李程勛 李?lèi)?ài)萍 徐曉俞 鄭開(kāi)斌

摘要：研究牛大力精油成分，并利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法初步分析其活性物質(zhì)的作用機(jī)制。通過(guò)回流法提取牛大力精油，并利用固相微萃取技術(shù)對(duì)樣品進(jìn)行采集，氣相色譜-質(zhì)譜法（GC-MS）對(duì)樣品成分進(jìn)行測(cè)定，結(jié)合計(jì)算機(jī)譜庫(kù)和人工譜圖解析對(duì)樣品成分進(jìn)行鑒定，然后進(jìn)一步利用藥理學(xué)分析平臺(tái)（TCMSP）結(jié)合類(lèi)藥五原則和口服生物利用度篩選出牛大力精油活性成分，通過(guò)PharmMapper數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)活性成分的靶位點(diǎn)進(jìn)行匹配，篩選出關(guān)鍵靶位點(diǎn)，通過(guò)DAVID數(shù)據(jù)平臺(tái)對(duì)關(guān)鍵靶位點(diǎn)進(jìn)行KEGG（京都基因與基因組百科全書(shū)）通路富集分析，利用Cytoscape軟件構(gòu)建活性成分-靶點(diǎn)-KEGG通路網(wǎng)絡(luò)。共測(cè)得牛大力精油化學(xué)成分65種，包括醛類(lèi)、醇類(lèi)、酸類(lèi)、烴類(lèi)、酮類(lèi)和酯類(lèi)等化合物，篩選出13種活性成分，主要作用于16個(gè)靶位點(diǎn)上，通過(guò)KEGG分析得到6條通路。牛大力精油中的活性成分鄰苯二甲酸二丁酯、水楊酸甲酯等有可能作用于GSK3B、PPP1CC等基因編碼的靶位點(diǎn)上，參與調(diào)控胰島素、多巴胺受體、蛋白聚糖等信號(hào)通路，從而對(duì)糖尿病、神經(jīng)系統(tǒng)、腫瘤和癌癥等進(jìn)行調(diào)控。

關(guān)鍵詞：牛大力;精油成分;網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué);作用機(jī)制;活性成分;靶位點(diǎn);信號(hào)通路

中圖分類(lèi)號(hào)： R284.1 ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A ?文章編號(hào)：1002-1302（2020）10-0217-07

收稿日期：2019-05-16

基金項(xiàng)目：福建省科技重大專(zhuān)項(xiàng)（編號(hào)：2018NZ0003-2）。

作者簡(jiǎn)介：李程勛（1991—），男，福建南安人，碩士，研究實(shí)習(xí)員，主要從事作物品質(zhì)育種與天然產(chǎn)物提取研究。E-mail：1219513539@qq.com。

通信作者：李?lèi)?ài)萍，研究員，主要從事作物遺傳品質(zhì)育種及農(nóng)產(chǎn)品天然產(chǎn)物提取研究，E-mail：apl909@163.com;鄭開(kāi)斌，博士，研究員，主要從事作物遺傳品質(zhì)育種及農(nóng)產(chǎn)品天然產(chǎn)物提取研究，E-mail：k03163@163.com。

牛大力是豆科崖豆藤屬植物美麗崖豆藤的根，別稱(chēng)大力薯、倒吊金鐘、金鐘根、山蓮藕等。常被用于中藥中，藥用價(jià)值較大，有補(bǔ)虛潤(rùn)肺、強(qiáng)筋活絡(luò)之效，能夠治療肺熱、肺虛、肺結(jié)核、慢性肝炎、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等疾病[1]。傳統(tǒng)中對(duì)于牛大力的應(yīng)用多是基于其含有豐富的蛋白質(zhì)、淀粉、生物堿、多種黃酮類(lèi)化合物等，而對(duì)于牛大力揮發(fā)性成分的研究和應(yīng)用幾乎沒(méi)有，明確牛大力精油的成分組成及其作用機(jī)制對(duì)于牛大力精油的利用具有重要指導(dǎo)意義，同時(shí)也可為其他中藥精油的開(kāi)發(fā)和利用提供參考。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外對(duì)植物精油的研究十分活躍，植物精油中含有豐富的芳香族、脂肪族等活性物質(zhì)，具有抗氧化、抑菌、抗腫瘤等多種功效，已從肉桂[2]、佛手[3]、姜黃[4]、金銀花[5]、月桂、茴香、香菜[6]等大量植物中研制出了相應(yīng)的精油。陳建煙等對(duì)植物精油的抗菌、抗癌、抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)等多種生物活性的作用機(jī)理進(jìn)行了綜述[7];朱麗云等綜述了抗癌活性植物精油的主要活性成分及其作用機(jī)制[8]。國(guó)內(nèi)外關(guān)于牛大力的研究主要集中在牛大力的栽培管理、藥理作用、化學(xué)成分分析和功效成分分離鑒定上，其中，鄭海等在廣東省開(kāi)展了牛大力優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)種植技術(shù)研究[9];陳晨等通過(guò)高效液相色譜（HPLC）、ICP-MES等方法測(cè)定了海南牛大力中維生素、氨基酸和礦質(zhì)元素等營(yíng)養(yǎng)成分[10];宗鑫凱等通過(guò)柱層析方法從牛大力95%乙醇提取物中分離得到異甘草素、高麗槐素、紫檀素、美迪紫檀素、高紫檀素[11];Zhao等通過(guò)單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面法優(yōu)化了牛大力總黃酮的提取方法，并證明了牛大力提取物具有較強(qiáng)的抗氧化活性[12];Yin等從牛大力中分離出了一種新的黃酮醇苷[13];齊耀群等研究表明，牛大力多糖通過(guò)促進(jìn)IκB-α蛋白和抑制NF-κB p65蛋白的表達(dá)，降低了炎癥因子IL-1、IL-6、TNF-α的釋放，從而起到抗炎作用[14]。目前，對(duì)于牛大力精油成分和功效作用方面的研究幾乎沒(méi)有，在一定程度上限制了牛大力精油的開(kāi)發(fā)利用。本研究采用氣相色譜-質(zhì)譜（GC-MS）法對(duì)回流提取得到的牛大力精油成分進(jìn)行鑒定分析，并利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法預(yù)測(cè)分析牛大力精油成分的功效作用及作用機(jī)制，以期為牛大力精油的開(kāi)發(fā)應(yīng)用提供研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與儀器

試驗(yàn)材料為牛大力根切片，取自廣西中醫(yī)藥大學(xué)。

試驗(yàn)儀器為GCMS-TQ8040氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀（日本島津公司）;手動(dòng)固相微萃取（SPME）迸樣器、固相微萃取頭[50/30 μm二乙烯基苯/Carboxen/聚二甲基硅氧烷（DVB/CAR/PDMS），美國(guó)色譜科公司];頂空萃取瓶（20 mL，美國(guó)安捷倫科技公司）;精油回流提取器（25 L）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 牛大力精油提取 將牛大力根切片置于揮發(fā)油提取罐中，按料液比1 g ∶ 10 mL加入蒸餾水，回流提取4 h，待油水分離器中油和水分離完全后，將牛大力精油分離出來(lái)。

1.2.2 SPME萃取和GC-MS分析方法 第1步，將固相萃取頭置于丙酮中浸泡30 min;第2步，將固相萃取頭接在氣相色譜儀進(jìn)樣口處老化30 min（老化溫度為250 ℃）;第3步，移取5 mL牛大力揮發(fā)油置于20 mL頂空萃取瓶中，插入老化好的固相萃取頭吸附30 min（吸附溫度為60 ℃）;第4步，將吸附完成后的固相萃取頭插入氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀進(jìn)樣口中解吸附3 min（250 ℃），并進(jìn)行數(shù)據(jù)采集。GC條件：Rxi-5Sil MS色譜柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）;程序升溫：柱溫50 ℃維持2 min后，以 5 ℃/min 的速度升溫至180 ℃，再以20 ℃/min的速度升溫至 280 ℃，維持2 min;載氣為純氦氣，流量為1 mL/min，分流比為10 ∶ 1;進(jìn)樣量為1 μL。質(zhì)譜條件：電子轟擊電離（EI）源（電子能量為 70 eV），接口溫度為280 ℃，離子源溫度200 ℃，質(zhì)譜掃描范圍為35～550 aum[15]。

1.2.3 數(shù)據(jù)處理和分析 揮發(fā)油各成分經(jīng)過(guò)氣相色譜-質(zhì)譜分離，通過(guò)計(jì)算機(jī)譜庫(kù)（NIST/WILEY）檢索和分析后，再進(jìn)行人工譜圖分析，最終確定揮發(fā)油中各個(gè)化學(xué)成分，采用峰面積歸一化法得到各成分的相對(duì)含量。

1.2.4 牛大力精油活性成分篩選 結(jié)合中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái)（TCMSP），通過(guò)類(lèi)藥五原則（化合物成藥的必需條件）和口服生物利用度（OB>30%），篩選出牛大力精油中的活性成分。類(lèi)藥五原則具體內(nèi)容為（1）相對(duì)分子質(zhì)量<500;（2）氫鍵供體數(shù)目<5個(gè);（3）氫鍵受體數(shù)目<10個(gè);（4）油水分配系數(shù)<5;（5）可旋轉(zhuǎn)鍵的數(shù)量不超過(guò)10個(gè)。符合類(lèi)藥五原則的化合物成分會(huì)有更好的藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)，在生物體內(nèi)的代謝過(guò)程中有更好的生物利用度，更有可能成為口服藥物[16]。

1.2.5 牛大力精油活性成分作用靶點(diǎn)的預(yù)測(cè)與篩選 通過(guò)PubChem平臺(tái)查找牛大力精油活性成分的三維化合物結(jié)構(gòu)圖，保存為“sdf”格式。將活性成分三維化合物結(jié)構(gòu)圖以“sdf”格式輸入PharmMapper數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行靶點(diǎn)匹配預(yù)測(cè)（將靶點(diǎn)集設(shè)置為僅人類(lèi)蛋白質(zhì)靶點(diǎn)），將預(yù)測(cè)結(jié)果導(dǎo)出，并按對(duì)接得分Z值進(jìn)行排序，每個(gè)成分選取前30個(gè)靶點(diǎn)用于后續(xù)研究[17-19]。

1.2.6 牛大力精油活性成分-預(yù)測(cè)靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將牛大力精油活性成分和預(yù)測(cè)靶點(diǎn)信息導(dǎo)入Cytoscape 3.6.1軟件中，構(gòu)建活性成分-預(yù)測(cè)靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)，以探究牛大力精油的藥理學(xué)作用機(jī)制。Cytoscape 3.6.1是一個(gè)可以將互作網(wǎng)絡(luò)可視化的軟件，主要包括節(jié)點(diǎn)和連接，每個(gè)節(jié)點(diǎn)可以是分子、蛋白質(zhì)或基因等，節(jié)點(diǎn)和節(jié)點(diǎn)之間的連接代表這些分子之間的相互作用。每一個(gè)節(jié)點(diǎn)都有一個(gè)度值，度值代表著節(jié)點(diǎn)與節(jié)點(diǎn)相連的數(shù)目，度值越大，則這個(gè)節(jié)點(diǎn)在網(wǎng)絡(luò)中的作用越大，如果該節(jié)點(diǎn)是靶點(diǎn)，則該靶點(diǎn)極有可能是化合物的關(guān)鍵靶點(diǎn)[20]。

1.2.7 KEGG通路富集分析 將活性成分-預(yù)測(cè)靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)中節(jié)點(diǎn)度值大于等于5的靶點(diǎn)蛋白利用DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行KEGG（京都基因與基因組百科全書(shū)）生物通路富集分析，篩選出P≤0.05的通路，利用Cytoscape軟件構(gòu)建活性成分-靶點(diǎn)-KEGG通路網(wǎng)絡(luò)[16]。

2 結(jié)果與分析

2.1 牛大力精油化學(xué)成分分析

通過(guò)GC-MS方法共檢測(cè)出牛大力精油化學(xué)成分65種（表1），對(duì)其成分進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，結(jié)果見(jiàn)圖1。

由表1、圖1可知，共測(cè)得化學(xué)成分65種，其中醛類(lèi)化合物有13種，相對(duì)含量最高，達(dá)44.11%;醇類(lèi)化合物次之，有8種，相對(duì)含量為16.27%;酸類(lèi)化合物有3種，含量為14.73%;烴類(lèi)化合物有12種，含量為7.96%;酮類(lèi)化合物有15種，含量為 4.30%;酯類(lèi)化合物有8種，含量為2.74%。

2.2 牛大力精油活性成分篩選

采用類(lèi)藥五原則和口服生物利用度從牛大力精油中共篩選出13種活性成分，具體見(jiàn)表2。

結(jié)合表1、表2可知，13種活性成分相對(duì)含量總和為48.35%，其中醛類(lèi)相對(duì)含量最高，達(dá)到 27.20%，酸類(lèi)含量為13.64%，醇類(lèi)含量為5.19%，酮類(lèi)含量為1.34%，酯類(lèi)含量為0.98%。在牛大力精油成分中，活性成分相對(duì)含量占了接近50%。

2.3 牛大力精油活性成分-預(yù)測(cè)靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

通過(guò)PharmMapper數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)牛大力精油活性成分的靶點(diǎn)，采用Cytoscape 3.6.1軟件制作活性成分-預(yù)測(cè)靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖。由圖2可知，牛大力活性成分-預(yù)測(cè)靶點(diǎn)相互作用網(wǎng)絡(luò)共有177個(gè)節(jié)點(diǎn)， 包括13個(gè)化合物節(jié)點(diǎn)和164個(gè)靶點(diǎn)節(jié)點(diǎn)，在作用網(wǎng)絡(luò)中有16個(gè)靶點(diǎn)度值≥5，說(shuō)明這16個(gè)靶點(diǎn)能與5個(gè)及以上化合物發(fā)生相互作用，具體靶點(diǎn)信息見(jiàn)表3。

2.4 牛大力精油關(guān)鍵靶點(diǎn)KEGG信號(hào)通路富集分析及活性成分-靶基因-通路網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

通過(guò)DAVID數(shù)據(jù)平臺(tái)對(duì)牛大力精油關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG通路富集分析，以P≤0.05為條件篩選出6條信號(hào)通路（表4）。進(jìn)一步利用Cytoscape軟件構(gòu)建牛大力精油活性成分-靶基因-KEGG通路網(wǎng)絡(luò)（圖3）。

由圖3可以看出，牛大力精油通過(guò)13種活性成分作用于6個(gè)關(guān)鍵的靶位點(diǎn)上，調(diào)控著6條重要的信號(hào)通路。由表4可以看出，關(guān)鍵靶點(diǎn)主要涉及的通路有抗胰島素信號(hào)通路、胰島素信號(hào)通路、多巴胺受體信號(hào)通路、EB病毒感染信號(hào)通路、癌癥中蛋白聚糖的信號(hào)通路、細(xì)胞的焦點(diǎn)黏連信號(hào)通路。由涉及的通路可以看出，牛大力精油對(duì)于糖尿病、神經(jīng)系統(tǒng)調(diào)節(jié)、腫瘤、癌癥等具有一定的調(diào)控作用。

3 討論與結(jié)論

3.1 牛大力精油對(duì)糖尿病的作用機(jī)制預(yù)測(cè)

牛大力現(xiàn)已被廣泛應(yīng)用在預(yù)防和治療糖尿病的藥方中，賀勤杰將牛大力作為1種主要成分，結(jié)合丹參、天花粉等中藥在糖尿病治療中一起發(fā)揮作用[21];趙志祥等發(fā)現(xiàn)，由牛大力、當(dāng)歸、熟地黃等組成的脈復(fù)生合劑對(duì)于治療糖尿病足的臨床療效顯著[22]。袁永春等發(fā)明了一種由牛大力、千里光、苦地丁等組成的治療糖尿病足的護(hù)理液[23];李送南發(fā)明的牛大力枸杞茶也具有治療糖尿病的功能[24]。本研究預(yù)測(cè)牛大力精油中的鄰苯二甲酸二丁酯、水楊酸甲酯、己醛、4-庚酮、Z-2-庚烯醛、反式-3-辛烯-2-酮、壬酸、己酸、1-壬醇等成分可作用于由GSK3B、PTPN1、PPP1CC基因編碼的靶位點(diǎn)上，參與調(diào)控抗胰島素信號(hào)通路和胰島素信號(hào)通路，對(duì)胰島素合成起到雙向調(diào)控的功能，因此對(duì)糖尿病具有調(diào)控作用。

3.2 牛大力精油對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)調(diào)節(jié)機(jī)制預(yù)測(cè)

牛大力與其他藥物復(fù)配能夠治療坐骨神經(jīng)痛[25]、改善腓神經(jīng)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)傳導(dǎo)速度和感覺(jué)神經(jīng)傳導(dǎo)速度[22]、調(diào)節(jié)神經(jīng)系統(tǒng)[26]等。本研究預(yù)測(cè)牛大力精油中的鄰苯二甲酸二丁酯、水楊酸甲酯、己醛、4- 庚酮、壬酸、2-十一烯醛、薄荷醇、Z-2-庚烯醛、反式-3-辛烯-2-酮、1-壬醇等成分可作用于由MAPK14、GSK3B、PPP1CC基因編碼的靶位點(diǎn)上，參與調(diào)控多巴胺受體信號(hào)通路，具有通過(guò)神經(jīng)遞質(zhì)調(diào)控中樞神經(jīng)系統(tǒng)的生理功能。

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