯插入平板中央，向牛津杯中加入200 μL脂肽類抗生素粗提物，30 ℃恒溫培養(yǎng)3～5 d后，觀察抑菌效果，測定抑菌圈直徑。每處理重復(fù)3次。

1. 2. 3 脂肽類抗生素粗提物對香蕉枯萎病致病菌的盆栽防控效果 用1.2.1的方法制備菌株GKT04脂肽類抗生素粗提物。選取長勢一致的香蕉砂培幼苗（5～6片葉子）種植于營養(yǎng)杯中，采用灌根法接種菌株GKT04脂肽類抗生素粗提物20 mL，以接種空白LB培養(yǎng)基為對照，7 d后傷根，淋孢子懸浮液濃度為5×106 CFU/mL的致病菌FOC4菌液20 mL。每處理10株，重復(fù)3次。50 d后調(diào)查植株發(fā)病情況。香蕉苗期枯萎病分級參考黃素梅等（2019）的方法。按以下公式計算病情指數(shù)和防治效果。

病情指數(shù)=[∑（各級發(fā)病數(shù)×相對級數(shù)值）供試植株總數(shù)×最高病級]×100

防治效果（%）=（清水對照病情指數(shù)-處理病情

指數(shù)）/清水對照病情指數(shù)×100

1. 2. 4 合成脂肽類抗生素相關(guān)基因的克隆檢測

設(shè)計擴增ituA、ituB、ituC、ituD、fenA、fenB、sfp、srfA、bmyA、bmyB和bmyC基因的引物序列（表1），以菌株GKT04基因組DNA為模板進行PCR擴增。PCR擴增產(chǎn)物送生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序。

1. 2. 5 脂肽類抗生素的HPLC分離 利用Agilent HPLC-1100將脂肽類抗生素樣品注入C18柱（賽默飛色譜柱，4.6 mm×250 mm，0.5 mm），VWD紫外檢測器，流速1 mL/min，波長214 nm，流動相：乙腈（10 mmol/L）∶醋酸銨=3∶4（v/v）。收集各保留時間對應(yīng)的抗菌物質(zhì)組分，冷凍干燥后，1 mL甲醇溶解，-80 ℃保存?zhèn)溆?。將收集的各個組分按1.2.2的方法進行抑菌活性檢測，活性較好的組分進行質(zhì)譜分析。

1. 2. 6 脂肽類抗生素的質(zhì)譜檢測分析 利用MALDI-TOF-MS對HPLC收集的有效組分進行脂肽類抗生素種類檢測及鑒定分析（Koumoutsi et al.，2004）。

2 結(jié)果與分析

2. 1 脂肽類粗提物對香蕉枯萎病致病菌FOC4的抑制效果

菌株GKT04發(fā)酵上清液中脂肽類粗提物對香蕉枯萎病致病菌FOC4具有明顯的抑制效果，抑菌圈直徑為24 mm（圖1）。

2. 2 脂肽類粗提物對香蕉枯萎病的盆栽防控效果

接種香蕉枯萎病致病菌FOC4 15 d后，對照組和處理組的部分植株開始出現(xiàn)葉片黃化的發(fā)病癥狀，接種致病菌50 d后，對照組的病情指數(shù)為72.14，處理組的病情指數(shù)為15.65，與對照組相比，處理組的香蕉枯萎病病情指數(shù)降低了78.31%。

2. 3 脂肽類抗生素合成相關(guān)基因的克隆結(jié)果

以菌株GKT04基因組DNA為模版，PCR擴增脂肽類抗生素合成相關(guān)的基因，可擴增出ituA、ituC、ituD、fenA、fenB、srfA、bmyA和bmyB基因，將上述基因序列在NCBI上進行BLAST比對，與已提交的解淀粉芽孢桿菌相關(guān)基因序列同源性均在98%以上;未擴增出ituB、sfp和bmyC基因（圖2）。

2. 4 脂肽類抗生素的HPLC分離結(jié)果

菌株GKT04發(fā)酵上清液中脂肽類抗生素粗提物經(jīng)HPLC分離后共得到4個組分P1、P2、P3和P4，其中組分P1和組分P2不是單一的離子峰，說明這2個組分不是單一物質(zhì)，可能是結(jié)構(gòu)相似的同系物或異構(gòu)體（圖3）。

2. 5 各組分對香蕉枯萎病致病菌FOC4的抑菌效果

分別對上述4個組分進行FOC4抑菌試驗，結(jié)果（圖4）發(fā)現(xiàn)，除組分P2無抑菌效果外，其余組分對FOC4均具有抑菌效果，其中組分P1和組分P3的抑菌效果明顯，抑菌圈直徑分別為18和15 mm，組分P4的抑菌效果較弱，抑菌圈直徑為11 mm。

2. 6 脂肽類抗生素種類的初步分析

利用MALDI-TOF-MS對組分P1和組分P3進行質(zhì)譜分析，發(fā)現(xiàn)組分P1峰值m/z=1473.485、1487.542、1501.594、1515.646和1529.684 Da（圖5-A），分別相差約14.000 Da，這5個離子峰均對應(yīng)fengycins;組分P3峰值m/z=1045.931、1067.560和1083.924 Da處出現(xiàn)了3個相差約14.000 Da的離子峰（圖5-B），對應(yīng)iturins的bacillomycin D，與張學雯等（2019）報道bacillomycin D的離子峰一致。

3 討論

隨著第一株解淀粉芽孢桿菌FZB42全基因組測序的完成（Chen et al.，2007），對其生防機理也展開了大量研究。解淀粉芽孢桿菌主要通過分泌次生代謝產(chǎn)物抑制病原菌的生長發(fā)育。鑒定解淀粉芽孢桿菌的抗菌物質(zhì)和抑菌機理是目前的研究熱點。解淀粉芽孢桿菌產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物主要通過核糖體途徑和非核糖體途徑合成，前者包括抗菌蛋白和抗菌肽，后者包括脂肽類化合物和聚酮化合物等（劉磊等，2017）。脂肽類化合物一般是由1個β-羥基脂肪酸和7～10個氨基酸肽鏈通過內(nèi)脂鍵而形成的環(huán)狀結(jié)構(gòu)（Ongena et al.，2005），主要包括iturins、fengycins、surfactins、bacillomycins和mycosubtilins等，其抗真菌、細菌及病毒的效果均非常明顯。目前，這類抗菌活性物質(zhì)的研究主要集中在芽孢桿菌領(lǐng)域（陳萍等，2015）。不同的解淀粉芽孢桿菌合成的脂肽類化合物不同，即使同一菌株產(chǎn)生的同一種脂肽類化合物也是由幾種結(jié)構(gòu)類似的同系物組成的復(fù)雜化合物（Peypoux et al.，1999）。

本研究通過抑菌試驗及盆栽防控試驗初步探明菌株GKT04的抑菌物質(zhì)為脂肽類抗生素。為進一步明確該菌株產(chǎn)生的脂肽類抗生素的種類，首先通過PCR檢測發(fā)現(xiàn)菌株GKT04全基因組中存在ituA、ituC、ituD、fenA、fenB、srfA、bmyA和bmyB等合成脂肽類物質(zhì)的相關(guān)基因，說明菌株GKT04具有合成多種脂肽類抗生素的潛能，從分子水平上驗證了相關(guān)研究結(jié)果的可靠性。通過HPLC對菌株GKT04發(fā)酵上清液中脂肽類抗生素粗提物進行分離，共得到4個組分。結(jié)合抑菌試驗，組分P1和組分P3的抑菌效果明顯。利用MALDI-TOF-MS對組分P1和組分P3進行深入檢測分析，發(fā)現(xiàn)組分P1中存在fengycins，組分P3中存在bacillomycin D，與PCR擴增到fenA、fenB、bmyA和bmyB基因相符，表明菌株GKT04發(fā)酵上清液中的脂肽類物質(zhì)主要為fengycins和bacillomycin D。Liu等（2011）在研究解淀粉芽孢桿菌C06對桃褐腐病菌抑菌機理過程中發(fā)現(xiàn)，菌株C06產(chǎn)生的脂肽類抗生素為fengycins和bacillomycin D。向亞萍等（2016）發(fā)現(xiàn)解淀粉芽孢桿菌B1619分泌的脂肽類抗生素fengycins和baciliomycin L是抑制番茄枯萎病菌生長的主要抑菌物質(zhì)。由此可見，fengycins和bacillomycins在抑制真菌的生長中發(fā)揮重要作用。

Zhao等（2012）認為srfA基因是合成surfactins的關(guān)鍵基因，通過改變srfA的表達量，突變菌株F2-38的surfactins產(chǎn)量提高了3.5～10.3倍。本研究中菌株GKT04未擴增到sfp基因，擴增到srfA基因，但質(zhì)譜檢測中未檢測到surfactins。surfactins合成基因組序列存在多樣性、surfactins的合成受群集感應(yīng)系統(tǒng)調(diào)控或因surfactins合成產(chǎn)量過低或合成過程受阻均可能導致質(zhì)譜檢測不到surfactins。

4 結(jié)論

利用HPLC對解淀粉芽孢桿菌GKT04產(chǎn)生的脂肽類抗生素進行分離，其中組分P1和組分P3的抑菌效果最好，MALDI-TOF-MS分析組分P1的成分為fengycins，組分P3的成分為bacillomycin D。

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（責任編輯 麻小燕）