張健 王沙沙 張文娥 潘學軍

摘要：為了探索不同形態(tài)的氮素及氮素的不同配比對泡核桃（Juglans sigillata Dode.）試管苗生根的影響，采用以DKW為基礎培養(yǎng)基配方，對大量元素中的銨態(tài)氮（NH+4-N）和硝態(tài)氮（NO-3-N）比例進行調整，研究氮素形態(tài)及配比對泡核桃生根率的影響。結果表明，DKW培養(yǎng)基中不添加銨態(tài)氮（NH+4-N ∶ NO-3-N為0 ∶ 5）可獲得較高的生根率（71.75%）和生根條數（2.67條），明顯高于對照（NH+4-N ∶ NO-3-N為1 ∶ 4），提高DKW基本培養(yǎng)基中銨態(tài)氮的含量可制約泡核桃組培苗的生長，最后使整棵小植株死亡;大量元素中的K、Mg及微量元素中的Mn、Cu、B對泡核桃試管苗的生根可能起到了重要作用;生根試管苗采用珍珠巖和營養(yǎng)土兩步煉苗，60 d后成活率達到92.00%。

關鍵詞：泡核桃;培養(yǎng)基調配;試管苗;生根

中圖分類號： S664.104+.3 ?文獻標志碼： A ?文章編號：1002-1302（2020）10-0176-06

收稿日期：2019-05-20

基金項目：貴州省科技重大專項子課題[編號：黔科合重大專項字（2011）6011]。

作者簡介：張 健（1994—），男，安徽臨泉人，碩士研究生，主要從事果樹種質資源與生物技術育種研究。E-mail：1047607911@qq.com。

通信作者：潘學軍，博士，教授，主要從事果樹種質資源與生物技術育種研究。E-mail：pxjun2050@aliyun.com。

植物組織培養(yǎng)技術作為工廠化育苗的重要手段，因其再生技術具有遺傳穩(wěn)定、繁殖系數高、繁殖率穩(wěn)定、條件可控等特點已得到廣泛應用，且發(fā)展前景廣闊[1]。然而，核桃屬（Juglans Linn.）植物是難生根的經濟林樹種，我國于20世紀80年代初就已開始對核桃試管苗微繁殖的研究，到90年代在生根方面已取得了一定進展[2-4]，但核桃組培苗的生根問題一直是制約其工廠化育苗的瓶頸。因此，如何提高核桃試管苗的生根率成為廣大學者研究的熱點，有研究表明，核桃樹體中的高含量酚類物質被氧化成核桃醌，是導致核桃屬植物難生根的主要因素[5-6]，所以，相比其他樹種，核桃試管苗的生根比較困難，且因根系發(fā)育不良導致吸收功能較弱，這些都限制了核桃試管苗的移栽成活率。運用植物生長調節(jié)劑和暗處理是誘導核桃根原基形成的重要措施[7-8]，但是生根效果因種或品種不同而差異顯著，因此探索新方法解決核桃試管苗生根問題和提高移栽成活率成為研究的關鍵。

氮素是植物體內核酸、蛋白質、維生素、酶以及生物堿等次生代謝產物的重要組分，是影響植物生長發(fā)育及產量和品質的重要因素，在植物生命活動過程中具有重要的生理調節(jié)功能。一般來說，植物對氮素的需求量高于其他各種元素，氮素的主要作用是促進植物營養(yǎng)生長，提高光合能力，保證其正常生長發(fā)育。與此同時，氮素也是植物生理代謝過程中起催化作用的主要物質。大多數的植物都是以土壤中的有機以及無機態(tài)的氮素作為氮源，只有部分植物是通過根瘤菌等固氮類的微生物固定大氣中的氮元素作為氮素的來源。銨態(tài)氮與硝態(tài)氮是植物吸收的主要氮素形態(tài)，一些可溶性的有機氮（如尿素、氨基酸等）也是植物可以吸收及利用的。而不同的氮素形態(tài)對植物的生長及代謝過程有顯著差異，進而會對植物產生不同的生理效應。

本試驗以我國核桃特有種（泡核桃）的試管苗為材料，從調配DKW基本培養(yǎng)基中的氮元素入手，嘗試推測泡核桃根系在發(fā)生發(fā)育過程中對不同氮素形態(tài)的喜好，以及對不同元素在其生根中可能起到的重要作用，為核桃屬植物及難生根木本植物的生根研究提供科學的理論和技術借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗在貴州省果樹工程技術研究中心進行。試材為在組織培養(yǎng)室內繼代增殖20 d的泡核桃試管苗。

1.2 試驗設計

以DKW培養(yǎng)基的配方為基礎，對大量元素中的銨態(tài)氮（NH+4-N）和硝態(tài)氮（NO-3-N）比例進行調整，設置處理1（100% NO3-N）、處理2（25% NH+4-N+75% NO3-N）、處理3（40% NH+4-N+60% NO3-N）、處理4（50% NH+4-N+50% NO3-N）、處理5（60% NH+4-N+40% NO3-N）、處理6（75% NH+4-N+25% NO3-N）、處理7（100% NH+4-N），即NH+4-N和NO-3-N的配比分別為 0 ∶ 5、1 ∶ 4、2 ∶ 3、1 ∶ 1、3 ∶ 2、4 ∶ 1和5 ∶ 0。這7個處理均按DKW基本培養(yǎng)基的配方分別加入微量元素、有機元素及鐵鹽。

1.3 試驗方法

1.3.1 DKW基本培養(yǎng)基中銨態(tài)氮和硝態(tài)氮配比對泡核桃嫩莖生根的影響 以DKW培養(yǎng)基的配方為基礎，對大量元素中的NH+4-N和NO-3-N比例進行調整，設置兩者的比例為0 ∶ 5、1 ∶ 4、2 ∶ 3、1 ∶ 1、3 ∶ 2、4 ∶ 1、5 ∶ 0，其微量元素、有機元素和鐵鹽保持不變。其中，1 ∶ 4的處理（即DKW培養(yǎng)基的原始配方）為對照。采用“兩步生根法”進行生根，第一步誘導培養(yǎng)基為7種不同配比的DKW培養(yǎng)基，并分別附加5.0 mg/L IBA，暗培養(yǎng)12 d轉入生根培養(yǎng)基;第二步生根培養(yǎng)基為不含生長調節(jié)劑的7種不同配比的DKW培養(yǎng)基，進行光培養(yǎng)20 d后統(tǒng)計生根率和生根條數。共7個處理，以上各處理均接種60瓶，每瓶2個外植體，每20瓶為1個重復，重復3次。

1.3.2 泡核桃生根苗與未生根苗的營養(yǎng)元素含量的測定 在獲得不同NH+4-N和NO-3-N配比（0 ∶ 5、1 ∶ 4、1 ∶ 1）的生根苗和未生根苗之后，以這3個處理的生根試管苗為材料，測定其全株的營養(yǎng)元素含量。其中，1 ∶ 4的處理為對照。在測定3個處理的生根苗和未生根苗中的營養(yǎng)元素含量時，首先將不同處理的生根苗和未生根苗從培養(yǎng)基中取出，分別小心地去掉根系和愈傷上的培養(yǎng)基，再按以下順序對樣品進行洗滌：自來水→0.1%中性洗滌劑溶液→2次自來水→3次蒸餾水→2次重蒸水，整個洗滌過程不超過2 min，然后將樣品置于105 ℃烘箱內殺青30 min，并在80 ℃條件下烘至恒質量，最后用塑料粉碎機將樣品粉碎，過65目尼龍篩后，裝入密封袋保存?zhèn)溆谩悠返臏y定方法如下：N含量用凱氏定氮法測定，P含量用釩鉬黃比色法測定，K含量用火焰光度計法測定;Ca、Mg、Fe、Zn、Cu、Mn含量用原子吸收分光光度計法測定，B含量用姜黃素比色法測定[9]。

1.3.3 泡核桃生根苗的煉苗移栽 選取根長2 cm以上，有2～3條根，苗高4～5 cm的生根試管苗，在強光（3 000 lx）下鍛煉7 d后，無菌條件下將生根苗從培養(yǎng)基中取出，用無菌水洗凈根部培養(yǎng)基，0.1% KMnO4浸根10 s，移栽至盛有滅菌珍珠巖的營養(yǎng)缽中，澆灌100 mL 1/8 DKW營養(yǎng)液（以后每隔7 d澆1次），加蓋與營養(yǎng)缽同樣大小的塑料杯（保持濕度）后，放入培養(yǎng)室中培養(yǎng)2～3 d后，澆灌4%的多菌靈（以后每隔7 d澆1次）。培養(yǎng)室溫度為（25±1） ℃，培養(yǎng)初期光照時間為12 h/d，15 d后增至 16 h/d。培養(yǎng)室煅煉30 d，地上部葉色加深后轉移到盛有營養(yǎng)土的營養(yǎng)缽中進行溫室鍛煉，生長30 d左右，移栽到大田定植。

1.4 培養(yǎng)條件

上述不同NH+4-N和NO-3-N配比的生根培養(yǎng)基中，1 L均添加20 g蔗糖和6 g瓊脂，pH值為5.8～6.2。培養(yǎng)溫度為（25±1） ℃，光周期為 16 h/d，光照度為40 μmol/（m2·s）。

1.5 數據統(tǒng)計分析

采用Excel軟件統(tǒng)計數據，并用DPS v7.05軟件進行數據處理和統(tǒng)計分析。

生根率=誘導生根莖段數/原接種莖段數×100%;

生根條數即每莖段平均生根數;

移栽成活率=移栽成活數/總移栽數×100%。

2 結果與分析

2.1 不同銨態(tài)氮和硝態(tài)氮配比對泡核桃嫩莖生根的影響

由表1可知，7種不同NH+4-N和NO-3-N配比對泡核桃嫩莖的生根率、生根條數和根系生長情況影響顯著。當配比為0 ∶ 5時，生根率和生根條數最高，分別為71.75%和2.67條，顯著高于其他處理，其根細長，葉綠色，生長正常;配比為1 ∶ 1時的生根率為57.50%，顯著高于配比為1 ∶ 4的（48.50%），而兩者的生根條數無差異，分別為1.67和1.25條，根粗壯;當配比為2 ∶ 3、3 ∶ 2、4 ∶ 1和 5 ∶ 0 時，嫩莖的生根率和生根條數均為0，且葉片干枯凋落，最后整株死亡，這是由于NH+4濃度高時出現(xiàn)了氨中毒現(xiàn)象。說明，NH+4-N和NO-3-N的適宜配比（0 ∶ 5）有利于泡核桃試管苗的生根，生根率明顯高于DKW原始配方（處理1 ∶ 4），而NH+4-N含量稍高即可制約泡核桃組培苗的生長，使整棵小植株死亡（圖1-A至圖1-E）。從配比為0 ∶ 5和 5 ∶ 0 的根生長情況可以看出培養(yǎng)基中N素的形態(tài)對根的誘導有明顯的影響。當配比為0 ∶ 5和1 ∶ 4時的根生長情況可以看出單一的N素不如2種混合使用的效果好。

2.2 不同銨態(tài)氮和硝態(tài)氮配比對試管苗大量元素含量的影響

由表2可見，NH+4-N和NO-3-N配比為0 ∶ 5時，泡核桃生根苗和未生根苗的N含量之間無顯著差異，P含量間有較小差異，達不到顯著水平，而K、Ca、Mg含量間存在顯著差異。其中，生根苗的K含量（4.53%）顯著高于未生根苗（4.35%），而Ca和Mg的含量（0.87%和0.09%）顯著低于未生根苗（0.96%和0.13%）。當NH+4-N和NO-3-N配比為1 ∶ 4和1 ∶ 1時，生根苗的N、P、Ca、Mg含量明顯低于未生根苗，而兩者的K含量之間無顯著差異。由于NH+4-N和NO-3-N配比為0 ∶ 5時獲得了泡核桃試管苗的高生根率（71.75%），而該配比的生根苗中的K含量最高，Mg含量最低，且差異顯著，因此，試驗初步認為大量元素K和Mg對泡核桃試管苗的生根起到了重要作用。

2.3 不同銨態(tài)氮和硝態(tài)氮配比對試管苗微量元素含量的影響

通常植物以NH+4-N為氮源時，有利于對陰離子的吸收，而以NO-3-N為氮源時，有利于對陽離子的吸收，這是由于植物吸收NH+4和NO-3后體內保持電荷平衡所決定的。由表3可見，NH+4-N和NO-3-N配比為0 ∶ 5時，泡核桃生根苗中的Fe、Mn、Cu、B含量顯著高于未生根苗，而兩者的Zn含量之間無差異;當配比為1 ∶ 4時，生根苗的Fe、Mn、Cu、B含量與未生根苗存在明顯差異，而Zn含量之間無差異。其中，生根苗的Mn含量（145.08 mg/kg）顯著高于未生根苗（127.48 mg/kg），而Cu、Fe、B含量明顯低于未生根苗;配比為1 ∶ 1時，生根苗和未生根苗的Fe、Mn、Zn、B含量之間差異顯著，而兩者的Cu含量之間無明顯差異。由于NH+4-N和NO-3-N配比為0 ∶ 5（生根率71.75%）的生根苗中的Mn、Cu、B含量較其他處理最高，且差異顯著，因此，試驗認為以NO-3-N為主要氮源時，泡核桃對以陽離子為主要吸收形態(tài)的Mn、Cu等元素的吸收積累量提高，說明微量元素Mn、Cu、B可能對泡核桃試管苗的生根起到了重要作用。

2.4 泡核桃試管苗的馴化移栽

參照潘學軍等的葡萄煉苗移栽方法[10]，溫室中珍珠巖煉苗30 d后，泡核桃生根苗的成活率為100%;轉入營養(yǎng)土煉苗30 d最后定植于大田，成活率為92.0%（圖1-G、1-H）。

3 討論與結論

植物組織培養(yǎng)中，培養(yǎng)基主要是提供植物組織生長和維持發(fā)育的養(yǎng)料，一般都含有碳水化合物、含氮物質、無機鹽（包括微量元素）以及維生素和水等。起初在培養(yǎng)基的使用方面，主要有Whites、Chengs、MS和B5等類型，這些培養(yǎng)基所含的營養(yǎng)成分及濃度不同，其中，MS培養(yǎng)基的主要特點是無機鹽濃度高，特別是硝酸鹽、鉀離子和銨離子含量豐富，元素平衡性好，緩沖性好，微量及有機成分含量齊全且較豐富，是目前使用最廣的培養(yǎng)基;Whites為低無機鹽含量培養(yǎng)基;B5為高硝酸鉀含量培養(yǎng)基[11]。總體上來說，培養(yǎng)基類型多種多樣，應用比較廣泛，但各種不同培養(yǎng)基都有自身的優(yōu)點和不足，沒有任何一種培養(yǎng)基能夠滿足所有植物的養(yǎng)分需求，因此，有些學者開展了培養(yǎng)基調配的研究，如Driver和Kuniyuki研制出了核桃的專用培養(yǎng)基（DKW培養(yǎng)基），并廣泛用于核桃屬植物的組織培養(yǎng)上[4]。DKW培養(yǎng)基主要用于木本植物的組培，用于不同培養(yǎng)目的（增殖或生根）時，只需將其中的生長調節(jié)劑水平或個別營養(yǎng)成分做適當調整，即可獲得令人滿意的結果，如袁巧平等又對DKW培養(yǎng)基中的一些營養(yǎng)成分作了適當調整并獲得了適宜于普通核桃生長的改良DKW培養(yǎng)基[12]，這個培養(yǎng)基也被許多學者采納并應用[13-14]。車代弟等以花粉萌發(fā)率和花粉管的長度作為求算培養(yǎng)基組分的衡量指標[15]，與花粉在活體中的生長情形相近，優(yōu)化獲得的培養(yǎng)基配方效果較好，這對于研究者有針對性地解決植物組培工作中的某個難點有一定啟發(fā)。

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