劉玲 唐仕成 鄭丹 柯皓天 呂銀

摘要：采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)L16（45）對(duì)桑樹(shù)ISSR-PCR反應(yīng)體系中的模板DNA、引物、Mg2+、dNTPs和rTaq酶5個(gè)因素及反應(yīng)程序中變性時(shí)間、退火時(shí)間、延伸時(shí)間和循環(huán)數(shù)進(jìn)行優(yōu)化分析。結(jié)果表明，各因素水平變化對(duì)反應(yīng)體系的影響大小依次為DNA模板>rTaq酶>Mg2+>引物>dNTPs。最終確立了最佳反應(yīng)體系，即在10 μL反應(yīng)體系中，含25 ng/μL DNA模板1 μL、10×PCR buffer 1 μL、20 μmol/L引物0.2 μL、2.5 mmol/L Mg2+ 0.8 μL、2.5 mmol/L dNTPs 1 μL、5 U/μL rTaq 0.1 μL。優(yōu)化得到的反應(yīng)程序?yàn)?4 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性40 s，合適的退火溫度退火45 s，72 ℃ 延伸90 s，40個(gè)循環(huán);72 ℃延伸10 min，16 ℃保存。通過(guò)梯度PCR，確定引物ID37的退火溫度為49.5 ℃。穩(wěn)定性檢測(cè)表明該體系能用于桑樹(shù)ISSR分析。

關(guān)鍵詞：桑樹(shù);正交試驗(yàn)設(shè)計(jì);ISSR-PCR;反應(yīng)體系優(yōu)化

中圖分類(lèi)號(hào)：S888.2 ??文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A ?文章編號(hào)：1002-1302（2020）10-0080-05

收稿日期：2019-05-15

基金項(xiàng)目：四川省科技計(jì)劃（編號(hào)：2019YJ0291）。

作者簡(jiǎn)介：劉 玲（1989—），女，山西大同人，碩士，工程師，主要從事桑樹(shù)分子標(biāo)記工作。E-mail：liuling1022@yeah.net。

桑樹(shù)是?？疲∕oraceae）桑屬（Morus L.）多年生木本植物，是重要的經(jīng)濟(jì)植物，桑葉是家蠶的主要飼料。我國(guó)地域遼闊，生態(tài)環(huán)境各異，經(jīng)長(zhǎng)期的自然選擇和人工選育，形成了非常豐富的桑樹(shù)種質(zhì)資源。研究桑樹(shù)的遺傳多樣性及其親緣關(guān)系對(duì)桑樹(shù)的栽培育種、良種選育等有重要意義。

簡(jiǎn)單重復(fù)序列間擴(kuò)增（inter-simple sequence repeat，簡(jiǎn)稱ISSR）標(biāo)記是一種基于微衛(wèi)星序列發(fā)展起來(lái)的分子標(biāo)記，以PCR技術(shù)為基礎(chǔ)，利用真核生物基因組中廣泛存在的微衛(wèi)星序列設(shè)計(jì)引物，對(duì)2個(gè)距離較近、方向相反的SSR序列之間的基因組片段進(jìn)行擴(kuò)增。ISSR分子標(biāo)記技術(shù)結(jié)合了RAPD和SSR分子標(biāo)記的優(yōu)點(diǎn)，穩(wěn)定性和重復(fù)性好，多態(tài)性高。國(guó)內(nèi)外眾多研究者已將ISSR分子標(biāo)記技術(shù)應(yīng)用于桑樹(shù)種質(zhì)資源的遺傳多樣性研究等方面[1]。

本研究參考以往桑樹(shù)ISSR研究，采用正交設(shè)計(jì)和極差分析結(jié)合的方法，對(duì)桑樹(shù)ISSR-PCR反應(yīng)體系中的5個(gè)因素：模板DNA、引物、Mg2+、dNTPs和rTaq酶，進(jìn)行4個(gè)水平優(yōu)化，并對(duì)反應(yīng)程序中的變性時(shí)間、退火時(shí)間、延伸時(shí)間和循環(huán)次數(shù)進(jìn)行正交設(shè)計(jì)優(yōu)化，以期建立適合于桑樹(shù)ISSR分析的PCR反應(yīng)體系，為ISSR分子標(biāo)記在桑樹(shù)上更廣泛地應(yīng)用提供試驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)材料采自四川省絲綢科學(xué)研究院桑樹(shù)種質(zhì)資源圃。選擇品種資源“團(tuán)桑10號(hào)”作為PCR反應(yīng)體系、反應(yīng)程序和引物退火溫度優(yōu)化的模板。

擴(kuò)增引物參考由加拿大英屬哥倫比亞大學(xué)UBC公司2006年公布的ISSR引物序列和已有的ISSR分子標(biāo)記在桑樹(shù)方面的應(yīng)用研究結(jié)果[2]，由上海生工生物工程股份有限公司合成。經(jīng)初步試驗(yàn)，選擇擴(kuò)增片段清晰的引物ID37（5′-GAGGAGGAGGAGGC-3′）作為建立反應(yīng)體系的固定引物。PCR反應(yīng)所用的Mg2+、dNTPs、rTaq酶、DNA marker和10×buffer均購(gòu)自TaKaRa公司。

1.2 基因組DNA提取及質(zhì)量檢測(cè)

基因組DNA提取參照CTAB法，從約0.15 g硅膠干燥的嫩桑葉中提取。DNA質(zhì)量用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，濃度用微量紫外分光光度計(jì)檢測(cè)確認(rèn)。

1.3 ISSR-PCR反應(yīng)體系的建立及優(yōu)化

PCR反應(yīng)體系中的5個(gè)因素：模板DNA、引物、Mg2+、dNTPs和rTaq酶，每個(gè)因素分別設(shè)置4個(gè)水平（表1）。采用L16（45）正交設(shè)計(jì)（表2），共16組反應(yīng)體系。每組還含有1 μL 10×buffer。優(yōu)化模板為團(tuán)桑10號(hào)，引物為ID37，每個(gè)反應(yīng)體系設(shè)2次重復(fù)。

對(duì)正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行直觀分析和極差分析，確定2種方法各自的最佳反應(yīng)體系;若結(jié)果不同，則分別對(duì)這2種體系進(jìn)行PCR擴(kuò)增，根據(jù)電泳結(jié)果確定哪種反應(yīng)體系效果更好。

PCR反應(yīng)在Thermal Cycler（上海山富科學(xué)儀器有限公司）上進(jìn)行。初始反應(yīng)體系（總體積10 μL）：25 ng模板1 μL、10×buffer 1 μL、20 μmol/L引物0.1 μL、2.5 mmol/L Mg2+ 0.4 μL、2.5 mmol/L dNTPs 0.5 μL、5 U/μL rTaq 0.1 μL，加ddH2O至 10 μL。初始擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性60 s，50 ℃退火40 s，72 ℃延伸90 s，40個(gè)循環(huán);72 ℃延伸10 min，反應(yīng)結(jié)束控制在12 ℃。PCR反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖電泳檢測(cè)后，在紫外投射反射儀下觀察拍照保存。每個(gè)反應(yīng)重復(fù)2次。

1.4 ISSR-PCR反應(yīng)程序的正交試驗(yàn)

采用優(yōu)化好的反應(yīng)體系對(duì)PCR擴(kuò)增程序中的變性時(shí)間、退火時(shí)間、延伸時(shí)間和循環(huán)次數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，這4個(gè)因素水平設(shè)置見(jiàn)表3，擴(kuò)增程序的優(yōu)化采用L9（34）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)（表4），每個(gè)組合重復(fù)擴(kuò)增2次。產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，對(duì)結(jié)果進(jìn)行直觀分析，確定最終的PCR反應(yīng)程序。

1.5 引物退火溫度優(yōu)化

以確定的最佳反應(yīng)體系為基礎(chǔ)，以提取的“團(tuán)桑10號(hào)”DNA作為模板，對(duì)引物ID37的退火溫度進(jìn)行優(yōu)化篩選，退火溫度設(shè)定范圍為47～53 ℃，PCR儀自動(dòng)生成12個(gè)溫度。PCR擴(kuò)增后產(chǎn)物用 1.5% 的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，根據(jù)擴(kuò)增結(jié)果確定引物ID37（表5）的最佳退火溫度。

1.6 桑樹(shù)ISSR-PCR最佳反應(yīng)體系穩(wěn)定性驗(yàn)證

用8個(gè)桑樹(shù)材料：團(tuán)桑5號(hào)、江油12-3、江油19號(hào)、江油22號(hào)、江油24號(hào)、江油402、江油椹1號(hào)、白桑，用引物ID7（表5）對(duì)優(yōu)化出的反應(yīng)體系做穩(wěn)定性檢測(cè)，PCR產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 ISSR-PCR正交反應(yīng)體系的直觀分析

由圖1可知，除組合2和組合3外，其余各組擴(kuò)增條帶都存在條帶缺失和不清晰的情況。與第3組相比，組合2的擴(kuò)增條帶清晰度弱，因此，電泳結(jié)果認(rèn)為第3組合為最優(yōu)體系，即DNA模板第1水平、引物第3水平、Mg2+第3水平、dNTPs第3水平、rTaq酶第3水平，即10 μL反應(yīng)體系中含25 ng模板1 μL、10×PCR buffer 1 μL、20 μmol/L引物 0.2 μL、2.5 mmol/L Mg2+ 0.8 μL、2.5 mmol/L dNTPs 1 μL、5 U/μL rTaq 0.3 μL。

為了進(jìn)一步證明對(duì)試驗(yàn)結(jié)果初步判斷的準(zhǔn)確性，根據(jù)李志勇等對(duì)正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)中的各組分濃度組合進(jìn)行K值等分析[3]，分析結(jié)果見(jiàn)表6。K值代表某水平下某因子參與反應(yīng)所產(chǎn)生的擴(kuò)增條帶的總和;k代表某因子在某水平下參與反應(yīng)所產(chǎn)生的擴(kuò)增條帶的平均值;R為某因子的極差，即某因子在不同水平下最大平均值與最小平均值之差。

R值的大小反映了該因子對(duì)試驗(yàn)結(jié)果影響的大小，R值越大，影響越顯著。根據(jù)極差R分析可知，本研究中的5個(gè)因素在設(shè)定的4個(gè)水平內(nèi)對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響大小依次為DNA模板>rTaq酶>Mg2+>引物>dNTPs。

k值反映了影響因素各水平對(duì)反應(yīng)體系的影響情況，k值越大，反應(yīng)水平越好。模板DNA第1水平最好，引物第3、4水平最好，Mg2+第3水平最好，dNTPs第3水平最好，rTaq酶第1水平最好。即極差分析得到2種最佳反應(yīng)體系（引物量不同），分別命名為極差1和極差2，每個(gè)組合的組分用量如表7。

2.2 正交設(shè)計(jì)直觀分析和極差分析結(jié)果比較

對(duì)正交第3組、極差1和極差2的反應(yīng)體系作PCR擴(kuò)增并直觀比較。從圖2中可以看到，極差1和極差2的擴(kuò)增效果差不多，譜帶亮度強(qiáng)，多態(tài)性高且比較穩(wěn)定，都明顯好于正交第3組。反應(yīng)體系極差1與極差2相比，區(qū)別只是引物量少一些。從節(jié)約角度考慮，選擇極差1為最佳反應(yīng)體系，即10 μL反應(yīng)體系中含25 ng/μL模板1 μL、10×buffer 1 μL、20 μmol/L 引物0.2 μL、2.5 mmol/L Mg2+ 08 μL、2.5 mmol/L dNTPs 1 μL、5 U/μL rTaq 01 μL。

2.3 擴(kuò)增程序優(yōu)化

采用優(yōu)化好的反應(yīng)體系優(yōu)化桑樹(shù)ISSR-PCR擴(kuò)增程序，結(jié)果如圖3所示。從電泳結(jié)果來(lái)看，不同組合擴(kuò)增條帶的深淺、優(yōu)劣不同。第1、2、4、8、9組合條帶模糊，不好辨認(rèn);第3、5、6、7組合條帶相對(duì)清晰，其中第3組合條帶最好辨認(rèn)。因此，選擇第3組合為桑樹(shù)ISSR-PCR的擴(kuò)增程序，即94 ℃預(yù)變性 5 min;94 ℃變性40 s，49.5 ℃退火45 s，72 ℃延伸90 s，40個(gè)循環(huán);72 ℃延伸10 min，反應(yīng)結(jié)束后 16 ℃保存。

2.4 引物退火溫度篩選

由圖4可見(jiàn)，退火溫度對(duì)PCR擴(kuò)增結(jié)果影響明顯。當(dāng)溫度高于49.5 ℃時(shí)，擴(kuò)增條帶不清晰或者條帶不全;溫度低于49.5 ℃時(shí)，擴(kuò)增條帶清晰、完全;因此，選擇49.5 ℃為引物ID37的退火溫度。大多數(shù)ISSR引物適合較高的退火溫度，且能提高 ISSR-PCR反應(yīng)的特異性及精確度[4]，故在47.0～49.5 ℃范圍內(nèi)，選擇了略高的49.5 ℃來(lái)退火。

2.5 最佳反應(yīng)體系和程序穩(wěn)定性檢測(cè)

采用優(yōu)化得到的ISSR-PCR反應(yīng)體系，用引物ID7對(duì)8個(gè)桑樹(shù)基因組DNA樣品進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，以檢測(cè)優(yōu)化得到的最佳反應(yīng)體系和反應(yīng)程序的穩(wěn)定性，檢測(cè)結(jié)果如圖5所示。

由圖5可見(jiàn)，引物ID7從8份種質(zhì)材料中擴(kuò)增的條帶清晰、穩(wěn)定、多態(tài)性高。表明，經(jīng)過(guò)優(yōu)化后建立的ISSR-PCR反應(yīng)體系及程序具有較好的穩(wěn)定性。

3 討論與結(jié)論

本研究通過(guò)直觀分析和正交極差分析對(duì)比篩選出的最佳體系，結(jié)果表明，正交極差分析得到的2組反應(yīng)體系效果都好于直觀分析效果。直觀分析帶有一定的主觀性，極差分析是通過(guò)計(jì)算將結(jié)果轉(zhuǎn)換成數(shù)字，能更好地對(duì)比出各個(gè)因素間的相互作用[5]。

本研究?jī)?yōu)化得到的桑樹(shù)ISSR-PCR反應(yīng)體系為10 μL反應(yīng)體系中含25 ng模板1 μL、10×PCR buffer 1 μL、20 μmol/L引物0.2 μL、2.5 mmol/L Mg2+ 0.8 μL、2.5 mmol/L dNTPs 1 μL、5 U/μL rTaq 0.1 μL。5個(gè)因素在設(shè)定的4個(gè)水平內(nèi)對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響大小依次為DNA模板>rTaq酶>Mg2+>引物>dNTPs。

桑樹(shù)ISSR-PCR反應(yīng)體系僅見(jiàn)思彬彬等在2012年采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)和單因素設(shè)計(jì)結(jié)合的方法優(yōu)化過(guò)[6]，得到的優(yōu)化體系為25 μL中10×PCR buffer 2.5 μL、dNTPs 0.35 mmol/L、Mg2+ 2.5 mmol/L、rTaq 0.05 U/μL、引物0.4 μmol/L、DNA 4 ng/μL。本研究與之相比，5個(gè)因素的濃度只有rTaq和引物相同，可能是由于試驗(yàn)材料、引物、濃度梯度設(shè)置和技術(shù)要求不同造成的。

同時(shí)，本研究還采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化了桑樹(shù)ISSR-PCR反應(yīng)程序中的變性時(shí)間、退火時(shí)間、延伸時(shí)間和循環(huán)數(shù)，通過(guò)電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物，得到最適桑樹(shù)ISSR-PCR反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃ 變性40 s，49.5 ℃退火45 s，72 ℃延伸90 s，40個(gè)循環(huán); 72 ℃延伸10 min， 反應(yīng)結(jié)束后16 ℃保

存。穩(wěn)定性檢驗(yàn)結(jié)果表明，得到的反應(yīng)體系和程序能夠擴(kuò)增出清晰的條帶。

本研究得到的反應(yīng)體系和程序可用于桑樹(shù)ISSR分析，為桑樹(shù)系統(tǒng)學(xué)和種質(zhì)資源鑒定及遺傳多樣性的研究奠定基礎(chǔ)。

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